一种几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用。

背景技术

木质纤维素是地球上储量最为丰富的可再生资源，也是唯一的可再生有机碳资源。木质纤维素的高效利用对缓解全球能源危机、减少温室效应和环境污染，实现人类社会的绿色可持续发展具有重要意义。木质纤维素一般由纤维素、半纤维素和木质素组成，它们通过共价键或非共价键相互结合。但由于其结构的复杂性，必须经过一系列预处理过程才能被微生物高效利用。预处理过程能脱除其中的木质素，水解半纤维素，同时降低纤维素结晶度使原料结构疏松，从而提高纤维素酶的酶解效率。与此同时，预处理会导致木质纤维原料发生一系列复杂的理化反应，不可避免地生成呋喃醛等结构多样的胁迫因子，严重阻碍了微生物的生长和后续发酵过程。

为了去除木质纤维素水解产物中的胁迫因子，研究者开发了多种物理、化学和生物方法。物理法是直接去除水解液中的有毒物质，而化学法和生物法在于将有毒物质转化为无毒物质。脱除胁迫因子的步骤不可避免地增加了生物炼制成本，使工艺过程更加复杂，同时还会导致部分可发酵糖的损失，所以该步骤必须工艺简单、成本低、能够特异性去除目标胁迫因子同时对可发酵糖含量影响不大。因此，本发明提供了一种几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种几丁质纳米纤维(PD-NCh)/壳聚糖(CS)复合凝胶微球在脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用。

发明思路：几丁质是一类来源于蟹壳、虾壳、硅藻、鱿鱼顶骨、管虫等废弃生物质的天然多糖，其脱乙酰基产物称之为壳聚糖，二者区别在于C2位上的官能团不同，几丁质和壳聚糖在C2位上分别被一个乙酰氨基和氨基所取代。本发明利用价格低廉的富含几丁质的废弃蟹壳为原料，通过简单工艺制备几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球，并将其应用于脱除木质纤维素水解液中的呋喃醛类胁迫因子，从而增强后续微生物在预处理水解液中的生长和代谢性能。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在木质纤维素水解液中脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用。

其中，所述呋喃醛类胁迫因子为糠醛和/或5-羟甲基糠醛。

优选地，所述几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在木质纤维素水解液中脱除呋喃醛类胁迫因子和乙酸。

具体地，将所述几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球加入到木质纤维素水解液中，孵育；优选地，所述孵育的温度为15-60℃，优选为25-45℃；优选地，所述孵育的转速为0-300rpm，优选为50-200rpm；优选地，所述孵育的时间为0-12h。

其中，所述木质纤维素水解液包括但不限于甘蔗渣水解液。

其中，所述木质纤维素水解液经几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球处理后，加入微生物，培养；优选地，所述木质纤维素水解液经几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球处理后，加入微生物和微生物生长所需的碳源以外的营养物质，培养。

其中，所述微生物为恶臭假单胞菌。

其中，所述微生物按照0.5％-3.5％的体积比接种到经几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球处理后的木质纤维素水解液；优选地，所述微生物按照2％的体积比接种到经几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球处理后的木质纤维素水解液。

其中，所述营养物质包括但不限于酵母提取物和胰蛋白胨；优选地，所述酵母提取物的终浓度为1-9g/L，优选为4-6g/L，进一步优选为5g/L；优选地，所述胰蛋白胨的终浓度为5-15g/L，优选为8-12g/L，进一步优选为10g/L。

其中，所述培养的温度为25-35℃，优选为30℃。

其中，所述培养的转速为100-400rpm。

其中，所述培养的时间为1-36h。

其中，所述几丁质纳米纤维的脱乙酰度为25％-35％，优选为32.31％。

其中，所述壳聚糖的脱乙酰度为55％以上，优选为85％。

其中，所述几丁质纳米纤维和壳聚糖可以是市场上直接购买的，也可以是按照如下方法从废弃蟹壳制备得到的。

其中，所述从废弃蟹壳制备壳聚糖的方法为：将废弃蟹壳剪小，先在1M的NaOH溶液下浸泡12-24h，用蒸馏水洗至中性后，再在1M的HCI溶液下浸泡12-24h，重复上述酸碱处理操作3-5次，除去矿物质和蛋白，之后用蒸馏水洗涤至中性。将洗涤后的物料浸泡于5-10g/L的NaClO

其中，所述从废弃蟹壳制备几丁质纳米纤维的方法为：用上述制得的几丁质原料，取几丁质原料浸泡于30-35％(w/w)的NaOH溶液中，在90℃、600rpm的条件下水浴2-3h，之后离心收集沉淀并将用蒸馏水将其洗涤至中性，此时原料的脱乙酰程度达到25％-35％，即为部分脱乙酰几丁质(DEChN)。用0.6-1％(v/v)的醋酸溶液在磁力搅拌下均匀分散DEChN，待溶液分散均一后，用醋酸将其pH调节至3.0左右，放入榨汁机中粉碎至匀浆状态，再用高压均质仪制备成几丁质纳米纤维。

其中，所述复合凝胶微球中，几丁质纳米纤维与壳聚糖质量比为(0.5：9.5)-(4：6)，优选为(1：9)-(3：7)。

其中，所述几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球的制备方法参见：刘亮,吕鹤婵,蒋杰,等.几丁质纳米纤维/壳聚糖复合气凝胶微球的制备与表征[J].南京工业大学学报(自然科学版),2016(2016年02):51-55.

优选，所述几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球的制备方法包括如下步骤：

(1)制备几丁质纳米纤维与壳聚糖总体积分数为5-20g/L的混合液；

(2)将步骤(1)制备的混合液，均匀滴入15-30g/L的三聚磷酸钠溶液中，静置，制备成复合凝胶微球。

步骤(2)中，所述混合液与三聚磷酸钠溶液的体积比为1：(3-7)；优选地，所述混合液与三聚磷酸钠溶液的体积比为1：5。

步骤(2)中，所述静置为静置0.5-2h。

步骤(2)中，制备成复合凝胶微球后用0.1-0.2M K

其中，所述复合凝胶微球中几丁质纳米纤维和壳聚糖总质量与呋喃醛类胁迫因子的质量比为1：(0.5-1.7)，优选为1：(0.7-1.5)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势，

(1)自然界中富含几丁质的废弃蟹壳来源广泛，价格低廉。

(2)几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球制备简单，不需要特殊或昂贵的设备与试剂。

(3)几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附呋喃醛类胁迫因子效率高。

(4)几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球与水解液易于分离，不会造成二次污染。

(5)几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球处理后的水解液用于微生物生长或发酵时，微生物代谢性能明显增强。

(6)本发明原材料成本低廉、工艺操作简单，吸附效果显著。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1是分别利用基于废弃蟹壳制备的复合凝胶微球处理后的模拟水解液和未处理的模拟水解液培养恶臭假单胞菌时，菌体生长差异。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述溶液若无特殊说明，其溶剂均为去离子水。

下述实施例中所述葡萄糖、木糖、糠醛、5-羟甲基糠醛(HMF)含量的检测方法如下：采用Agilent 1260型液相色谱仪，Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱(7.8mm×300mm)；流动相为5mM H

下述实施例中所述恶臭假单胞菌为Pseudomonas putida ATCC 47054。

实施例1：壳聚糖的制备

将废弃蟹壳剪小，先在1M的NaOH溶液下浸泡12h，用蒸馏水洗至中性后，再在1M的HCI溶液下浸泡12h，重复操作3次，除去矿物质和蛋白，之后用蒸馏水洗涤至中性。将洗涤后的物料浸泡于5g/L的NaClO

取几丁质原料浸泡于45％(w/w)的NaOH溶液中，在100℃、650rpm的条件下水浴5h，之后离心收集沉淀并将用蒸馏水将其洗涤至中性，真空干燥，此时原料的脱乙酰程度达到85％，即得壳聚糖。

实施例2：制备几丁质纳米纤维(PD-NCh)

将实施例1中制得的几丁质原料浸泡于35％(w/w)NaOH溶液中，在90℃、600rpm的条件下水浴3h，之后离心收集沉淀并将用蒸馏水将其洗涤至中性，此时原料的脱乙酰程度达到32.31％，含水量为78.53％，即为部分脱乙酰几丁质(DEChN)。

在磁力搅拌下，向500mL的1％(v/v)醋酸溶液中加入干重2.5g的DEChN，用醋酸调pH至3.0，待其溶液分散均匀后，放入榨汁机中粉碎至匀浆状态，再用高压均质仪制备成5g/L浓度的几丁质纳米纤维。在60℃，60rpm条件下用旋转蒸发仪将5g/L几丁质纳米纤维进行浓缩，再用恒重法测量浓缩后的几丁质纳米纤维浓度为8.5g/L。

实施例3：制备几丁质纳米纤维与壳聚糖(PD-NCh/CS)复合凝胶微球

在实施例1和实施例2基础上，制备100mL总体积分数为20g/L、质量比PD-NCh/CS为1：9的复合凝胶微球复合液。步骤如下：称取干重为0.2g的PD-NCh，在磁力搅拌下加入1％(v/v)的醋酸定容至100mL，待纳米纤维分散均匀，再加入1.8g壳聚糖在50℃水浴中边搅拌边溶解，待壳聚糖充分溶解后再放在磁力搅拌台上，搅拌2h，直至复合液呈均一状态，最后将混合液放于紫外灯下照射12h。

在制备微球前需将复合液在4000rpm下离心除气泡，再将混合液倒入注射器中，利用重力作用，将5mL的复合液缓慢滴入25mL浓度为20g/L的三聚磷酸钠溶液中，保持恒定液面距离，待溶液全部滴入三聚磷酸钠中后，冰浴下静置1h，在此过程中，微球由透明、扁平状沉淀到瓶底成为乳白色的圆球状。用纱布过滤掉三聚磷酸钠溶液，并用0.15M K

实施例4：制备几丁质纳米纤维与壳聚糖(PD-NCh/CS)复合凝胶微球

在实施例1和实施例2基础上，制备100mL总体积分数为20g/L、质量比PD-NCh/CS为2：8的复合凝胶微球复合液。步骤如下：称取干重为0.4g的PD-NCh，在磁力搅拌下加入1％(v/v)的醋酸定容至100mL，待纳米纤维分散均匀，再加入1.6g壳聚糖在50℃水浴中边搅拌边溶解，待壳聚糖充分溶解后再放在磁力搅拌台上，搅拌2h，直至复合液呈均一状态，最后将混合液放于紫外灯下照射12h。

在制备微球前需将复合液在4000rpm下离心除气泡，再将混合液倒入注射器中，利用重力作用，将5mL的复合液缓慢滴入25mL浓度为20g/L的三聚磷酸钠溶液中，保持恒定液面距离，待溶液全部滴入三聚磷酸钠中后，冰浴下静置1h，在此过程中，微球由透明、扁平状沉淀到瓶底成为乳白色的圆球状。用纱布过滤掉三聚磷酸钠溶液，并用0.15M K

实施例5：制备几丁质纳米纤维与壳聚糖(PD-NCh/CS)复合凝胶微球

在实施例1和实施例2基础上，制备100mL总体积分数为20g/L、质量比PD-NCh/CS为3：7的复合凝胶微球复合液。步骤如下：称取干重为0.6g的PD-NCh，在磁力搅拌下加入1％(v/v)的醋酸定容至100mL，待纳米纤维分散均匀，再加入1.4g壳聚糖在50℃水浴中边搅拌边溶解，待壳聚糖充分溶解后再放在磁力搅拌台上，搅拌2h，直至复合液呈均一状态，最后将混合液放于紫外灯下照射12h。

在制备微球前需将复合液在4000rpm下离心除气泡，再将混合液倒入注射器中，利用重力作用，将5mL的复合液缓慢滴入25mL浓度为20g/L的三聚磷酸钠溶液中，保持恒定液面距离，待溶液全部滴入三聚磷酸钠中后，冰浴下静置1h，在此过程中，微球由透明、扁平状沉淀到瓶底成为乳白色的圆球状。用纱布过滤掉三聚磷酸钠溶液，并用0.15M K

实施例6：几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附模拟水解液中的呋喃醛

模拟水解液成分(L)：木糖20g；葡萄糖5g；糠醛0.4g；HMF 1g；M9溶液(Na

实施例7：几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附模拟水解液中的呋喃醛

模拟水解液成分(L)：木糖20g；葡萄糖5g；糠醛0.4g；HMF 1g；M9溶液(Na

实施例8：几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附模拟水解液中的呋喃醛

模拟水解液成分(L)：木糖20g；葡萄糖5g；糠醛0.8g；HMF 1.5g；M9溶液(Na

实施例9：几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附模拟液中的呋喃醛模拟水解液成分(L)：木糖20g；葡萄糖5g；糠醛0.8g；HMF 1.5g；M9溶液(Na

实施例10：几丁质纳米纤维与壳聚糖复合凝胶微球吸附模拟液中的呋喃醛

模拟水解液成分(L)：木糖20g；葡萄糖5g；糠醛1g；HMF 2g；M9溶液(Na

实施例11：分别利用实施例7中用复合凝胶微球处理后的模拟水解液和未处理的模拟水解液培养恶臭假单胞菌

将恶臭假单胞菌在LB培养基中(酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L)，30℃、200rpm条件下活化12h，之后以2％(v/v)的转接量分别接种至凝胶微球处理后的模拟液和未处理的模拟液中，在30℃、200rpm的条件下培养12h，每隔2h取样测定菌体OD

实施例12：分别利用复合凝胶微球处理后的甘蔗渣水解液和未处理的甘蔗渣水解液培养恶臭假单胞菌

甘蔗渣水解液的制备：甘蔗渣晒干、磨碎、过筛，称取2g甘蔗渣粉末，与20mL质量分数为0.9％的稀硫酸混合，在150℃油浴中处理1h。油浴结束后离心过滤，留取上清液，用5MNaOH溶液调节水解液pH值为7.0，放于4℃冰箱中静置24h，之后再次离心除去不溶性杂质，所得上清即为甘蔗渣水解液。经HPLC检测，其成分为(g/L)：葡萄糖6.00；木糖19.03；乙酸6.08；HMF 0.28；糠醛1.23。

将实施例5中制得的复合凝胶微球添加至15mL甘蔗渣水解液中，在30℃、200rpm的条件下，反应2h后测定甘蔗渣水解液中糠醛和HMF的剩余量。最终复合凝胶微球对糠醛和HMF的去除率分别为80％和83％，同时还能去除33％的乙酸。

将恶臭假单胞菌在LB培养基中(酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L)，30℃、200rpm条件下活化12h，之后以2％(v/v)的转接量分别接种至凝胶微球处理后的甘蔗渣水解液和未处理的甘蔗渣水解液中，水解液中额外添加酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L。在30℃、200rpm的条件下培养24h，每隔3h取样测定菌体OD

本发明提供了一种几丁质纳米纤维-壳聚糖复合凝胶微球在脱除呋喃醛类胁迫因子中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。