一种柿叶发酵物及其制备方法、应用和饮品

技术领域

本发明属于食品技术领域，尤其涉及一种柿叶发酵物及其制备方法、应用和饮品。

背景技术

随着我国经济水平的提高和生活质量的不断改善，人们越来越追求更加健康或具有功能性的饮食。采用乳酸菌和酵母菌发酵植物原料，制备含有特定生物活性成分的发酵型产品逐渐受到人们喜爱，如植物酵素、发酵果蔬及其他生物制造功能食品。其中，食用植物酵素是由微生物(酵母菌、乳酸菌等)发酵制得的可食用的含有特定生物活性成分的产品。目前全世界食用植物酵素大概有100万t，达到了30亿美元的销售额，全球植物酵素厂家多于3000家。

通过人工接种微生物，可以在发酵环境中快速形成有益菌种的生长优势，抑制杂菌和致病菌的繁殖，保证发酵产品的生产安全性，提高风味和活性物质的产生。

乳酸菌是利用可发酵糖类产生大量乳酸的一类细菌。乳酸菌通过一系列复杂的代谢过程可以产生乳酸等有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然的抑制有害菌的物质，这些物质能够维持胃肠道内菌群平衡，提高身体的免疫能力。

采用益生菌发酵果蔬汁能同时具备果蔬与益生菌的双重优点，在果蔬原有风味与营养基础上，产生发酵特殊风味和营养物质，如有机酸、维生素、氨基酸和各种酶等，从而改善了果蔬产品风味和功能性。如张晶等利用短乳杆菌发酵苹果汁，结果表明，发酵后苹果汁的品质明显改善，乳酸、富马酸、乙酸、奎宁酸含量显著增多，而苹果酸和琥珀酸持续减少。朱珺等筛选到1株具有良好的胃肠道环境耐受能力的植物乳杆菌，发现该菌株适于发酵多种果蔬汁，尤其可改善胡萝卜汁的生冲气味，发酵后的活菌数达1.24×10

酵母菌(Yeast)种类较多，其中与人类关系最为密切的是酵母属(Saccharo mycessp.)，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是酵母属的代表菌种，最早被人们用来酿酒和发面。酵母细胞含有丰富的蛋白质、氨基酸、核酸、B族维生素、微量元素以及各种消化酶。其细胞壁含有多种生物活性物质(甘露糖、β-葡聚糖、谷胱甘肽、麦角固醇)，可作为营养物质被吸收，还可以促进免疫反应，促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖。酿酒酵母通过厌氧发酵，将糖类转化为乙醇、CO

柿子树(Diospyros kaki L.)是一种重要的经济水果作物，在中国、日本、韩国等亚洲国家广泛种植。柿叶是柿子树的鲜叶或干叶。柿叶是中医药，最早记载于明代《滇南本草》。霜柿叶可以治慢性溃疡。柿叶在临床上长期应用于中风及中风证候的治疗，改善缺血性中风、心绞痛、内出血，以及麻痹、冻伤、烧伤、出血、便秘。柿叶具有清除自由基、神经保护、血栓形成抑制、动脉粥样硬化、抗突变、抗组胺和抗过敏特性。此外，它们在日本传统医学中被用作降压药。柿叶提取物制成的脑心清片已被列入《2010年中国药典》增补版，作为防治冠心病、脑动脉硬化症的中药保护品种。《广西中草药标准》(1990年)报道柿叶对咳嗽、内出血、高血压、脑动脉硬化和冠心病有疗效。柿叶茶中含有丰富的黄酮类化合物和较高含量的维生素C，可以部分替代昂贵的柑橘类水果。柿叶长期被用作保健饮料的原料，如在中国和日本，用于降低血压、消除胆固醇积聚和防止黑色素积聚，深受中国人和日本人的欢迎。柿叶还具有美白作用，不仅在药用上，而且在化妆品和食品工业中越来越受欢迎。此外，它还可以调节免疫功能，抑制炎症。柿叶具有保护心脏、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、止血等多种药理和治疗作用，可能是由于柿叶中含有多种黄酮类化合物和萜类化合物所致。柿叶具有较好的食品安全性，多年来对这种草药的研究没有任何副作用或毒性报告。目前的毒性研究表明，柿叶无毒性作用。越来越多的科学证据表明，柿叶作为保健品在未来将会蓬勃发展。

然而，现有利用柿叶进行发酵的产物存在酒精度较高以及黄酮类物质浓度较低等问题，故亟待对柿叶的发酵工艺进行改进。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种柿叶发酵物的制备方法，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

将柿叶和糖置于水中进行加热浸提，得到柿叶汁；

向柿叶汁中接种植物乳杆菌和酵母菌进行发酵，得到柿叶发酵物。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述柿叶汁中柿叶的质量浓度为2～3％W/V。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述柿叶汁中糖的质量浓度为1～3％W/V。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述糖为蔗糖。需要说明的是，糖还可以选用甜菊糖、葡萄糖和果糖等糖类物质，并不限于此。

作为本发明实施例的另一个优选方案，加热浸提的温度为90～100℃，加热浸提的时间为10～30min。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述植物乳杆菌的接种量为柿叶汁的0.5～1.5％V/V；所述酵母菌的接种量为柿叶汁的0.5～1.5％V/V。

作为本发明实施例的另一个优选方案，发酵的温度为35～39℃，发酵时间为12～48h。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的柿叶发酵物。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的柿叶发酵物在制备饮品中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种饮品，其部分或全部包含上述的柿叶发酵物。

需要说明的是，饮品可以为茶、饮料等，其还可以添加蔗糖等食品添加剂，但不限于此。

本发明实施例提供的一种柿叶发酵物的制备方法，通过采用植物乳杆菌与酵母菌对柿叶进行协同发酵，可提高柿叶中黄酮类物质的浸提量和改善柿叶发酵物的口感风味；该制备方法制得的柿叶发酵物的酒精度低，黄酮类物质平均含量高，且同时具有酵母菌和植物乳杆菌发酵风味和柿叶特有风味，可用作为饮品。

附图说明

图1为芦丁标准曲线图。

图2为乙醇标准曲线图。

图3为发酵过程柿叶发酵物中的总黄酮类物质浓度变化曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

该实施例提供了一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采摘新鲜的柿子叶，自然晾干后，得到干柿叶，保存于自封袋中备用。

S2、将上述干柿叶以边长3cm的片状分装至玻璃容器中，加入蔗糖，并加水定容，封盖，置于水浴锅中以90℃的温度进行加热浸提10min，并冷却，得到柿叶汁；其中，柿叶汁中柿叶的质量浓度为2％W/V，蔗糖的质量浓度为1％W/V。

S3、菌种活化：无菌条件下，将冷冻保藏的植物乳杆菌菌种(分离自传统酸白菜，市售产品)以2％(V/V)比例接种至MRS肉汤培养基中，置于37℃培养24h，连续活化2次，得到植物乳杆菌；无菌条件下，将活性干酵母(市售产品)以1％(W/V)比例接种至马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培养液中，37℃震荡培养24h，再以2％(V/V)比例活性1次，得到酵母菌。

S4、向上述冷却后的柿叶汁中接种0.5％(V/V)植物乳杆菌和0.5％(V/V)酵母菌，35℃发酵12h后，于无菌条件下，过滤去除柿叶并收集滤液，即可得到柿叶发酵物。另外，往上述柿叶发酵物添加一定量的蔗糖，使其最终总糖度为6°Bx，即可得到柿叶饮料。

实施例2

该实施例提供了一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采摘新鲜的柿子叶，自然晾干后，得到干柿叶，保存于自封袋中备用。

S2、将上述干柿叶以边长5cm的片状分装至玻璃容器中，加入蔗糖，并加水定容，封盖，置于水浴锅中以100℃的温度进行加热浸提30min，并冷却，得到柿叶汁；其中，柿叶汁中柿叶的质量浓度为3％W/V，蔗糖的质量浓度为3％W/V。

S3、菌种活化：无菌条件下，将冷冻保藏的植物乳杆菌菌种以2％(V/V)比例接种至MRS肉汤培养基中，置于37℃培养24h，连续活化2次，得到植物乳杆菌；无菌条件下，将活性干酵母以1％(W/V)比例接种至PDA培养液中，37℃震荡培养24h，再以2％(V/V)比例活性1次，得到酵母菌。

S4、向上述冷却后的柿叶汁中接种1.5％(V/V)植物乳杆菌和1.5％(V/V)酵母菌，39℃发酵48h后，于无菌条件下，过滤去除柿叶并收集滤液，即可得到柿叶发酵物。另外，往上述柿叶发酵物添加一定量的蔗糖，使其最终总糖度为8°Bx，即可得到柿叶饮料。

实施例3

该实施例提供了一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采摘新鲜的柿子叶，自然晾干后，得到干柿叶，保存于自封袋中备用。

S2、将上述干柿叶以边长4cm的片状分装至玻璃容器中，加入蔗糖，并加水定容，封盖，置于水浴锅中以93℃的温度进行加热浸提15min，并冷却，得到柿叶汁；其中，柿叶汁中柿叶的质量浓度为2.3％W/V，蔗糖的质量浓度为1.5％W/V。

S3、菌种活化：无菌条件下，将冷冻保藏的植物乳杆菌菌种以2％(V/V)比例接种至MRS肉汤培养基中，置于37℃培养24h，连续活化2次，得到植物乳杆菌；无菌条件下，将活性干酵母以1％(W/V)比例接种至PDA培养液中，37℃震荡培养24h，再以2％(V/V)比例活性1次，得到酵母菌。

S4、向上述冷却后的柿叶汁中接种0.8％(V/V)植物乳杆菌和1.2％(V/V)酵母菌，36℃发酵24h后，于无菌条件下，过滤去除柿叶并收集滤液，即可得到柿叶发酵物。另外，往上述柿叶发酵物添加一定量的蔗糖，使其最终总糖度为8°Bx，即可得到柿叶饮料。

实施例4

该实施例提供了一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采摘新鲜的柿子叶，自然晾干后，得到干柿叶，保存于自封袋中备用。

S2、将上述干柿叶以边长4cm的片状分装至玻璃容器中，加入蔗糖，并加水定容，封盖，置于水浴锅中以95℃的温度进行加热浸提25min，并冷却，得到柿叶汁；其中，柿叶汁中柿叶的质量浓度为2.5％W/V，蔗糖的质量浓度为2.5％W/V。

S3、菌种活化：无菌条件下，将冷冻保藏的植物乳杆菌菌种以2％(V/V)比例接种至MRS肉汤培养基中，置于37℃培养24h，连续活化2次，得到植物乳杆菌；无菌条件下，将活性干酵母以1％(W/V)比例接种至PDA培养液中，37℃震荡培养24h，再以2％(V/V)比例活性1次，得到酵母菌。

S4、向上述冷却后的柿叶汁中接种1.2％(V/V)植物乳杆菌和0.8％(V/V)酵母菌，38℃发酵36h后，于无菌条件下，过滤去除柿叶并收集滤液，即可得到柿叶发酵物。另外，往上述柿叶发酵物添加一定量的蔗糖，使其最终总糖度为7°Bx，即可得到柿叶饮料。

实施例5

该实施例提供了一种柿叶发酵物的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采摘新鲜的柿子叶，自然晾干后，得到干柿叶，保存于自封袋中备用。

S2、将上述干柿叶以边长4cm的片状分装至玻璃容器中，加入蔗糖，并加水定容，封盖，置于水浴锅中以90℃的温度进行加热浸提20min，并冷却，得到柿叶汁；其中，柿叶汁中柿叶的质量浓度为3％W/V，蔗糖的质量浓度为2％W/V。

S3、菌种活化：无菌条件下，将冷冻保藏的植物乳杆菌菌种以2％(V/V)比例接种至MRS肉汤培养基中，置于37℃培养24h，连续活化2次，得到植物乳杆菌；无菌条件下，将活性干酵母以1％(W/V)比例接种至PDA培养液中，37℃震荡培养24h，再以2％(V/V)比例活性1次，得到酵母菌。

S4、向上述冷却后的柿叶汁中接种1％(V/V)植物乳杆菌和1％(V/V)酵母菌，37℃发酵12h后，于无菌条件下，过滤去除柿叶并收集滤液，即可得到柿叶发酵物。另外，往上述柿叶发酵物添加一定量的蔗糖，使其最终总糖度为8°Bx，即可得到柿叶饮料。

实验例：

一、实验方法：通过正交实验获得最优组合的柿叶发酵物，同时，向其中添加一定含量的蔗糖，以感官评定(见表1)结果确定最佳蔗糖添加量。

实验过程具体如下：

1、单因素实验：对影响柿叶发酵物风味的因素及其水平进行分析。

(1)柿叶添加量

向玻璃瓶中分别加入1％、2％及3％(W/V)的干柿叶，加水定容，置于100℃下浸提20min，冷却。从滋气味方面对浸提液进行感官评价(见表1)。

(2)浸提温度和时间

以2％(W/V)的柿叶浓度，分别进行不同条件的浸提，即90℃ 10min、90℃ 20min、90℃ 30min、100℃ 10min、100℃ 20min。冷却后对浸提液的滋气味进行感官评价(见表1)，并测定黄酮类物质含量。

(3)发酵时间

参考实施例5提供的制备方法，以2％(W/V)为柿叶浓度，以90℃ 30min为浸提条件，接种1％(V/V)植物乳杆菌和1％(V/V)酵母菌，37℃分别发酵12h、18h及24h，感官评价(见表1)，并测定pH值、乙醇含量及黄酮类物质含量。

表1感官评价表

2、正交实验：以柿叶添加量、浸提时间及发酵时间为因素指标，根据单因素实验进行柿叶发酵物的L

表2柿叶发酵物正交实验因素水平

3、pH值的测定：使用pH计测量。

4、糖度的测定：使用手持式折光仪测量。

5、乙醇含量的测定：柿叶发酵物中乙醇含量的测定，首先采用蒸馏法收集蒸馏液，再使用重铬酸钾法进行滴定。

(1)乙醇标准曲线的制备

乙醇标准溶液：将0.25mL无水乙醇加入100mL容量瓶中，加水至刻度，得2.0mg/mL乙醇溶液。从该乙醇溶液中分别取0、1、2、3、4、5、6、7mL，转入10mL比色管中，再加入5％(W/V)重铬酸钾溶液2.0mL，加水至刻度并混匀。100℃水浴加热10min后冷却。以空白标准(1号管)作参比，在波长600nm下测定各标准溶液吸光度，绘标准曲线。

(2)柿叶发酵物中乙醇含量的测定

从柿叶发酵物的蒸馏液中吸取0.25mL加入10mL比色管中，以标准曲线方法测定吸光度，并由标准曲线计算乙醇含量，以mg/mL或V/V为单位表示。

6、黄酮含量的测定：采用现有的黄酮含量测定方法，详见现有文献(王丽,徐博慧,华平.柿子叶黄酮保健饮料的研制[J].饮料工业,2014,17(10):21-24.)。

二、实验结果：

1、芦丁标准曲线：以芦丁为黄酮类物质参照物，制作其含量与吸光度值的标准曲线，如图1所示。

2、乙醇标准曲线：根据实验结果，绘制乙醇含量与吸光度值的标准曲线，如图2所示。

3、单因素实验结果：

(1)柿叶添加量对浸提液风味的影响：经过加热浸提，不同浓度的柿叶浸提液(柿叶汁)所呈现的滋气味相差较大(见表3)。

表3不同柿叶添加量的柿叶汁感官评价结果

其中1％(W/V)浸提液气味和滋味较淡，甜度呈现较高；3％(W/V)浸提液的柿叶浓度高，苦味较重；2％(W/V)浸提液气味纯正，且具有柿叶特有的滋味，苦味适中。因此，2％(W/V)柿叶添加量的柿叶汁感官接受度最高。

(2)加热条件对柿叶汁风味及黄酮类物质浸提量的影响：确定最佳柿叶添加量后，对不同浸提温度和时间对柿叶汁的影响进行了研究(见表4)。

表4不同浸提条件的柿叶汁感官评价结果与黄酮类物质浓度

浸提强度的增加，使柿叶汁苦味增强，柿叶气味更重，接受度降低。其中90℃浸提20min时的感官评价得分最高。而浸提时间的延长或温度的提高，都能提高柿叶中黄酮类物质的浸提量，但结果差异并不显著。因此，根据感官评价结果确定90℃ 20min为最佳浸提条件。

(3)发酵时间对柿叶发酵物风味及黄酮类物质浓度的影响：以所确定的最佳柿叶添加量及浸提条件为前提，对发酵时间对柿叶发酵物的影响进行分析，结果见表5。

表5不同发酵时间的柿叶发酵物的感官评价结果

由表5可知，随发酵时间延长，柿叶发酵物pH值逐渐下降，乙醇含量升高，而感官评价得分以18h时最高。酸度和乙醇含量的增加都对柿叶发酵物风味产生了影响。

另外，将2％(W/V)柿叶于90℃浸提20min后，柿叶不滤除，向柿叶汁中添加95％(V/V)医用酒精，使乙醇含量为0.5％(V/V)(此含量为饮料酒标准)，以该柿叶汁为酒精对照组，以接种植物乳杆菌和酵母菌的柿叶发酵物为接种实验组，发酵24h，测定其中黄酮类物质浓度变化(见图3)。

如图3所示，酒精对照组中黄酮类物质浓度变化也呈先升后降趋势，但变化幅度较小，其中以12h时的黄酮类物质浓度最高(0.082mg/mL)。而接种微生物后的柿叶发酵物中，黄酮类物质浓度前期大幅升高，后期逐渐降低，在18h时达到最高，达到0.131mg/mL，是酒精对照组中最高浓度的1.6倍，折合到单位重量的干柿叶中黄酮含量为6.55mg/g。因此，植物乳杆菌和酵母菌的发酵作用，大大提高了柿叶中黄酮类物质的浸出量。根据感官评价得分与黄酮类物质含量，最佳发酵时间为18h。

4、正交实验结果：如表6所示。

表6正交实验结果

如表6所示，根据极差分析结果，各因素对柿叶发酵物感官评价得分的影响大小分别为：柿叶添加量(A)>浸提时间(B)>发酵时间(C)，且最佳工艺组合为A

表7较优组合的理化性能测定结果

结果表明，不同组合之间的理化性能存在一定差异，其中黄酮类物质浓度以8号组合(A

糖度、pH值及酒精度对柿叶发酵物的滋气味可产生影响。由于初始柿叶浸提汁中蔗糖添加量为2％(W/V)，经过微生物代谢过程，柿叶发酵物中蔗糖被部分分解和利用，糖度更低，不利于感官评价的正确判断，因此需向柿叶发酵物中补充蔗糖，调节糖酸比，优化饮料配方。

5、发酵柿叶饮料的配方优化

根据正交实验结果，选取其中得分最高的3个组合(实验号2、3及8)，以及1个推测出的最佳组合A

表8加糖后较优组合的感官评价结果

注：*为正交实验预测最优组合A

由表8可知，加糖后柿叶发酵物的感官评价得分以8号组合(A

综上所述，本发明实施例提供的柿叶发酵物的制备方法，通过采用植物乳杆菌与酵母菌对柿叶进行协同发酵，可提高柿叶中黄酮类物质的浸提量和改善柿叶发酵物的口感风味；该制备方法制得的柿叶发酵物的酒精度低，黄酮类物质平均含量高，且同时具有酵母菌和植物乳杆菌发酵风味和柿叶特有风味，可用作为饮品。其中，当发酵温度为37℃，初始蔗糖量为2％(W/V)，酵母菌和植物乳杆菌接种比例为1:1(V/V)时，柿叶发酵物的最佳工艺为：柿叶添加量3％(W/V)、浸提时间20min、发酵时间12h，且二次添加蔗糖后，总糖量为8％(W/V)。最终得到发酵柿叶饮料的酒精度为0.89％(V/V)，黄酮类物质平均含量为0.19(mg/mL)，同时具有酵母菌和植物乳杆菌发酵风味和柿叶特有风味。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。