一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法

技术领域

本发明涉及海水中污染物检测技术领域，尤其涉及一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法。

背景技术

现代养殖业日益趋向于规模化、集约化，使用抗生素、维生素、激素、金属微量元素等成为保障海水养殖业发展必不可少的一环。然而不幸的是，由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，在养殖中滥用药物的现象普遍存在。滥用兽药的直接后果是导致兽药在动物性食品中的残留，摄入人体后，影响人类的健康。动物性食品中的兽药残留对人的潜在危害愈来愈引起人们的重视。只有建立起一套简便高效的药物残留测定方法，是有效地控制药物残留发生的基础。

喹烯酮(Quinocetone)是中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制的喹噁啉类促生长调节剂，是农业部2003年8月正式批准的国家农业兽类新药。该药具有抑菌效果明显、使用安全、代谢迅速特点，既适用畜禽及水产生物，也适用于幼畜、幼禽的防病和促生长。由于其可以提高饲料转化率，对多种肠道致病菌(特别是革兰氏阴性菌)有抑制作用，能明显降低畜禽腹泻发生率。与卡巴氧、喹乙醇等已明令禁用的喹噁啉类药物相比，喹烯酮药效高，毒性低、使用相对安全，在家禽、家畜和水产动物的养殖中已得到使用。

喹烯酮属于新型喹噁啉类药物，具有广谱抗菌和促生长双重作用。喹乙醇因具有明显的毒副作用，欧盟于1998年禁止喹乙醇的使用，我国也将喹乙醇禁用于禽和水产动物，仅能用于育成猪的抗菌治疗。由于喹乙醇在动物体内代谢迅速，而其代谢产物3-甲基喹噁啉-2-羧酸(以下简称MQCA)消除缓慢、残留时间长。目前各国通常将MQCA作为喹乙醇残留分析和监控的目标物。欧盟、美国及我国均以MQCA为喹乙醇的标识残留物，并规定水产品中不得检出。

喹烯酮等新型喹噁啉类药物，保留了该类药物的抗菌促生长作用，降低了毒性，目前在畜禽及水产养殖中应用较多。许多研究表明，其在水产动物体内代谢产生MQCA及脱二氧代谢产物。目前关于MQCA检测的相关标准，“农业部781号公告-3-2006动物源食品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸残留量的测定高效液相色谱法”、“农业部1077号公告-5-2008水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定高效液相色谱法”均以高效液相色谱法测定样品中MQCA残留量，但是检测灵敏度低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法，本发明提供的测定方法能够准确测定海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法，包括以下步骤：

将待测海水过MAX柱，得到吸附柱；采用水对所述吸附柱进行淋洗后，将所得淋洗后的吸附柱采用甲酸的乙酸乙酯溶液洗脱，得到的洗脱液作为待测液；所述甲酸的乙酸乙酯溶液中甲酸的体积分数为2％；

采用液质联用法对所述待测液进行检测，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积；

基于脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-峰面积标准曲线，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量；

所述液质联用法的参数包括液相色谱参数和质谱参数；

所述液相色谱参数包括：

色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，粒径1.7μm；

色谱柱温度：40℃；

流动相A：乙腈；

流动相B：体积浓度为0.5％甲酸水溶液；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

梯度洗脱程序为：

0.00min：5％A+95％B；

0.25min：5％A+95％B；

7.75min：95％A+5％B；

8.50min：95％A+5％B；

8.51min：5％A+95％B；

10.00min：5％A+95％B；

质谱参数包括：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

离子源温度：110℃；

离子传输管温度：350℃；

锥孔反吹气流速：50L/h；

辅助气流量：3L/min；

喷雾电压：2500V；

被测物母离子、子离子和碰撞能量包括：

3-甲基喹噁啉-2-羧酸：母离子m/z：189；子离子m/z：145，143；碰撞能量14ev，17ev；

脱二氧喹烯酮：母离子m/z：275；子离子m/z：143，247；碰撞能量40ev，33ev。

优选地，所述待测海水过MAX柱的流速为10～20滴/min。

优选地，所述甲酸的乙酸乙酯溶液的体积与MAX柱的容积的比值为1：1～1：2。

优选地，所述洗脱液在进行检测前，依次进行氮气吹干和定容；所述氮气吹干的温度为45℃。

优选地，所述定容的试剂为体积浓度为0.1％的甲酸的乙腈-水溶液；所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为70：30。

本发明提供了一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法，包括以下步骤：将待测海水过MAX柱，得到吸附柱；采用水对所述吸附柱进行淋洗；将所得淋洗后的吸附柱采用甲酸的乙酸乙酯溶液洗脱，得到的洗脱液作为待测液；所述甲酸的乙酸乙酯溶液中甲酸的体积分数为2％；采用液质联用法对所述待测液进行检测，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积；基于脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-标准曲线，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量；所述液质联用法的参数包括液相色谱参数和质谱参数；所述液相色谱参数包括：色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，粒径1.7μm；色谱柱温度：40℃；流动相A：乙腈；流动相B：体积浓度为0.5％甲酸水溶液；流速：0.25mL/min；进样量：10μL；梯度洗脱程序为：0.00min：5％A+95％B；0.25min：5％A+95％B；7.75min：95％A+5％B；8.50min：95％A+5％B；8.51min：5％A+95％B；10.00min：5％A+95％B；质谱参数包括：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；离子源温度：110℃；离子传输管温度：350℃；锥孔反吹气流速：50L/h；辅助气流量：3L/min；喷雾电压：2500V；被测物母离子、子离子和碰撞能量包括：3-甲基喹噁啉-2-羧酸：母离子m/z：189，子离子m/z：145，143，碰撞能量14ev，17ev；脱二氧喹烯酮：母离子m/z：275，子离子m/z：143，247，碰撞能量40ev，33ev。

本发明采用MAX柱对海水中的脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸进行富集和纯化，能够实现对海水中低浓度脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定；本发明先用水淋洗吸附柱，将水溶性杂质大部分去除，再采用甲酸的乙酸乙酯溶液对水淋洗后的吸附柱进行洗脱，能够减少待测液中其他物质的含量，避免对脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检测干扰，提高检测灵敏度。实施例的数据表明：本发明提供的测定方法对脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检出限为5ng/L；对脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的定量限为10ng/L。

附图说明

图1为3-甲基喹噁啉-2-羧酸和脱二氧喹烯酮的浓度均为10.0ng/mL的标准混合溶液的选择离子流图；

图2为空白海水选择离子流图；

图3为空白海水分别添加浓度为200.0ng/L的3-甲基喹噁啉-2-羧酸和脱二氧喹烯酮后的选择离子流图谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法，包括以下步骤：

将待测海水过MAX柱，得到吸附柱；采用水对所述吸附柱进行淋洗，将所得淋洗后的吸附柱采用甲酸的乙酸乙酯溶液洗脱，得到的洗脱液作为待测液；所述甲酸的乙酸乙酯溶液中甲酸的体积分数为2％；

采用液质联用法对所述待测液进行检测，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积；

基于脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-标准曲线，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量。

本发明将待测海水过MAX柱，得到吸附柱；采用水对所述吸附柱进行洗脱，得到的洗脱液作为待测液。在本发明中，所述待测海水过MAX柱的流速优选为10～20滴/min。在本发明中，所述MAX柱的柱容积优选为3mL或6mL。本发明将待测海水中的脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸通过吸附富集在所述MAX柱上。

得到吸附柱后，本发明采用水对所述吸附柱进行淋洗，得到的洗脱液作为待测液。在本发明中，所述水的体积与所述MAX柱的容积的比值优选为1：2。在本发明中，采用水对吸附柱进行淋洗，能够将吸附柱上的水溶性物质洗脱下来，避免对脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检测干扰，提高灵敏度。

淋洗结束后，本发明将所得离心后的吸附柱采用甲酸的乙酸乙酯溶液洗脱，得到的洗脱液作为待测液。在本发明中，所述甲酸的乙酸乙酯溶液中甲酸的体积分数为2％；所述甲酸的乙酸乙酯溶液的体积与MAX柱容积的比例优选为1：1～1：2。在本发明中，所述洗脱液在进行检测前，优选依次进行氮气吹干和定容；所述氮气吹干的温度优选为45℃；所述定容的试剂优选为体积浓度为0.1％的甲酸的乙腈-水溶液；乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比优选为70：30。

在本发明中，采用体积分数为2％的甲酸的乙酸乙酯溶液对淋洗后的吸附柱进行洗脱，能够将脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸洗脱下来；通过控制甲酸的乙酸乙酯溶液和MAX柱容积的比值为1：1～1：2，既能保证脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸全部洗脱下来，也能够保证不洗脱下来过多的干扰物质，提高检测灵敏度。

得到待测液后，本发明采用液质联用法对所述待测液进行检测，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积。

在本发明中，所述液质联用法的参数包括液相色谱参数和质谱参数；

所述液相色谱参数包括：

色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，粒径1.7μm；

色谱柱温度：40℃；

流动相A：乙腈；

流动相B：体积浓度为0.5％甲酸水溶液；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

梯度洗脱程序为：

0.00min：5％A+95％B；

0.25min：5％A+95％B；

7.75min：95％A+5％B；

8.50min：95％A+5％B；

8.51min：5％A+95％B；

10.00min：5％A+95％B；

质谱参数包括：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

离子源温度：110℃；

离子传输管温度：350℃；

锥孔反吹气流速：50L/h；

辅助气流量：3L/min；

喷雾电压：2500V；

被测物母离子、子离子和碰撞能量包括：

3-甲基喹噁啉-2-羧酸：母离子m/z：189，子离子m/z：145，143，碰撞能量14ev，17ev；

脱二氧喹烯酮：母离子m/z：275，子离子m/z：143，247，碰撞能量40ev，33ev。

得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积后，本发明基于脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-标准曲线，得到待测水体中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量。

本发明对所述脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-标准曲线的获取方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的标准曲线获取方式即可。

下面结合实施例对本发明提供的海水中脱二氧喹烯酮及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的测定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所采用的液质联用法的参数包括：

所述液相色谱参数包括：

色谱柱：C18柱，2.1mm×100mm，粒径1.7μm；

色谱柱温度：40℃；

流动相A：乙腈；

流动相B：体积浓度为0.5％甲酸水溶液；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

梯度洗脱程序为：

0.00min：5％A+95％B；

0.25min：5％A+95％B；

7.75min：95％A+5％B；

8.50min：95％A+5％B；

8.51min：5％A+95％B；

10.00min：5％A+95％B；

质谱参数包括：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

离子源温度：110℃；

离子传输管温度：350℃；

锥孔反吹气流速：50L/h；

辅助气流量：3L/min；

喷雾电压：2500V；

被测物母离子、子离子和碰撞能量包括：

3-甲基喹噁啉-2-羧酸：母离子m/z：189；子离子m/z：145，143；碰撞能量14ev，17ev；

脱二氧喹烯酮：母离子m/z：275；子离子m/z：143，247；碰撞能量40ev，33ev。

实施例1

标准曲线的获取：

将脱二氧喹烯酮溶于乙腈中，配制成浓度为100μg/mL的脱二氧喹烯酮储备液；

将3-甲基喹噁啉-2-羧酸溶于乙腈中，配制成浓度为100μg/mL的3-甲基喹噁啉-2-羧酸储备液；

取1.0mL脱二氧喹烯酮储备液和1.0mL 3-甲基喹噁啉-2-羧酸储备液置于100mL的容量瓶中，乙腈定容，得到脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸混合标准储备液1.0μg/mL；

分别取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的浓度为1.0μg/mL脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸混合标准储备液分别稀释100、50、20、10和5倍，得到脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的系列标准混合液；

采用上述液质联用法对所得系列标准混合液进行检测，得到所述脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的峰面积；

基于所述脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的浓度和对应的峰面积，建立脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线、3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-峰面积标准曲线。

具体地，脱二氧喹烯酮浓度-峰面积标准曲线为：y＝3058*x+2057.98，相关系数R

3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度-峰面积标准曲线为：y＝2109*x+1403.52，相关系数R

实施例2

检出限和定量限

按照脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的3倍信噪比，确定其上机浓度检出限，进而换算成海水中脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检出限浓度。结果为：脱二氧喹烯酮的检出限为5ng/L，3-甲基喹噁啉-2-羧酸的检出限为5ng/L。

按照脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的10倍信噪比，确定其上机浓度定量限，进而换算成海水中脱二氧喹烯酮和3-甲基喹噁啉-2-羧酸的定量限浓度。结果为：脱二氧喹烯酮的定量限为10ng/L；3-甲基喹噁啉-2-羧酸的定量限为10ng/L。

实施例3

方法的回收率和精密度

向空白海水样品中添加标准溶液，制成3组不同浓度的标准添加样品，每个浓度样品平行测定6个，计算方法回收率和精密度，结果如表1和2所示。

表1 3-甲基喹噁啉-2-羧酸的回收率及精密度试验结果

从表1可以看出：3-甲基喹噁啉-2-羧酸的添加量为10.0～200.0ng/L时，3-甲基喹噁啉-2-羧酸的回收率在72.3～91.8％之间；批内相对标准偏差均小于8％，批间相对偏差小于6％。

表2脱二氧喹烯酮的回收率及精密度试验结果

从表2可以看出：脱二氧喹烯酮回收率在70.2～90.1％之间；批内相对标准偏差均小于10％，批间相对偏差小于8％。

图1为3-甲基喹噁啉-2-羧酸和脱二氧喹烯酮的浓度均为10.0ng/mL的标准混合溶液的选择离子流图，其中：a图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞143的谱图，b图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞145的谱图，c图为脱二氧喹烯酮275＞143的谱图，d图为脱二氧喹烯酮275＞247的谱图；

图2为空白海水选择离子流图，其中，a图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞143的谱图，b图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞145的谱图，c图为脱二氧喹烯酮275＞143的谱图，d图为脱二氧喹烯酮275＞247的谱图；

图3为空白海水分别添加浓度为200.0ng/L的3-甲基喹噁啉-2-羧酸和脱二氧喹烯酮后的选择离子流图谱图，其中，a图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞143的谱图，b图为3-甲基喹噁啉-2-羧酸189＞145的谱图，c图为脱二氧喹烯酮275＞143的谱图，d图为脱二氧喹烯酮275＞247的谱图；

从图1、2和3可以看出，3-甲基喹噁啉-2-羧酸和脱二氧喹烯酮峰形尖锐，信噪比高，能够满足准确定量的要求。

实施例4

采用MAX固相萃取柱(混合阴离子交换柱，柱容积为6mL)、MCX固相萃取柱(混合阳离子交换柱，柱容积为6mL)和HLB固相萃取柱，用海水稀释标准储备液，得到浓度为100μg/L的脱二氧喹烯酮及MQCA标准溶液，过经活化的采用MAX固相萃取柱(混合阴离子交换柱，柱容积为6mL)、MCX固相萃取柱和HLB固相萃取柱，用3mL水溶液淋洗，10mL体积浓度为2％的甲酸乙酸乙酯洗脱收集；40℃下氮气吹干，加入1mL含体积浓度为0.1％甲酸的乙腈-水溶液(其中乙腈和水的体积比为70：30)1mL定容，上机测定。

MCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱对两种目标化合物的回收率均低于40％。

MAX固相萃取柱对所有组分净化效果和回收率均满足需求。

本标准采用了体积浓度为2％的甲酸乙酸乙酯作为MAX固相萃取柱的洗脱液，并对洗脱液的体积进行了研究，结果表明，6mL体积浓度为2％的甲酸乙酸乙酯能将目标化合物完全洗脱。

实施例5

取山东某三个水产养殖场的10份实际水样测定结果。按本方法进行处理后上机检测，计算结果中，有三份水样检出3-甲基喹噁啉-2-羧酸，分别为13.1ng/L，15.8ng/L和20.2ng/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。