二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料及其在硫醇小分子检测方面的应用

技术领域

本发明涉及材料制备及硫醇小分子检测领域，尤其是涉及一种二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料，还涉及二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在硫醇小分子检测方面的应用。

背景技术

生物细胞内的小分子硫醇聚合物主要包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）以及高半胱氨酸（Hcy）。其中，Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸在代谢过程中产生的重要中间产物，其代谢所必需的酶由肾脏产生，当肾脏功能受到损害时，Hcy代谢所需的酶也必然受到影响，Hcy的含量也必然发生变化。因而，Hcy可作为高血压肾脏损害早期诊断的检验指标之一。

GSH作为半胱氨酸和同型半胱氨酸转化的最终产物，其是细胞内含量最多的非蛋白质硫醇，细胞中的绝大多GSH是以还原态存在，是有很多一部分以氧化钛（GSSG）存在。作为细胞中最主要的氧化还原成分，GSH在维持细胞氧化还原平衡方面发挥着关键作用，同时还能够保护机体免受自由基带来的伤害。

研究表明，GSH含量水平的变化与某些疾病密切相关，如阿尔茨海默病、动脉硬化和心血管疾病等，目前研究人员在各种癌细胞中都观察到了高浓度的GSH，如肝细胞中GSH的浓度高达10mmol/L，含量丰富的GSH对肝脏的合成、解毒功能进行保护，使自由基的含量减少，对肾病综合征患者肾功能的恢复具有积极的促进作用。最新研究表明，人体生物样品中的GSH和Hcy含量的变化与慢性肾脏疾病和肾脏损害有关。因而，肾脏疾病患者（如过敏性紫癜和紫癜性肾炎）生物样品中GSH和Hcy的定量检测对疾病的早期诊断具有重要意义。

目前，多种检测硫醇小分子的方法被相继研究报道，主要包括电化学分析法、荧光探针检测法和色谱分离法。电化学分析法信号不稳定，且只能检测生物硫醇的总含量，无法满足实际需求。

荧光探针检测法需要先将样品衍生化处理，然后再进行荧光检测。该检测方法具有以下缺陷：首先，该检测方法中样品的衍生化处理步骤极为复杂，在处理过程容易出现生物硫醇氧化或降解情况，导致无法检出，尤其是尿液和唾液等含量极低的样品；其次，该检测方法是基于巯基的强亲核性进行检测，而GSH、Cys和Hcy等硫醇小分子都含有巯基，因而该检测方法不能分别识别并检测上述三种硫醇小分子，也不能满足同时定量检测需求。

高效液相色谱-紫外检测器法（HPLC-UV）可以实现样品中硫醇小分子的定性和定量分析。然而，该检测方法对于硫醇小分子含量较低或基质复杂的样品，往往无法检出。质谱作为一种具有高稳定性、高准确度和低检出限等优点的检测技术常用来定性和定量分析物，传统的多反应监测扫描（Multiple reaction monitoring，MRM）是定量分析的“金标准”。然而，如何实现样品中微量（或痕量）的快速富集和浓缩，以实现样品中硫醇小分子的精确定量仍然是困扰行业研究的重要难题。

目前，已经出现了用金纳米颗粒作吸附样品中硫醇小分子的相关报道，但金纳米颗粒成本较高、吸附选择性一般。金属有机骨架（MOF）是由有机配体和金属离子通过自组装过程形成的具有周期性的网络结构的金属有机骨架晶体材料，常常作为固相萃取等前处理材料对待测样本进行选择性富集，尤其是UiO-66系列的金属有机骨架因合成方法多样，容易功能化，更是受到了广泛的关注。然而，现有MOF的有机骨架中往往因缺少特异性识别基团，无法实现复杂生物样品中微量硫醇小分子对灵敏度和选择性的需求。

合成后修饰是赋予传统有机骨架材料特异性功能位点的一种常用方法，通过设计合成对氨基硫醇具有选择性的MOF人工受体，从而实现特异性吸附和高灵敏度检测的目的。此外，将纳米厚度的MOF人工受体均匀嫁接到硅球表面形成核壳型复合材料，可以有效增加MOF的比表面积，使活性位点充分暴露，提高MOF的识别能力和生物相容性。然而，目前没有关于使用MOF功能材料作为吸附剂，同时结合HPLC-MS/MS的MRM技术，以实现复杂生物样品中微量硫醇小分子的富集和定量检测的相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料，还提供了该二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在硫醇小分子检测方面的应用，在检测时以二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料作为特异性吸附剂，能够对复杂生物样品中的硫醇小分子进行选择性富集，结合HPLC-MS/MS技术，实现了样品中两种以上硫醇小分子的同时定量分析。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明所述的二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料，其合成方法包括下述步骤：

第一步，以正硅酸乙酯为原料，采用溶胶凝胶法制备纳米二氧化硅微球；

第二步，用硅烷化偶联剂对第一步中的纳米二氧化硅微球进行修饰，使其表面含有活性的氨基官能团，得到氨基化产物SiO

第三步，用酸酐对SiO

第四步，将第三步得到的SiO

第五步，将第四步得到的SiO

第六步，向酸化的SiO

在本发明的优选实施例中，所述第二步中的硅烷化偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述第三步中的酸酐为丁二酸酐。

在本发明的优选实施例中，所述第四步中的洗涤方法为：用DMF洗涤多次，且最后一次洗涤振荡过夜；所述第五步中的洗涤方法为：先用DMF清洗并振荡过夜，然后再用DMF和丙酮洗涤；所述第六步中的洗涤方法为：先用去离子水洗涤至少五次，再用丙酮洗涤至少五次，最后用二氯甲烷洗涤至少五次，且最后一次二氯甲烷洗涤振荡过夜。

在本发明的优选实施例中，所述第四步中SiO

在本发明的优选实施例中，所述第五步中SiO

本发明还提供了二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在硫醇小分子定量检测方面的应用。

更进一步地，本发明还提供了二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在紫癜性肾炎患者尿液中硫醇小分子定量检测方面的应用。

更进一步地，本发明还提供了二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在紫癜性肾炎患者尿液中GSH、Hcy定量检测方面的应用。

本发明还提供了以二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料作为特异性吸附剂，结合HPLC-MS/MS技术定量检测硫醇小分子的方法，包括以下检测步骤：

第一步，将权利要求1制得的SiO

第二步，向尿液样品中加入含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的硼酸盐缓冲液，室温孵育一定时间后，向尿液样品中依次加入三氯乙酸和乙二胺四乙酸，然后离心，取上清液并中和至中性，得到尿液样品处理液，备用；

第三步，向尿液样品处理液中加入第一步制得的SiO

第四步，对第三步中的富集液进行分析检测。更优选地，在所述第四步中，用HPLC-MS/MS对富集液进行定量检测，其中液相色谱条件为：流动相包括A相和B相，其中A相为含有0.1 %甲酸的水溶液，B相为甲醇；且在检测时采用梯度洗脱：0.1 min，1% B相；5 min，升至5% B相；20 min，升至40% B相；21 min，升至95% B相；21～24 min，95% B相；25 min，降至5%B相；25～30 min，5% B相；31 min，降至1% B相；31～35 min，1% B相；HPLC-MS/MS的质谱检测条件为：质谱扫描模式：多反应监测；电喷雾离子源：正离子扫描；离子源电压：5500ev；离子源温度：550℃。

本发明直接将金属有机骨架修饰到纳米二氧化硅微球上，增加了金属有机骨架的比表面积，充分暴露识别位点，为提高复合材料的特异性吸附打下基础。

本发明采用合成后修饰法中的配体交换方式，直接将半胱氨酸修饰到金属有机骨架上，得到了生物相容性好且具有特异性识别位点的核壳型复合材料，有效克服了现有技术无法直接合成含有半胱氨酸基团的UIO-66的技术缺陷。

半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽是汞离子在体内的主要作用靶点，以Cys-Hg-Cys、Cys-Hg- GSH、Cys-Hg- Hcy等连接模式存在。本发明充分利用半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的上述特性，利用合成后修饰法在金属有机骨架上修饰Cys，然后将复合材料与Hg

本发明首次将二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料用于过敏性紫癜和紫癜性肾炎患者的尿液样品中，实现了过敏性紫癜和紫癜性肾炎患者的尿液样品中GSH和Hcy的同时定量检测。具体地，结合质谱MRM分别同时定量，结果表明能够实现GSH和Hcy的分别同时定量检测。因而，本发明的核壳型复合材料特别适用于含量较低或基质较为复杂样本中GSH和Hcy的分析检测。

附图说明

图1是本发明SiO

图2是本发明纳米SiO

图3是本发明SiO

图4是本发明SiO

图5是本发明SiO

图6是本发明实施例2中谷胱甘肽和同型半胱氨酸的HPLC-UV谱图。

图7是本发明实施例2中谷胱甘肽和同型半胱氨酸的HPLC-MS/MS谱图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步详细地说明本发明的技术方案。本实施例中所用的试剂仪器如无特殊说明，均是本行业常用或市售产品。

实施例1 本发明二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料的制备

（一）、本发明二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料，其合成方法包括下述步骤：

第一步，以正硅酸乙酯为原料，采用溶胶凝胶法制备纳米二氧化硅微球。具体内容为：将50mL乙醇、10mL水和2.5mL一水合氨（即NH4OH）混合均匀，在强烈搅拌条件下边搅拌边滴加4mL正硅酸乙酯（滴加时间控制在6min以内），滴加完成后，将混合体系继续磁力搅拌反应24h，反应结束后用无水乙醇洗涤三次，然后离心弃上清，于55℃真空干燥过夜，得到纳米二氧化硅微球，备用；

第二步，用硅烷化偶联剂对第一步中的纳米二氧化硅微球进行修饰，使其表面含有活性的氨基官能团，修饰得到SiO

第三步，用酸酐对第二步得到的SiO

第四步，将200mg SiO

第五步，将第四步得到的SiO

第六步，取420mg酸化的SiO

本实施例中SiO

（二）、对制得的SiO

1、采用扫描电镜观察纳米二氧化硅微球和SiO

从图2可以看出，纳米二氧化硅微球为分散性好、大小均一的球状结构且其表面较为光滑；SiO

2、采用FT-IR光谱仪对SiO

从图3可以看出，SiO

3、对实施例1中的SiO

从图4可以看出，SiO

从图4还可以看出，在SiO

4、采用热重分析仪对本发明制备得到的SiO

5、采用元素分析仪对SiO

表1 SiO

从表1可以看出，SiO

实施例2 本发明所述的二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料在紫癜性肾炎患者尿液中硫醇小分子检测方面的应用

本实施例以紫癜性肾炎患者尿液样品作为检测对象，采用实施例1制备得到的SiO

第一步，将实施例1制备得到的SiO

第二步，取1mL尿液样品，向尿液样品中加入100μL含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的硼酸盐缓冲液（其pH为7.4，三(2-羧乙基)膦盐酸盐的浓度为50mmol/L），室温孵育10min，孵育结束后向尿液样品中加入900μL含有三氯乙酸（浓度为1%（m/v））和乙二胺四乙酸（浓度为1M）的混合溶液，然后离心，取上清液并中和至中性（可用氢氧化钠水溶液进行调节），得到尿液样品处理液，备用；

第三步，取200μL尿液样品处理液，并向尿液样品处理中加入第一步制得的SiO

第四步，先用HPLC-UV对第三步中的富集液和第二步中的尿液样品处理液进行定性检测，其液相色谱条件为：

色谱柱：Agient 5TC-C18(2) (250mm×4.6mm)；柱温：40℃；流动相包括A相和B相，A相为含有0.1 %甲酸的水溶液，B相为甲醇；检测时采用梯度洗脱：0.1 min，1% B相；5 min，升至5% B相；17 min，升至40% B相；27 min，升至95% B相；27～32 min，95% B相；33 min，降至5% B相；33～35 min，5% B相；λ为280nm，自动进样器温度4℃；进样量：10μL，结果见图6。

从图6可以看出，采用HPLC-UV检测到富集液中含有GSH和Hcy，且实现了GSH和Hcy的良好分离；然而在样品处理液中并没有检测到谷胱甘肽和同型半胱氨酸。结果表明，现有HPLC-UV无法实现未富集样品中硫醇小分子的检测，而本发明的SiO

然后用HPLC-MS/MS对第三步中的富集液进行定量检测分析。其中

液相条件为：色谱柱：Shim-pack*R-ODS Ⅲ (2.0mm×70mm，1.6μm)；柱温：40℃；流动相包括A相和B相，A相为含有0.1 %甲酸的水溶液，B相为甲醇，采用梯度洗脱：0.1 min，1%B相；5 min，升至5% B相；20 min，升至40% B相；21 min，升至95% B相；21～24 min，95% B相；25 min，降至5% B相；25～30 min，5% B相；31 min，降至1% B相；31～35 min，1% B相；流速：0.3mL·min

质谱检测条件为：质谱扫描模式：多反应监测；电喷雾离子源：正离子扫描；离子源电压：5500ev；离子源温度：550℃。

采用上述检测条件对本实施例的富集液进行检测，GSH和Hcy的离子对检测结果见表2，GSH和Hcy的HPLC-MS/MS谱图如图7所示。

表2 谷胱甘肽和同型半胱氨酸的离子对信息和质谱采集参数

注：*表示定量离子对

结合表2和图7可知，将本发明制备得到的SiO

由上可知，本发明不仅实现了GSH和Hcy的富集浓缩，还实现了GSH和Hcy的同时定量检测，克服了荧光方法中多个信号重叠相互干扰的情况，具有较大的推广价值。

需要强调的是，本发明合成的二氧化硅-金属有机骨架核壳型复合材料不仅适用于紫癜性肾炎患者尿液样品中硫醇小分子的检测，还适用于过敏性紫癜患者尿液样品，以及唾液等样品中硫醇小分子的定量检测。