用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用。

背景技术

迄今为止，丙型肝炎病毒(HCV)具有7种基因型和67种亚型，差异很大。HCV基因型(GT)和亚型的差异，以及耐药相关取代(RASs)的存在，均为选择直接作用抗病毒(DAA)治疗方案的关键因素。但是，目前可用的HCV基因分型分析在区分HCV亚型方面存在局限性，并且在不同亚型中的RAS流行率很大程度上是不确定的。

据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。直接抗病毒药物(Direct anti-HCV agents,DAAs)主要为HCV病毒非结构蛋白(NS3,NS5A,NS5B)抑制剂，而HCV基因的某些突变会显著降低这种抑制作用。因此，随着直接抗病毒药物在国内上市及临床应用，HCV耐药性检测将在临床用药中起到重要的作用。但目前在HCV耐药性检测中，通过简单的检测方法进行有效检测较难实现，其难点主要在于难以得到有效的目的片段，或者是得到的目的片段难以囊括待检的多个突变位点。特别是当样本中目的待测物的浓度很低时，更是难以实现多个突变位点得到精准全面的检测效果。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，可在低浓度样本中扩增得到有效覆盖了HCV 2a亚型NS3基因耐药突变位点的目的片段，从而可以实现在低浓度样本中耐药突变位点全面检测，为全面分析HCV 2a亚型的耐药情况及临床用药中起到重要作用。

实现上述目的的技术方案如下：

一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；或所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。

一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的扩增引物组，所述扩增引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示的反向互补序列，所述内引物对的序列为SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的反向互补序列；或所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.2所示，所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3-SEQID NO.4所示的反向互补序列。

本发明的目的之一还在于提供一种HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的检测方法。

实现上述目的的技术方案如下：

(1)以待测样本的总RNA为模板，采用权利要求1-2任一项所述外引物对进行RT-PCR扩增；

(2)回收步骤(1)的产物测序后进行耐药性分析。

在其中的一些实施例中，上述检测方法还包括如下步骤：

对所述步骤(1)的产物采用权利要求1-2任一项所述内引物对进行RT-PCR扩增，再对该PCR扩增的产物测序后进行耐药性分析。

在其中一些实施例中，上述外引物对进行逆转录扩增的条件为：先50℃、30分钟；再94℃、3分钟；再依次94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、30秒进行40个循环；最后在72℃延伸7分钟；

在其中一些实施例中，上述内引物对进行PCR扩增的条件为：先95℃、30秒；再依次95℃、15秒，56℃、15秒，72℃、30秒进行35个循环；最后在72℃延伸5分钟。

在其中的一些实施例中，上述测序为Sanger测序，测序使用的引物对与扩增得到的测序对象所使用的扩增引物对相同。

在其中一些实施例中，上述耐药性分析为测序结果与HCV 2a亚型参考株AB047639.1的序列进行比对，确认耐药相关突变位点是否发生变异。

在其中一些实施例中，上述耐药相关突变位点包括第36位的缬氨酸、第41位的谷氨酰胺、第43位的苯丙氨酸、第54位的苏氨酸、第55位的缬氨酸、第56位的酪氨酸、第80位的甘氨酸、第122位的赖氨酸、第155位的精氨酸、第156位的丙氨酸、第158位的缬氨酸、第168位的天冬氨酸、第170位的异亮氨酸和第175位的亮氨酸中的至少一种。

本发明的目的之一还在于提供上述扩增引物组在制备用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因试剂中的应用。

本发明的目的之一还在于提供一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的试剂盒。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种用于检测HCV 2a亚型NS3耐药突变基因的试剂盒，包括上述扩增引物组。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人针对2a亚型HCV基因组情况进行了深入研究，进一步针对a亚型HCV的NS3区域设计了特异性扩增引物组，使用该扩增引物组进行PCR扩增等检测分析时，可获取更长的目的片段，从而有效保证NS3区域耐药相关突变位点的覆盖率。尤其是当样本中病毒RNA浓度高于检测最低检出限1.00E+03IU/mL时，检测成功率可达100％,有利于对低HCV RNA浓度的样品进行多个耐药突变位点全面检测，灵敏度高。从而可用于辅助分析研究2a亚型HCV基因的耐药突变情况，为2a亚型HCV耐药性临床研究提供参考。

附图说明

图1为实施例2有效性实验时，对64例HCV分型结果为2a亚型阳性样本RT-PCR扩增产物电泳检测结果图。

图2为实施例2有效性实验时，对图1中7例不满足测序要求的样本进行巢式PCR扩增后电泳检测结果图。

图3为实施例3重复性实验时，对21例HCV分型结果为2a亚型阳性样本RT-PCR扩增反应电泳图，其中左侧图采用的核酸提取仪编号：JY239，PCR扩增仪：JY100；右侧图采用的核酸提取仪编号：JY212，PCR扩增仪：JY249。

图4为实施例4检出限实验时，对5例HCV分型结果为2a亚型阳性样本梯度稀释得到的45例实验组进行RT-PCR扩增反应电泳图。

图5为实施例4检出限实验时，对图4中22例不满足测序要求的实验组进行RT-PCR扩增反应电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1检测方法的建立

材料和方法

1.1标本收集广州金域医学检验中心有限公司基因分型为2a亚型(64例)的丙肝患者的血浆样本。

1.2仪器和试剂

1.2.1仪器Natch S全自动核酸提取仪(圣湘生物)；ABI7500实时荧光定量PCR仪(Life)；Biorad S1000 PCR仪(BioRad)；Biorad PAC300电泳仪(BioRad)；Biorad凝胶成像系统(BioRad)；ABI3730xl测序仪(Life)。

1.2.2试剂核酸提取或纯化试剂(圣湘生物)；丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)；HiScript II One Step RT-PCR Kit(诺唯赞)；2×Phanta Max MasterMix(诺唯赞)；

表1-1扩增及测序引物信息

注：引物结合位点均以参考株AB047639.1(JFH-1)为准。上述序列中Y＝C/T，R＝A/G。

表1-2文献中报道的引物信息

其中：Y＝C/T，R＝A/G。

1.2.3文献(Krishnan,P,et al，2017)报道的耐药位点为A36，F43，T54，V56，G80，R155，S166，D168，本方案检测的位点包括；V36、Q41、F43、T54、V55、Y56、G80、K122、R155、A156、V158、D168、I170、L175，相比之下，耐药位点的覆盖度较高；文献中每种亚型仅提供一对引物，本方案为了保证扩增的成功率，设计了一对外引物和一对内引物，提高了扩增的成功率。

1.3实验方法

1.3.1提取核酸和HCV RNA定量:使用圣湘生物的核酸提取或纯化试剂和Natch S全自动核酸提取仪进行核酸提取，并用圣湘生物丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)和Life的ABI7500实时荧光定量PCR仪定量HCV RNA。

1.3.2扩增HCV 2a-NS3基因片段使用诺唯赞的HiScript II One Step RT-PCRKit和BioRad的Biorad S1000 PCR仪将HCV 2a-NS3基因片段通过一步法RT-PCR扩增。具体反应体系如下表1-3，反应程序如下表1-4所示。

表1-3第一轮RT-PCR反应体系(30μl)

表1-4第一轮RT-PCR反应程序

1.3.3琼脂糖凝胶电泳使用BioRad的Biorad PAC300电泳仪对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳，并用Biorad凝胶成像系统进行凝胶成像。

1.3.4巢式PCR没有达到测序要求的样品，则以第一轮扩增产物作为模板用诺唯赞的2×Phanta Max Master Mix和BioRad的Biorad S1000 PCR仪进行巢式PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳。反应体系如表1-5，反应程序如表1-6所示。

表1-5第二轮巢式PCR反应体系(30μl)

电泳检测结果标准为：在896bp/753bp处有清晰且单一的条带。

表1-6第二轮巢式PCR反应

1.3.5Sanger测序满足测序要求时，利用Life的

测序结果分析标准为：cut off值设置为20％，仅判断大于占比20％碱基信息。

实施例2有效性验证

取64例HCV 2a亚型阳性样本，在同一批次内进行提取、进行NS3靶基因区域扩增并测序，计算检测成功率。通过检测统计显示，100％(64/64)的样本扩增并测序成功，说明所设计的引物能够覆盖本次实验的所有样本，该方法有效性良好。

其中，第一次RT-PCR扩增后进行电泳，电泳结果见图1。其中，阳性质控(编号为HCVT651-POS，为已知确诊阳性临床样本配制)扩增出了较为明显的条带，阴性对照(编号为NEG，为常规无病原体血清)无扩增，说明本次实验结果有效。有几个样本(编号为HCV022、HCV023、HCV028、HCV029、HCV046、HCV058和HCV063)无条带或条带不清晰，未满足测序条件，进行巢式PCR后再进行电泳，结果如图2所示，除HCV058条带较弱外，样本均扩增出了清晰的条带，满足测序条件。进行了两轮PCR后，100％(40/40)的样本扩增成功。

测序结果如表4所示，将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，100％(64/64)的样本测序成功。经统计，4.7％(3/64)的样本发生了36号位的突变；1.6％(1/64)的样本发生了55号位的突变，12.5％(8/64)样本发生了56号位的突变；3.1％(2/64)的样本发生了122号位的突变；3.1％(2/64)的样本发生了168号位的突变。从本次实验可看出，56号位突变率相对较高，很有可能导致以这个位点为靶点的直接抗病毒药物失效。

表4有效性验证测序分析结果

实施例3重复性验证

对36例HCV 2a亚型样本和2例质控样本在两台核酸提取仪和两台PCR扩增仪上进行验证，其中第一批采用的核酸提取仪编号为JY239、PCR扩增仪编号为JY100；第二批采用的核酸提取仪编号为JY212、PCR扩增仪编号为JY249。结果显示不同核酸提取仪和不同PCR扩增仪对检测结果的可重复性无影响，因此该项目的可重复性为100％(36/36)。

其中，针对21例样本的第一批RT-PCR电泳结果见图3，所有样本扩增结果理想，且两次重复实验结果一致，满足测序条件。经过一轮PCR后，100％的样本扩增成功，且100％的样本结果一致。

将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，结果如表5所示。两批实验所得测序结果一致。

表5重复性验证测序分析结果

实施例4最低检出限的检测

本次验证实验共对5例HCV 2a亚型样本进行梯度稀释后进行检测，并针对每个样本进行三次平行检测，检测结果如下表6所示，病毒载量在1.00E+03IU/mL以上的样本，通过一次/两次扩增即可满足测序要求，1.00E+03IU/mL以上的样本，除1例样本外，其余样本均在第二轮扩增后达到测序要求。因此，将该项目的最低检出限暂定为1.00E+03IU/mL。

表6检出限测量样本浓度

通过对上述扩增结果数据的分析可以看出，病毒载量在1.00E+03IU/mL以上的HCV2a亚型样本，通过一次/两次扩增即可满足测序要求，1.00E+03IU/mL以下的HCV 2a亚型样本，除2例样本[HCV073(711809140558)的2个重复和HCV074(711806040145)的1个重复]扩增结果无法满足测序要求外，其余样本均在第二轮扩增后达到测序要求。

测序结果：将满足测序条件的扩增产物送检，进行Sanger测序，所得序列在基因网站上分型并用sequencher5.4.6分析，结果见表7，所有测序样本均测序成功。

表7检出限测量测序分析结果

注：1、数据以AB047639.1(JFH-1)基因序列为参考序列进行分析；2、次峰cutoff值按20％进行设置，根据序列测序质量的差异，部分位点的分析经过人工校正；3、阴性对照[NEG]无扩增条带，阳性质控结果[HCVT451-1-POS(1322297118)]与预期结果一致，证明上述批次结果有效。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州金域医学检验中心有限公司

<120> 用于检测HCV 2a亚型耐药突变基因的扩增引物、检测方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccgatggaga agaargtcat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggrttgatgc catgtgcctt 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcctcctygg cccagctga 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tggcagcyac cgagggrtt 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttygtcagrg ctcacgctct g 21

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gagggcttct cgccagacat gatyttraa 29