一种羟基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法

技术领域

本发明涉及代谢组学分析技术，尤其是一种羟基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法。

背景技术

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在临床医学领域具有广泛的应用前景。代谢组学分析技术包括：NMR、GC-MS、CE-MS、LC-MS，这些技术虽然在一定程度上都能检测出代谢物，但是仍然存在诸多困难，如代谢物离子化效率低、质谱信号弱、定量缺少同位素内标、检测到的代谢物数量少、干扰多等问题。

例如，LC-MS采用液相色谱-质谱联用的方法进行分析，比较不同样本中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。而且，质谱(MS)并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此出现测不准问题。

为了解决上述问题，现有技术中有采用靶向代谢组学技术，对特定目标进行分析。靶向代谢组学是指：针对几种目标化合物或某条通路上涉及的全部或部分代谢物，利用标准品，构建特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，对目标化合物进行定量与分析。靶向代谢组学只重点研究已知可能具有生物学效应的几种或几类代谢物，因此其数据处理相比于非靶向代谢组学更为简单方便。例如，专利申请CN107085032A公开了一种化学衍生化基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)的分析方法，包括以下步骤：(1)小分子化合物：以二醛类化合物为连接臂，通过缩合反应修饰至氨基化合物上，使药物代谢产物结构衍生出醛基基团。(2)多肽衍生化小分子化合物：将醛类化合物、多肽以摩尔比50-100:1加入到pH为4-6的磷酸缓冲液中，在5-37℃下发生缩合反应，多肽的氨基酸序列N端半胱氨酸修饰，作为醛类化合物衍生化试剂。(3)MALDI-TOF-MS分析：样品衍生化按照1μL样品混合基质α-氰基-4-羟基肉桂酸CHCA点板，室温风干后进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，采用正离子反射模式。该方法使用二醛类化合物对含有氨基结构药物代谢物进行修饰，仅限于药物中的氨基代谢物的情况，虽然有同位素内标，但是不是为所有检测到的代谢物提供相应的同位素内标，因此仍然存在不准确问题。

相对的，非靶向代谢组学是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物(主要是相对分子量1000Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。由于非靶向代谢组学没有确定的靶向，因此，原始数据的差异性大，且数据量大，如何从其中获得理想的分析结果，是非靶向代谢组学所要解决的问题之一。

羟基类代谢物一般存在于绝大多数生物样本中，例如各类动物体液(血液、尿液、脑脊液等)、动植物组织样本、细胞等。中国发明专利申请CN1480726A公开了一种羟基化合物和巯基化合物的磺酰异氰酸酯柱前衍生化方法，在不含活泼氢的溶剂中，以磺酰异氰酸酯类化合物为衍生化试剂，对羟基化合物或巯基化合物进行柱前衍生化之后，加水终止反应，该方法中采用磺酰异氰酸酯，标记后的物质检测灵敏度有待提高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的代谢组学技术存在的问题，提供一种羟基类代谢物的衍生化方法，可以对含有羟基的一类代谢物进行衍生化标记，从而便于后续的液质分析进行代谢物的识别。该方法可检测的样本类型种类丰富，如血浆、血清、组织、细胞、尿液、毛发等，几乎覆盖全品类待检样品，因此运用对象广。

本发明中，羟基类代谢物的衍生化方法包括步骤1，主要是将代谢物从样本中使用第一溶剂进行提取，再将含有代谢物的溶剂干燥。提取的方法包括了血浆样本分析中的蛋白沉淀，组织匀浆处理等。用于提取的第一溶剂可以是水、甲醇等。对羟基类代谢物进行干燥，目的是除去溶剂干扰，得到没有溶剂的干燥样本，对于蛋白质含量较高的样品，例如血浆或血清、组织应先进行蛋白质沉淀，取上清液进行干燥获得干燥样本。对于蛋白质含量低的样本，例如尿液、细胞，可以省去蛋白质沉淀。对于尿液，若存在浑浊，则可以增加过滤操作，例如：将尿液样品在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，将获得的上清液采用0.2-0.3μm过滤器进行过滤，过滤后，取滤液用真空离心浓缩仪将获得的滤液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥。

需要说明的是，本发明步骤1奠定了后续步骤的基础，通过步骤1除去了各类代谢物中溶剂的干扰，降低了代谢物中蛋白质类干扰，确立了以可溶性代谢物作为衍生化及检测的方向。

本发明中，羟基类代谢物的衍生化方法包括步骤2，为衍生化处理，需要先将干燥样本复溶，采用第二溶剂，优选与后续液相色谱分离的洗脱剂相同。步骤2利用标记试剂与代谢物反应，获得衍生化样本。其中，反应原理如下：

其中，R代表任意化学基团，丹磺酰氯的作用在于作为标记试剂，和代谢物进行反应生成衍生化的代谢物；4-二甲氨基吡啶为反应激活试剂，作为优秀的离去基团，可进一步提高丹磺酰氯的标记能力，增强反应活性；NaOH为淬灭试剂，用于淬灭过量的所述标记试剂，如果不淬灭过量的所述标记试剂，多余的标记试剂会干扰并抑制代谢物检测的信号。淬灭后优选采用加入pH调节试剂，调节pH2.5-3.5。如果不进行pH调节，因为加了氢氧化钠，溶液的pH变高，如果不进行pH调节，会对色谱柱及仪器造成伤害。pH调节试剂优选甲酸，甲酸优势在于其酸性较弱，不会干扰代谢物检测，也不会对检测仪器造成损伤。

本发明采用丹磺酰氯，相比于常规标记试剂如磺酰异氰酸酯，丹磺酰氯标记更适合于液相色谱-质谱分析。丹磺酰氯中的芳香环结构，可显著提升衍生化后代谢物的疏水性，更适合于反向色谱分析；丹磺酰氯中的-N(CH

本发明还提供一种基于上述衍生化处理的非靶向代谢组学高效分析方法，该方法通过

具体方案如下：

一种羟基类代谢物的衍生化方法，包括以下步骤：

步骤1：待检测样品采用第一溶剂进行羟基类代谢物提取，之后进行干燥除掉第一溶剂，得到干燥样本；

步骤2：将所述干燥样本与第二溶剂混合，使所述干燥样本溶解，之后加入4-二甲氨基吡啶和丹磺酰氯，混合均匀后加热进行孵育；孵育完成后加入氢氧化钠，之后加热进行孵育，最后加入pH调节剂，获得衍生化样本。

进一步的，步骤1中，将待检测样品进行蛋白质沉淀处理后，进行离心处理取上清液，对所述上清液进行干燥，得到所述干燥样本；

任选的，所述第一溶剂为甲醇、水或者甲醇水溶液；

任选的，所述第二溶剂为所述衍生化样本进行液相色谱分离的洗脱剂，优选为乙腈水溶液。

进一步的，步骤1中，所述待检测样品为血浆或血清样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液，加入甲醇，进行涡旋处理，使蛋白完全沉淀，然后进行离心，取上清液，用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；

任选的，所述待检测样品为尿液样品，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；

任选的，所述待检测样品为组织样品，将组织样品与甲醇混合，进行匀浆处理，之后置于-20℃孵育10-15分钟；孵育结束后，在3-5℃、离心力>15000g的条件下离心10-20分钟，离心后取上清液；用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，直到产物中无溶剂时即停止干燥，得到所述干燥样本；

任选的，所述待检测样品为细胞样品，最少需要10

进一步的，步骤2中，4-二甲氨基吡啶为反应激活试剂，作为离去基团，提高丹磺酰氯的标记能力，增强反应活性；丹磺酰氯为标记试剂，加入4-二甲氨基吡啶和丹磺酰氯后，涡旋混匀后置于50-60℃条件下孵育60-70分钟；氢氧化钠为淬灭试剂，用于淬灭过量的所述标记试剂，加入氢氧化钠后，将混合溶液在50-60℃条件下孵育10-15分钟，最后加入pH调节剂，获得衍生化样本。

进一步的，加入氢氧化钠之后加热进行孵育，孵育完成后加入pH调节试剂甲酸，调节pH＝2.5-3.5，获得衍生化样本。

本发明还提供一种非靶向代谢组学高效分析方法，包括以下步骤：

步骤A：将待测对象等分成至少2份，分别采用所述羟基类代谢物的衍生化方法，进行衍生化，其中衍生化样本a采用的所述标记试剂为

步骤B：采用LC-UV装置，分别对所述衍生化样本a和所述衍生化样本b进行液相色谱串联紫外检测，获得图谱，定义所述衍生化样本a和所述衍生化样本b在所述图谱中特征峰的面积比为N，则将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：N的体积比混合，获得检测样本；

步骤C：将步骤B获得的所述检测样本送入LC-MS装置，进行液质分析，获得代谢物的特征峰图，所述代谢物以峰对的形式呈现在所述特征峰图中，通过所述特征峰图识别所述代谢物。

进一步的，步骤B中所述液相色谱串联紫外检测，液相色谱条件为：液相色谱采用C

进一步的，步骤C中所述液质分析的条件包括，液相色谱采用C

进一步的，步骤C中所述液质分析的条件包括，质谱扫描范围m/z＝220-1000。

进一步的，步骤C中，所述特征峰图中以单峰形式存在的物质为干扰噪声，不是真实的代谢物。

有益效果：

本发明提供的羟基类代谢物的衍生化方法，样品经过衍生化后，代谢物检测灵敏度升高，可同时检测到更多的代谢物，代谢物覆盖率更高。

进一步的，所述非靶向代谢组学高效分析方法，采用所述羟基类代谢物的衍生化方法处理后的，检测到的代谢物为一个峰对，为所有衍生化代谢物生成同位素内标，降低仪器漂移和基质带来的影响，消除噪声干扰，使得定量更精准。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1是本发明一个实施例1提供的尿浆样品特征峰图；

图2是本发明一个对比例1提供的尿浆样品特征峰图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

取尿液样品，在4℃、离心力＞15000g(12000rpm)的条件下离心15分钟，离心后取上清液至1.5mL离心管。用真空离心浓缩仪将获得的上清液完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，获得干燥样本。

如果尿液样品之前未进行过滤，则需要将上清液采用0.2μm过滤器进行过滤。过滤后，取滤液至离心管中。之后用真空离心浓缩仪进行干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，获得干燥样本。

下面结合非靶向代谢组学高效分析方法进行介绍，将上述干燥样本等分为3份，取其中2份进行衍生化处理，1份留样备查。2份中取1份干燥样本，加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后加入25μL反应激活试剂(4-二甲氨基吡啶)，40μL的

另取1份干燥样本里加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，然后加入25μL反应激活试剂(4-二甲氨基吡啶)，40μL的

采用LC-UV装置，分别对所述衍生化样本a和所述衍生化样本b进行液相色谱串联紫外检测，液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为甲酸的水溶液，流动相B为甲酸和乙腈的混合溶液，紫外检测条件为：检测波长338nm。通过LC-UV检测获得图谱，所述衍生化样本a和所述衍生化样本b在图谱中特征峰的面积比为1:1，则将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：1的体积比混合，获得检测样本。

需要说明的是，对于同一个人同一天的尿液样本，所述衍生化样本a和所述衍生化样本b在图谱中特征峰的面积比一般为1:1，此时将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b等体积混合即可。

对于同一个人不同时间取样的尿液样本，或者不同人的尿液样本，由于个体的差异性，即使是同样的代谢物也可能会存在特征峰强度的差别，此时所述衍生化样本a和所述衍生化样本b在图谱中特征峰的面积比N≠1。现有技术中，因个体在空间、时间上的差异，导致检测出代谢物的情况不一致的情况，往往造成误判，即同样健康的甲乙两人，按照常规方法标记后进行液质分析，出来的图谱存在显著差异，可能会出现甲携带肿瘤因子，乙没有患肿瘤的误判。

针对这一问题，本发明采用LC-UV装置，分别对所述衍生化样本a和所述衍生化样本b进行液相色谱串联紫外检测，获得图谱，定义所述衍生化样本a和所述衍生化样本b在图谱中特征峰的面积比为N，则将所述衍生化样本a和所述衍生化样本b按照1：N的体积比混合，可以避免代谢物浓度差异造成的误判。

将上述检测样本送入LC-MS装置，进行液质分析，具体条件参见表1，获得代谢物的特征峰图参见图1。

表1液质分析主要参数表

表1中洗脱梯度中，MPB代表流动相B，百分比皆为体积百分数。采用这种洗脱方法，大大缩短了样品的分析时间，提高分析效率，使分析通量提高。

从图1可以看到，检测到的代谢物以峰对的形式存在，峰对是指质谱图里会出现一个

另外，本方法为所有羟基类衍生化代谢物生成内标，除非代谢物中不含有羟基类代谢物，否则都会被检出，这样就实现了不预设检测目标，因此，相对常规靶向代谢组学检测方法而言，本发明所述方法获得数据的全面性更好，通过这些数据进一步分析的准确度更高。

实施例2

取血浆样品，在4℃、离心力>15000g(12000rpm)的条件下离心15分钟，离心后取上清液至0.5mL离心管；移取样品上清液30μL至相应的微量离心管中，在含有30μL样品的离心管中加入90μL预冷的LC-MS或HPLC级甲醇，对含有样品和甲醇的离心管进行充分涡旋，使蛋白完全沉淀，然后对离心管进行低速离心，使管内混合物沉于离心管底部。将涡旋后的混合物放置-20℃冰箱至少1小时；1小时后，将离心管从冰箱中取出，在离心力>10000g下离心15分钟，吸取90μL上清液至新的微量离心管中。用真空离心浓缩仪将90μL上清液完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，并于-80℃冰箱保存所获得的干燥样本，用于后续衍生化处理。说明：上述90μL上清液干燥大约需要1-2小时。任何残留的溶剂都会严重干扰化学标记反应，但干燥时间太长(例：干燥超过3小时)也会导致代谢物含量流失。

干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。

实施例3

取组织样品，称取组织重量，置于离心管中。如果样品太大，则切下原始样品，使样品的重量在150-200mg左右。向离心管中加入预冷的甲醇/水溶液按照500μL甲醇/水溶液溶液：100mg组织的比例，甲醇/水溶液为4:1，v/v。使用均质仪将组织样品匀浆15秒。必要时可根据样品类型调整匀浆速度和时间(例：质地较硬的组织需要更高的速率和更长的时间)。匀浆后，将样品放在-20℃冰箱孵育10分钟。孵育结束后，在4℃、离心力>10000g条件下离心10分钟。取上清液至离心管中，低速离心每个离心管，使管壁上的样品液滴沉于离心管底部。取上清液用真空离心浓缩仪将其完全干燥，离心管底部无溶剂时即停止干燥，并于-80℃冰箱保存所获得的样本，作为干燥样本。

干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。

实施例4

取哺乳动物细胞样品，最少需要10

干燥样本的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法参见实施例1。

对比例1

对比例1采用与实施例1相同的尿液样品进行分析，方法与实施例1基本相同，区别在于，不采用丹磺酰氯进行标记，由于没有丹磺酰氯标记，样品不具有紫外吸收和荧光特性，也就无法进行LC-UV定量及后续的样本混合调整操作。

具体来说，对比例1是将尿液样品获得的干燥样本等分后的备用样本，加入25μL质谱级的乙腈/水(3:1，v/v)复溶样本，之后直接送入LC-MS装置，进行液质分析，得到的特征峰图见图2。从图2可以看到，能够确认的代谢物种类激剧减少，且特征峰强度低，出现很多低强度的杂峰干扰，难以获得准确的检测结果。

对比例2

取实施例1中的尿液样品，具体处理方法如下：50μL尿液+10μL氯化钠(饱和的NaCl)+5μL盐酸(6M),加入150μL乙酸乙酯进行萃取，萃取2次，然后分离乙酸乙酯，合并两次分离的乙酸乙酯，氮气吹干，加入50μL乙腈进行溶解，25μL用于

标记方法及后续的检测方法同实施例1，得到的特征峰，与实施例1对比发现，对比例2检测到的峰对数量更少，说明对比例2采用的前处理方法，样品的回收率降低，虽然增加了乙酸乙酯进行萃取，增加了操作，但是检测准确性下降。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。