一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明属生命科学、生物医学领域，具体涉及应用于肿瘤治疗的一款多重机制协同和增效免疫治疗的广谱嵌合型溶瘤腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

溶瘤病毒介导的基因治疗对肿瘤细胞杀伤效率高、特异性好、安全性高、副作用小、成本低廉，使其成为继三大常规治疗方法(手术、放疗和化疗)以及免疫治疗之后的又一重要新兴肿瘤治疗模式。溶瘤病毒疗法最大的挑战，在于如何提高产品的安全性和有效性。通过一些安全的调控机制，能够保障溶瘤病毒很大程度上在肿瘤细胞内复制，而在正常细胞内不复制，肿瘤的靶向特异性提高，其安全性也就得到了保障。实现腺病毒靶向肿瘤细胞增殖杀伤的机制是丰富多样的，如早期第一代的溶瘤腺病毒(OAV)通过删除E1b-55kD蛋白基因实现靶向P53基因缺陷肿瘤细胞的特异性复制，之后第二代OAV采用各种肿瘤特异性启动子调控腺病毒增殖基因E1a或/和E1b的表达，发展至第三代OAV则是多种调控元件的联合应用。经过数代、多样化的改造，OAV针对肿瘤的特异性和有效性有所提高。从理论上讲，OAV作为载体携带抗癌基因，只要有肿瘤细胞存在，就能启动病毒增殖，抗癌基因随之高拷贝复制且高效率表达，继而产生病毒增殖溶瘤和基因表达抑癌的双重肿瘤杀伤效应，而且对正常细胞不产生影响。但在实际应用中，包括OAV在内的溶瘤病毒，其肿瘤靶向特异性以及破坏肿瘤细胞的效应，还没有达到人们的期望值，临床上单独应用溶瘤病毒治疗肿瘤的效果依然不理想。此外，由于受调控元件差异和抗癌基因选择的限制，OAV个性化程度较高，难以在异质性大的不同肿瘤中均产生较好的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有肿瘤免疫治疗对实体瘤效果不佳的难题，提供一款具有多重机制协同抗癌、能作为免疫检查点抑制剂和CAR-T/CAR-NK细胞治疗增效剂的嵌合型广谱溶瘤腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用。

第一方面，本发明提供了一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒同时表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子；所述溶瘤腺病毒其外壳蛋白Hexon由Ad5和Ad48两个血清型病毒的Hexon序列嵌合而成，其纤毛蛋白Fiber由Ad5和Ad11两个血清型病毒的Fiber序列嵌合而成；所述溶瘤腺病毒同时采用肿瘤特异性强势启动子和氧依赖元件开关，并删除Elb-55kD基因；所述溶瘤腺病毒同时敲除E1a-CR2、E1b-19kD、E3区部分蛋白编码序列。

作为本发明的一种优选实施方式，在所述溶瘤腺病毒的基因组中，IFN-γ和CCL5基因cDNA序列共有一个表达框，以人巨细胞病毒(hCMV)启动子驱动，IL-12基因cDNA序列表达框，以鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子驱动，两个表达框呈“脚对脚”排列。

更优选地，同时表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子的所述两个表达框和启动子的整体序列如SEQ ID NO:3的第29422-33108bp所示。

作为本发明的另一种优选实施方式，所述溶瘤腺病毒其外壳蛋白Hexon的编码序列如SEQ ID NO:3的第18327-21170bp所示。

作为本发明的另一种优选实施方式，所述溶瘤腺病毒其纤毛蛋白Fiber的编码序列如SEQ ID NO:3的第33373-34356bp所示。

作为本发明的另一种优选实施方式，所述溶瘤腺病毒的全基因组序列如SEQ IDNO:3所示。

第二方面，本发明提供了一种同时表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子的溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒的基因组中，IFN-γ和CCL5基因cDNA序列共有一个表达框，以人巨细胞病毒(hCMV)启动子驱动，IL-12基因cDNA序列表达框，以鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子驱动，两个表达框呈“脚对脚”排列。

作为本发明的一种优选实施方式，同时表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子的所述两个表达框和启动子的整体序列如SEQ ID NO:3的第29422-33108bp所示。

第三方面，本发明提供了如上所述的多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒或如上所述的同时表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子的溶瘤腺病毒在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。

作为本发明的一种优选实施方式，所述癌症或者肿瘤为乳腺癌、肝癌、胆囊癌、胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、大肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌或头颈癌。

本发明提供第四代基于4T技术(4triple-construction techniques)的OAV设计方案，尽最大可能将OAV抗癌疗效和生物安全性提高到一个新高度。主要特点如下：

1)三重装载(Triple Transgene)：本发明提供的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，同时在腺病毒E3区装载3个抗癌基因，其中包括2个增强免疫的细胞因子基因(IL-12和IFN-γ)和1个免疫细胞趋化因子基因(CCL5)，建立OAV联合免疫治疗协同增效的直接的、主动的分子机制。以OAV为载体装载抗癌基因，有助于抗癌基因在癌细胞内特异性高拷贝复制和高效率表达。但选择装载的抗癌基因，不仅仅满足于抗癌疗效叠加的要求，更优的方案是建立能与OAV本身、肿瘤微环境、机体免疫系统互作的协同机制。肿瘤微环境的抑制状态是实体瘤免疫治疗的主要障碍，有研究证实，溶瘤病毒感染的肿瘤细胞能释放大量细胞因子，裂解的肿瘤细胞还能释放多种肿瘤相关抗原，这些细胞因子和肿瘤抗原不但具有免疫激活作用，也能改变肿瘤微环境，不仅能增强放化疗作用，同样能提高免疫检查点分子的抗体治疗和免疫细胞治疗的效果(Oncoimmunology 2015,4:e988098)。但现有溶瘤病毒提高免疫治疗的作用是有限的、缺乏直接的协同增效机制。本发明所提供的OAV，表达IL-12、IFN-γ和CCL5三个因子，具有主动的、直接的增效免疫检查点抑制剂和CAR-T/CAR-NK细胞治疗疗效的协同机制。首先，OAV装载2个增强免疫的细胞因子IL-12和IFN-γ，由于PD-1抗体、PD-L1抗体治疗时需要激活T细胞才能发挥抗癌作用，这个过程先由树突状细胞(DC)合成分泌IFN-γ和IL-12，这两个细胞因子与T细胞进行信息交流，才能激活T细胞的杀伤活性(Immunity.2018,49:1148-1161.e7)。但肿瘤微环境中常常缺乏DC，IFN-γ和IL-12分泌量不足。当OAV装载增强免疫的细胞因子IL-12和IFN-γ，在OAV与PD-1抗体联用时无需DC参与，病毒表达的IL-12和IFN-γ可直接激活微环境杀伤性T细胞而快速发挥抗癌疗效。在与CAR-T/CAR-NK连用时，OAV表达的IL-12能延长CAR-T/CAR-NK细胞存活时间，IFN-γ能增强CAR-T/CAR-NK杀伤活性。当然，IL-12和IFN-γ本身也具有很强的抗癌活性，IFN-γ是老牌的抗癌免疫因子，能诱导Interlukins、TNF等多种细胞因子表达。IL-12是肿瘤免疫治疗的新宠，能提高机体保护性免疫应答水平，促进刺激T细胞及NK细胞增殖和激活，诱导分泌IFN-γ等多种细胞因子。其次，OAV装载免疫细胞趋化因子CCL5，可趋化NK、T细胞(包括CAR-T/CAR-NK)、DC等多种免疫细胞迁移到肿瘤内积聚(Cell 2018,172:1022-1037)。在OAV与PD-1抗体联用时，CCL5可增加肿瘤微环境中NK、T细胞、DC等细胞数量，协同增强杀伤癌细胞的作用。在与CAR-T/CAR-NK连用时，CCL5既可趋化更多CAR-T/CAR-NK细胞进入肿瘤区，也能促进趋化来的NK、T细胞、DC等细胞协同增强CAR-T/CAR-NK功能。实验证实，三个因子在溶瘤病毒基因组中的排列连接顺序对其抗肿瘤活性有明显的影响，通过比较三个因子多重组合排列顺序的溶瘤病毒抑制肿瘤细胞的活性，最终确定抗癌活性最佳的VirRon中三因子排列顺序，即：VirRon装载的IFN-γ和CCL5基因cDNA序列共有一个表达框，以人巨细胞病毒(hCMV)启动子驱动，IFN-γ和CCL5基因cDNA序列间由T2A连接。VirRon装载的IL-12基因cDNA序列表达框，以鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子驱动。两个表达框呈“脚对脚”排列。两个表达框分别选择人和鼠两个不同的巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，可避免相同序列重复造成的不可预见的高级结构影响病毒的包装成功率和抗癌活性。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的IFN-γ基因cDNA编码序列(不包含终止密码子)的反向互补序列如SEQ ID NO:3的第32263-32760bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的IL-12基因cDNA编码序列如SEQ ID NO:3的第29973-31583bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的CCL5基因cDNA编码序列的反向互补序列如SEQ ID NO:3的第31924-32199bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的IFN-γ和CCL5基因cDNA序列共有一个表达框，IFN-γ和CCL5基因cDNA序列间由T2A连接，其T2A序列的反向互补序列如SEQ ID NO:3的第32200-32262bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的IFN-γ和CCL5基因cDNA序列共有一个表达框，以人巨细胞病毒(hCMV)启动子驱动。其hCMV启动子编码序列的反向互补序列如SEQ ID NO:3的第32767-33108bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的IL-12基因cDNA序列表达框，以鼠巨细胞病毒(mCMV)启动子驱动。其mCMV启动子序列如SEQ ID NO:3的第29422-29944bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其装载的抗癌基因并不限于IL-12、IFN-γ和CCL5，还包括其他具有抗癌活性的细胞因子、免疫因子、抑癌基因、自杀基因、抗体基因等及其突变体改构序列；其多基因连接方式不限于T2A序列，还包括F2A、P2A、IRES等序列及其突变体；其采用的启动子不限于mCMV和hCMV，还包括其他具有基因驱动功能的启动子、增强子及其突变体序列。

2)三重嵌合(Triple Chimerism)：本发明提供的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，同时应用B亚属Ad11血清型的腺病毒Fiber编码序列和D亚属Ad48血清型的腺病毒Hexon编码序列，与C亚属Ad5型腺病毒骨架相应序列嵌合，构建出三个血清型嵌合的OAV，实现了在一个治疗系统上同时提高病毒对肿瘤细胞感染效率、避免病毒被机体预存中和抗体拦截、降低机体肝细胞对病毒的粘附摄取三大优势。人类腺病毒家族有52个血清型，分6个亚属(A至F)。除了B组以外，各组腺病毒都用柯萨奇病毒腺病毒共用受体(Coxsackievirus-adenovirus receptor，CAR)作为其主要吸附受体，对缺乏CAR的骨髓造血细胞、造血干细胞、树突状细胞、部分肿瘤细胞尤其是肿瘤干细胞等感染效率很低。B组腺病毒(Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34-35、Ad50、Ad55等)则主要识别一种广泛表达的补体调节蛋白CD46。采用B组腺病毒的纤毛蛋白(fiber knob)替代Ad5纤毛蛋白，构建嵌合病毒，使之增加识别CD46受体的能力，则有利于提高病毒对肿瘤细胞感染效率，特别是感染肿瘤干细胞的能力，有可能更彻底地根除肿瘤复发的根源；Ad5在自然界存在较广，大多数人已被感染并产生了中和抗体，能够拦截相同血清型的病毒。况且Ad5具有嗜肝细胞性，能够被肝细胞吸附。腺病毒外壳蛋白Hexon的高变区(HVR)因位置暴露于腺病毒表面，是导致不同血清型腺病毒之间对肝脏感染能力和免疫原性差异的关键部位。将Ad5的Hexon分子内7个HVR(L1：HVR1-6；L2：HVR7)选择性地与稀有血清型如D亚群(Ad8-10、Ad25-30、Ad36-39、Ad42-49、Ad51等)病毒的Hexon相应区域进行嵌合，是帮助Ad5逃避预存免疫和肝脏摄取的有效方法。然而，Hexon作为腺病毒的主要结构蛋白，对其进行改造往往会导致腺病毒载体结构不稳定，从而无法有效地包装病毒，因此这是一项很具有挑战性的研究。我们前期通过深入研究，设计多个Ad5和Ad48血清型病毒的Hexon编码序列片段进行组合，进行病毒重组包装和扩增测试，终于攻克了这项技术难关，构建成功多个Hexon替代的嵌合型腺病毒载体骨架，能有效包装目的病毒颗粒。Ad48腺病毒Hexon的嵌合则能保证OAV逃避机体预存中和抗体的拦截以及肝细胞对腺病毒的粘附和摄取。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其B亚属Ad11血清型腺病毒纤毛蛋白(Fiber)编码序列与C亚属Ad5型腺病毒Fiber相应序列嵌合的嵌合型纤毛蛋白(Ad5F11b)的序列如SEQ ID NO:3的第33373-34356bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其D亚属Ad48血清型腺病毒六邻体(Hexon)编码序列与C亚属Ad5型腺病毒Hexon相应序列嵌合的嵌合型Hexon(Ad5H48)的序列如SEQ ID NO:3的第18327-21170bp所示。

本发明所述的多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒，其血清型嵌合并不限于C亚属Ad5与B亚属Ad11、D亚属Ad48的嵌合，还包括其他亚属其他血清型的相互嵌合改造。

3)三重调控(Triple Regulation)：本发明提供的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，同时采用肿瘤特异性强势启动子和氧依赖元件开关，并删除Elb-55kD基因，构建在转录和翻译水平上具有双重安全调控机制的OAV产品。实现OAV对肿瘤细胞特异性增殖复制的机制之一，是以肿瘤特异性启动子作为顺式元件控制腺病毒增殖必需基因的表达。通过研究腺病毒E1a、E1b与癌细胞分子互作的机制，在启动子、增强子调控元件中优选调控模块组合，由肿瘤特异性广谱启动子在转录水平上控制腺病毒E1a基因只在肿瘤细胞内表达；E1a末端融合氧依赖元件开关，E1a蛋白在肿瘤缺氧环境中被保护，而在正常组织常氧状态下则被蛋白酶体降解，在翻译水平上有效防止E1a蛋白在正常细胞中表达的渗漏；Elb转录单元编码Elb-55kD和Elb-19kD，Elb-55kD是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中非必需的蛋白，Elb-55kD编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。Elb-55kD蛋白能够灭活并降解P53蛋白，Elb-55kD缺失有利于细胞保持P53的抗肿瘤活性，同时提高病毒载体的靶向性。因此在上述调控机制的三重控制下，VirRon的安全性和有效性得到提高。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其肿瘤特异性广谱启动子核心序列截取于BIRC5基因5’-UTR区域转录起始位点“-857～+4bp”片段，全长序列如SEQ ID NO:3的第467-1388bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon及其应用，其氧依赖元件ON/OFF开关序列如SEQ ID NO:3的第2376-2423bp所示。

我们前期已克隆、研究、保存了20多种肿瘤特异性的基因启动子、增强子及其突变体序列，本发明所述的多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒，其调控元件包括Ki67、hTERT、CEA、AFP、EGFR、DF3/MUC1、VEGFR、E2F、GFAP、Survivin等因子的启动子、增强子及其突变体序列，还有HIF-1缺氧反应元件(HRE)、Egr-l辐射敏感元件(CArG)、hTERT内部E-box、氧依赖开关ODD等调控序列，以及上述序列的组合应用。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，删除其Elb转录单元中Elb-19kD全部编码序列以及Elb-55kD编码序列第1个密码子到437个密码子，Elb-55kD剩余编码序列如SEQ ID NO:3的第2818-2997bp所示。

4)三重改造(Triple Modification)：本发明提供的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，同时敲除E1a-CR2、E1b-19kD、E3区部分蛋白编码序列。OAV构建以致病力最弱的人类腺病毒C亚属中的5型血清型(Ad5)为基础，保留E1a蛋白表达并使其受肿瘤特异性启动子调控，实现针对肿瘤的特异性复制。E1a有3个功能区，即CR1、CR2、CR3，CR1区通过与转录调节因子P300/CBP结合能抑制Her-2/neu基因的表达，CR2区与Rb蛋白家族结合，CR3区是转录活化区。因此E1a蛋白本身就具有抗肿瘤作用，既可以通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高p53的表达，又可以抑制Ⅳ型胶原酶、纤溶酶原激活剂等蛋白酶基因表达；E1a还能引起非特异性免疫反应，提高CTL细胞、NK细胞、巨噬细胞的杀伤效应等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。对E1a的CR2区引入12个碱基的缺失突变，使其不能结合Rb蛋白，保证去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F形成复合物，阻断E2F的转录活性，可以释放E1a内在抗癌机制，增强产品抗癌活性；Elb-19kDa基因与凋亡抑制基因Bcl-2同源，Elb-19kD蛋白能够结合Bax或/和Bak启动下游的凋亡抑制程序，保护感染的细胞免受TNF-α介导的杀伤作用。Elb-19kD缺失，因而该病毒突变体在肿瘤细胞内增殖的特异性得以提高，而在正常细胞内的增殖活性被削弱。Elb-19kD缺失能够促进癌细胞凋亡通路的恢复，且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使OAV特异性更好，效能更强；E3转录单位有9个开放读框，编码蛋白保护感染细胞免受宿主免疫反应的杀伤，E3-gpl9k可减弱CTL介导的感染细胞杀伤效应；RID可阻断“死亡”配体包括TNF、Fas配体和TRAIL介导的细胞凋亡；RID还可抑制IL-1和TNF介导的细胞存活所必须的NF-κB的激活；E3-6.7k除了使TRAIL受体下调之外还可单独抑制外部和内部信号通路诱导的细胞凋亡；E3-14.7k是TNF介导细胞凋亡的广泛抑制剂，也可结合并抑制Caspases-8从而阻止Fas信号通路启动的细胞凋亡；E3-14.7k与受感染的细胞内FIP蛋白(for 14.7K-interacting protein，FIP-1、-2、-3)作用，可使E3-14.7k蛋白在细胞凋亡和存活、炎症反应、维持膜稳定、核浆转运等信号转导通路中处于重要地位，这一多功能的E3蛋白的分子机制仍需深入研究。腺病毒死亡蛋白(ADP)可促进细胞溶解以及病毒释放，然而分子机制不明。由此可见，在OAV构建过程中删除E3区同时保留ADP基因，既可以扩大载体容量，又能够促进受感染的癌细胞的凋亡，并有利于促进OAV溶解癌细胞以及子代病毒释放。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，敲除其E1a-CR2中12个碱基“cacgaggctggc”，并且突变型E1a(mE1a)序列终止密码子前插入氧依赖元件开关，其序列如SEQ ID NO:3的第1405-2426bp所示。

本发明所述一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒，其病毒结构蛋白的改造不限于E1a-CR2、E1b-19kD、E3区部分蛋白编码序列的敲除，还包括E1a、E1b、E3以及其他蛋白的缺失、插入、突变等改造。

综上所述，本发明所述的多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒，是全新一代OAV产品，实现了真正意义的多重机制协同增效的目的，特异性好，抗癌活性强，对多种实体瘤具有明显的治疗效果，克服了以往溶瘤腺病毒单独使用疗效不佳和抗瘤谱窄的问题，既具有单独应用的良好抗癌效果，也能作为免疫检查点抑制剂和CAR-T/CAR-NK细胞治疗增效剂，协同免疫治疗大幅提高实体瘤的疗效。其创新性意义如下：

1、多重机制精准调控OAV增殖提高其安全性和有效性：以肿瘤特异性广谱启动子控制腺病毒增殖基因E1a表达，在转录水平增强OAV针对肿瘤细胞的特异性复制活力；在E1a蛋白内部融合氧依赖元件开关，保证E1a在正常组织常氧状态下被降解，在翻译水平限制病毒在正常细胞内复制；选择性缺失Elb-55kD可使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力；Elb-19kD缺失能够促进癌细胞凋亡通路的恢复，有利于病毒在正常细胞内的快速清除，在肿瘤细胞内的快速释放；E3区的部分编码蛋白敲除和ADP基因保留，达到保护腺病毒长期生存并介导抗癌基因高效表达的目的。多重机制协同，共同提高OAV安全性和有效性。

2、激活病毒内在抗肿瘤机制协同提高OAV溶瘤作用和抗癌疗效：腺病毒E1a蛋白本身即具有抗肿瘤作用，既可以通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高p53的表达，又可以抑制Ⅳ型胶原酶、纤溶酶原激活剂等蛋白酶基因表达；E1a还能引起非特异性免疫反应，提高CTL、NK、巨噬细胞的杀伤效应等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。在此基础上，对E1a的CR2区引入缺失突变，使其不能结合Rb蛋白，保证去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F形成复合物，阻断E2F的转录活性，可以增强抗癌活性。特别是OAV感染癌细胞释放大量细胞因子，裂解癌细胞释放大量肿瘤相关抗原，发挥进一步的免疫激活作用。局限于癌细胞表达的病毒蛋白，类似于肿瘤特异抗原，还能发挥抗癌疫苗的功能。

3、三个血清型腺病毒嵌合形成的OAV提高其感染力并能有效逃避免疫拦截和肝脏摄取：采用B组腺病毒纤毛蛋白(fiber knob)与Ad5纤毛蛋白嵌合，有利于提高病毒对癌细胞特别是对肿瘤干细胞的感染效率。将Ad5的Hexon分子内HVR区选择性地与D亚群病毒的Hexon相应区域嵌合，有助于病毒逃避人体中和抗体拦截和肝细胞摄取。

4、建立免疫调节肿瘤微环境的多机制协同增效的治疗策略并在研究中获得明确疗效：以OAV为载体装载抗癌基因，有助于抗癌基因随病毒增殖在癌细胞内特异性高拷贝复制和高效率表达。通过表达能激活肿瘤微环境免疫的抗癌基因或免疫调节基因，研制多机制协同抗癌的高效OAV新产品，能够与免疫检查点抑制剂治疗和免疫细胞治疗等多种治疗手段具有协同增效，在提高病毒安全性和有效性方面实现多重重大突破，达到广谱、特异、安全、高效的抗癌效果。

附图说明

图1.腺病毒右臂骨架质粒pPE3F11bH48-RC(+)结构图。

图2.腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVP-mE1aODD结构图。

图3.外源基因穿梭质粒pENTR12-C3结构图。

图4.溶瘤腺病毒VirRon基因组结构图。

图5.溶瘤病毒VirRon在肝癌、乳腺癌、胆囊癌、肺癌细胞系增殖活性高，增殖倍数在感染后96h介于10

图6.溶瘤病毒VirRon对细胞杀伤作用的曲线图，显示VirRon在较低MOI值时即对多种实体瘤细胞均有明显的杀伤抑制作用，而对正常成纤维细胞BJ无杀伤活性。

图7.溶瘤病毒VirRon对细胞杀伤作用的IC50值比较，显示VirRon对多种实体瘤细胞杀伤抑制作用的IC50值较低，而对正常成纤维细胞BJ杀伤的IC50值高达1090。

图8.溶瘤病毒VirRon表达“IL-12+IFN-γ+CCL5”三个抗癌基因，随时间延长表达量逐渐增高。

图9.溶瘤腺病毒VirRon中三个抗癌基因排列连接顺序对其包装效率和抗癌活性的影响。

图10.溶瘤腺病毒VirRon中嵌合型Hexon(Ad5H48)片段组合对其包装和扩增效率的影响。

图11.溶瘤病毒VirRon抗肝癌HCCLM3裸鼠移植瘤的实验。

图12.溶瘤病毒VirRon抗乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的实验。

图13.溶瘤病毒VirRon抗胆囊癌SGC996裸鼠移植瘤的实验。

图14.VirRon联合PD-1抗体治疗结肠癌移植瘤的人源化小鼠模型实验。

图15.VirRon联合CAR-T细胞治疗前列腺癌移植瘤的NCG小鼠模型实验。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1本发明的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon的研制

本发明所述的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，由腺病毒右臂质粒、腺病毒左臂质粒和外源基因穿梭质粒重组而成。现介绍这3个质粒及重组过程，具体如下：

(1)腺病毒右臂骨架质粒

腺病毒右臂骨架质粒pPE3F11bH48-RC(+)由加拿大Microbix Biosystems公司提供的pBHGlox(delta)E13Cre质粒(Catalog no.PD-01-40)和pBHGE3质粒(Catalog no.PD-01-12)改建而来。将pBHGE3含有部分E3区序列的SpeI+NotI酶切片段以及合成的ADP基因序列(如SEQ ID NO:3的第30901-31182bp所示)，插入到pBHGlox(delta)E13Cre的SpeI+PacI位点间，构建pPE3质粒。将合成的attR1+ccdB+attR2序列(949bp，SEQ ID NO:1)插入到pPE3的PacI位点，将合成的Ad5F11b片段替换Ad5-Fiber序列，将合成的Ad5H48片段替换Ad5-Hexon序列，最终构建pPE3F11bH48-RC(+)质粒(图1)。pPE3F11bH48-RC(+)全长36591bp，其纤毛蛋白(Ad5F11b)由Ad5和Ad11血清型腺病毒相应序列嵌合而成(如SEQ ID NO:3的第33373-34356bp所示)，其六邻体蛋白(Ad5H48)由Ad5和Ad48血清型腺病毒相应序列嵌合而成(如SEQ ID NO:3的第18327-21170bp所示)。

(2)腺病毒左臂穿梭质粒

腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVP-mE1aODD由加拿大Microbix Biosystems公司提供的pXC1质粒(Catalog no.PD-01-03)改建而来。在pXC1的E1a起始密码子上游12bp处引入BglII酶切位点，构建pXC2。合成BIRC5基因5’-UTR区域转录起始位点“-857～+4bp”片段、突变型E1a及氧依赖元件开关序列(mE1a-ODD)，共2355bp(如SEQ ID NO:3的第467-2821bp所示)，插入到pXC2的2个BglII位点之间，替换pXC2中的E1a和E1b序列，构建成pAdSVP-mE1aODD，全长9402bp(图2)。

(3)外源基因穿梭质粒

穿梭质粒pENTR12由美国Invitrogen公司提供的pENTR11质粒(Catalogno.11819-018)改建而来。在pENTR11的NcoI和EcoRV酶切位点之间引入“mCMV启动子+SpeI/EcoRI/HindIII/BglII/NheI/BamHI/SalI+Poly(A)”序列(SEQ ID NO:2)，替换原pENTR11质粒中的多克隆位点和ccdB基因序列，构建成新的质粒pENTR12。在pENTR12多克隆位点EcoRI和EcoRV之间插入IL-12表达框和IFN-γ+CCL5表达框，双表达框呈“脚对脚”排列，构建成外源基因穿梭质粒pENTR12-C3，全长5985bp(图3)。最终由pENTR12-C3转移到VirRon基因组中包含IL-12表达框和IFN-γ+CCL5表达框的NcoI和EcoRV位点之间的完整序列(含位点序列)如SEQ ID NO:3的第29401-33114bp所示。

(4)VirRon病毒的重组包装程序

VirRon病毒的重组包装以腺病毒右臂质粒pPE3F11bH48-RC(+)为骨架，经两轮特异性重组包装而成。首先用外源基因穿梭质粒pENTR12-C3与腺病毒右臂骨架质粒pPE3F11bH48-RC(+)在DB3.1大肠杆菌感受态细菌内发生第一轮attL/attR位点特异性重组，将pENTR12-C3中的外源基因表达框转移到pPE3F11bH48-RC(+)的E3区；然后再用腺病毒左臂穿梭质粒pAdSVP-mE1aODD与第一轮重组的产物在293T细胞内发生第二轮序列特异性重组，将pAdSVP-mE1aODD中的肿瘤特异性启动子控制的mE1aODD表达框转移到腺病毒右臂骨架质粒的E1区。经过两轮特异性重组，准确快速地包装出理想的溶瘤腺病毒VirRon。溶瘤腺病毒VirRon结构图如图4所示。本发明所述的多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，其完整序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例2本发明的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon的细胞学实验

本发明所述的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon，能够特异性地在肿瘤细胞内增殖复制，介导抗癌基因高效表达，最后破坏或抑制肿瘤细胞。

(1)溶瘤腺病毒VirRon的特异性增殖复制

收集对数生长期的实体瘤细胞系以及正常细胞系，铺96孔板，1×10

(2)溶瘤腺病毒VirRon对肿瘤细胞的特异性杀伤抑制

通过CCK8实验检测溶瘤腺病毒VirRon对肿瘤细胞和正常细胞的特异性杀伤抑制。收集对数生长期的肿瘤细胞系以及正常细胞系，铺96孔板，1×10

表1.溶瘤腺病毒VirRon对培养细胞的杀伤作用(IC50对比)

(3)溶瘤腺病毒VirRon介导抗癌基因的表达

收集对数生长期的实体瘤细胞系以及正常细胞系，铺6孔板，1×10

(4)溶瘤腺病毒中抗癌基因排列连接顺序对其包装效率和抗癌活性的影响

溶瘤腺病毒VirRon装载三个抗癌免疫因子IL-12、IFN-γ、CCL5，三个因子的排列连接顺序对病毒包装成功率和抗癌活性都有明显影响。通过设计构建三个因子不同排列顺序的穿梭质粒(V1～V4)，与腺病毒骨架质粒重组，在HEK293细胞中包装溶瘤腺病毒(图9A)。结果发现，V1观察至第13天，细胞未出现噬斑病变，病毒包装不成功；V2和V3在第11天、V4在第7天分别出现噬斑，病毒重组成功(图9B)。在噬斑出现后48h收集细胞上清，ELISA检测三个因子的表达，V2、V3、V4表达IL-12和CCL5水平较高，但V2表达IFN-γ表达量极低，显著低于V3和V4(图9C)。培养肺癌A549细胞，以梯度(MOI＝0.01～1000pfu/cell)感染强度感染V2、V3、V4病毒，采用CCK-8试剂盒检测72h病毒对细胞增殖活性的影响，证实V4对A549细胞的抑制效应最明显(图9D)。最终确定V4(即VirRon)中三个因子的排列连接顺序既有利于病毒的重组包装和基因表达，也有益于提高病毒的抗癌活性。

(5)溶瘤腺病毒中嵌合型Hexon(Ad5H48)片段组合对其包装和扩增效率的影响

溶瘤腺病毒VirRon的外壳蛋白Hexon(Ad5H48)由Ad5和Ad48两个血清型病毒的Hexon序列嵌合而成，目的是避免体内预存Ad5型病毒中和抗体的拦截和肝脏对病毒的吸附。Ad5H48编码cDNA全长2844bp，我们设计了3种不同片段组合的嵌合方式，在HEK293细胞中进行病毒重组包装和扩增(图10A)。实验发现，Ad5H48-1(即VirRon)在第7天出现细胞噬斑，Ad5H48-2观察至第14天未出现噬斑病变，Ad5H48-3在第12天出现噬斑，证实Ad5H48-1(即VirRon)出毒最快(图10B)。Ad5H48-1和Ad5H48-3以MOI＝10pfu/cell感染HEK293细胞，96h后分别收集细胞和上清，TCID50法检测病毒滴度，无论是细胞内还是上清中Ad5H48-1滴度都高于Ad5H48-3(图10C)。最终证实Ad5H48-1(即VirRon)包装和扩增效率最佳。

实施例3本发明的一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒VirRon的动物学实验

(1)VirRon抗肝癌的动物模型实验

健康纯种BALB/C裸鼠30只，4周龄，雄性，上海诚勤生物科技有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2012-0002。取对数生长期肝癌HCCLM3细胞悬液注射于裸鼠右腋皮下，5×10

(2)VirRon抗乳腺癌的动物模型实验

健康纯种BALB/C裸鼠30只，4周龄，雌性，上海诚勤生物科技有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2012-0002。取对数生长期乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液注射于裸鼠右腋皮下，5×10

(3)VirRon抗胆囊癌的动物模型实验

胆囊癌恶性度高、进展速度快，除手术外临床无治疗措施。通过建立SGC-996快速增长的移植瘤模型，观察VirRon治疗的疗效及协同机制。健康纯种BALB/C裸鼠40只，4周龄，雄性，上海诚勤生物科技有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2012-0002。取对数生长期胆囊癌SGC-996细胞悬液注射于裸鼠右腋皮下，5×10

(4)VirRon联合PD-1抗体治疗结肠癌移植瘤的人源化小鼠模型实验

健康C57-hPD1人源化小鼠，雌性，5-6周龄，46只，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，右侧背部皮下接种小鼠结肠癌细胞系MC38细胞1×10

(5)VirRon联合CAR-T细胞治疗前列腺癌移植瘤的NCG小鼠模型实验

CAR-T细胞由徐州医科大学肿瘤研究所制备，靶点为B7-H3。健康NCG小鼠，雄性，4-5周龄，19只，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，右侧背部皮下接种前列腺癌细胞系Du145细胞3×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏万戎生物医药科技有限公司

<120> 一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒及其在肿瘤

治疗中的应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taaacaagtt tgtacaaaaa agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata 60

ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag 120

tcactatggc ggccgatctg gatccggctt actaaaagcc agataacagt atgcgtattt 180

gcgcgctgat ttttgcggta taagaatata tactgatatg tatacccgaa gtatgtcaaa 240

aagaggtgtg ctatgaagca gcgtattaca gtgacagttg acagcgacag ctatcagttg 300

ctcaaggcat atatgatgtc aatatctccg gtctggtaag cacaaccatg cagaatgaag 360

cccgtcgtct gcgtgccgaa cgctggaaag cggaaaatca ggaagggatg gctgaggtcg 420

cccggtttat tgaaatgaac ggctcttttg ctgacgagaa cagggactgg tgaaatgcag 480

tttaaggttt acacctataa aagagagagc cgttatcgtc tgtttgtgga tgtacagagt 540

gatattattg acacgcccgg gcgacggatg gtgatccccc tggccagtgc acgtctgctg 600

tcagataaag tctcccgtga actttacccg gtggtgcata tcggggatga aagctggcgc 660

atgatgacca ccgatatggc cagtgtgccg gtctccgtta tcggggaaga agtggctgat 720

ctcagccacc gcgaaaatga catcaaaaac gccattaacc tgatgttctg gggaatataa 780

atgtcaggct cccttataca cagccagtct gcaggtcgac catagtgact ggatatgttg 840

tgttttacag tattatgtag tctgtttttt atgcaaaatc taatttaata tattgatatt 900

tatatcattt tacgtttctc gttcagcttt cttgtacaaa gtggttaat 949

<210> 2

<211> 769

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatggctct agagatatac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 60

taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 120

tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 180

tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 240

ccatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta 300

atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct 360

cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt 420

ttcccctgga aattccatat tggcactcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 480

ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc 540

agatcgaatt actagtcagg gaattcaagc ttagatctgc tagcaaggat ccagcttgtc 600

gacttcgagc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 660

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 720

caatgtatct tatcatgtct ggatcgtcta gcatcgaaga tccgatatc 769

<210> 3

<211> 37515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttattttgga ttgaagccaa tatgataatg agggggtgga gtttgtgacg tggcgcgggg 60

cgtgggaacg gggcgggtga cgtagtagtg tggcggaagt gtgatgttgc aagtgtggcg 120

gaacacatgt aagcgacgga tgtggcaaaa gtgacgtttt tggtgtgcgc cggtgtacac 180

aggaagtgac aattttcgcg cggttttagg cggatgttgt agtaaatttg ggcgtaaccg 240

agtaagattt ggccattttc gcgggaaaac tgaataagag gaagtgaaat ctgaataatt 300

ttgtgttact catagcgcgt aatatttgtc tagggccgcg gggactttga ccgtttacgt 360

ggagactcgc ccaggtgttt ttctcaggtg ttttccgcgt tccgggtcaa agttggcgtt 420

ttattattat agtcagctga cgtgtaaccg gcgtacgttc ggccgcagat ctggtcgact 480

agtccatata aggtataaat ccatataagg tataaatcca tataaggtaa taggctgcag 540

gacttactgt tggtgggacg ccctgctttg cgaagggaaa ggaggagttt gccctgagca 600

caggccccca ccctccactg ggctttcccc agctcccttg tcttcttatc acggtagtgg 660

cccagtccct ggcccctgac tccagaaggt ggccctcctg gaaacccagg tcgtgcagtc 720

aacgatgtac tcgccgggac agcgatgtct gctgcactcc atccctcccc tgttcatttg 780

tccttcatgc ccgtctggag tagatgcttt ttgcagaggt ggcaccctgt aaagctctcc 840

tgtctgactt tttttttttt tttagactga gttttgctct tgttgcctag gctggagtgc 900

aatggcacaa tctcagctca ctgcaccctc tgcctcccgg gttcaagcga ttctcctgcc 960

tcagcctccc gagtagttgg gattacaggc atgcaccacc acgcccagct aatttttgta 1020

tttttagtag agacaaggtt tcaccgtgat ggccaggctg gtcttgaact ccaggactca 1080

agtgatgctc ctgcctaggc ctctcaaagt gttgggatta caggcgtgag ccactgcacc 1140

cggcctgcac gcgttctttg aaagcagtcg agggggcgct aggtgtgggc agggacgagc 1200

tggcgcggcg tcgctgggtg caccgcgacc acgggcagag ccacgcggcg ggaggactac 1260

aactcccggc acaccccgcg ccgccccgcc tctactccca gaaggccgcg gggggtggac 1320

cgcctaagag ggcgtgcgct cccgacatgc cccgcggcgc gccattaacc gccagatttg 1380

aatcgcggga caccgggact gaaaatgaga catattatct gccacggagg tgttattacc 1440

gaagaaatgg ccgccagtct tttggaccag ctgatcgaag aggtactggc tgataatctt 1500

ccacctccta gccattttga accacctacc cttcacgaac tgtatgattt agacgtgacg 1560

gcccccgaag atcccaacga ggaggcggtt tcgcagattt ttcccgactc tgtaatgttg 1620

gcggtgcagg aagggattga cttactcact tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg 1680

cctcaccttt cccggcagcc cgagcagccg gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg 1740

ccaaaccttg taccggaggt gatcgatctt acctgctttc cacccagtga cgacgaggat 1800

gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 1860

tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 1920

aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 1980

gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 2040

gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga gcctgagccc gagccagaac 2100

cggagcctgc aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga 2160

catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta 2220

acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga 2280

gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga cttgcttaac gagcctgggc 2340

aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccagactt ggagatgtta gctccctata 2400

tcccaatgga tgatgacttc cagtaacttg catggcgtgt taaatggggc ggggcttaaa 2460

gggtatataa tgcgccgtgg gctaatcttg gttacatctg acctcccggc gggtccggcg 2520

ggtcaccatg gagctcctcg actgataagc agatttgcac attagcatta acagatgtag 2580

ctaagcactt tgcttcagtt ctcatcagca ctttatagtg acttccagat gtagctaagc 2640

actttgcttc agttctcaat tagcattaat cagcactttc tagtgacttc gagctcctcg 2700

actgataagc agatttgcac tcagcacttt gtagtgactt ccagatgtag ctaagcactt 2760

tggagctcct cgactgataa gcagatttgc accttcagtt ctcaattagc attaaagatc 2820

tggaaggtgc tgaggtacga tgagacccgc accaggtgca gaccctgcga gtgtggcggt 2880

aaacatatta ggaaccagcc tgtgatgctg gatgtgaccg aggagctgag gcccgatcac 2940

ttggtgctgg cctgcacccg cgctgagttt ggctctagcg atgaagatac agattgaggt 3000

actgaaatgt gtgggcgtgg cttaagggtg ggaaagaata tataaggtgg gggtcttatg 3060

tagttttgta tctgttttgc agcagccgcc gccgccatga gcaccaactc gtttgatgga 3120

agcattgtga gctcatattt gacaacgcgc atgcccccat gggccggggt gcgtcagaat 3180

gtgatgggct ccagcattga tggtcgcccc gtcctgcccg caaactctac taccttgacc 3240

tacgagaccg tgtctggaac gccgttggag actgcagcct ccgccgccgc ttcagccgct 3300

gcagccaccg cccgcgggat tgtgactgac tttgctttcc tgagcccgct tgcaagcagt 3360

gcagcttccc gttcatccgc ccgcgatgac aagttgacgg ctcttttggc acaattggat 3420

tctttgaccc gggaacttaa tgtcgtttct cagcagctgt tggatctgcg ccagcaggtt 3480

tctgccctga aggcttcctc ccctcccaat gcggtttaaa acataaataa aaaaccagac 3540

tctgtttgga tttggatcaa gcaagtgtct tgctgtcttt atttaggggt tttgcgcgcg 3600

cggtaggccc gggaccagcg gtctcggtcg ttgagggtcc tgtgtatttt ttccaggacg 3660

tggtaaaggt gactctggat gttcagatac atgggcataa gcccgtctct ggggtggagg 3720

tagcaccact gcagagcttc atgctgcggg gtggtgttgt agatgatcca gtcgtagcag 3780

gagcgctggg cgtggtgcct aaaaatgtct ttcagtagca agctgattgc caggggcagg 3840

cccttggtgt aagtgtttac aaagcggtta agctgggatg ggtgcatacg tggggatatg 3900

agatgcatct tggactgtat ttttaggttg gctatgttcc cagccatatc cctccgggga 3960

ttcatgttgt gcagaaccac cagcacagtg tatccggtgc acttgggaaa tttgtcatgt 4020

agcttagaag gaaatgcgtg gaagaacttg gagacgccct tgtgacctcc aagattttcc 4080

atgcattcgt ccataatgat ggcaatgggc ccacgggcgg cggcctgggc gaagatattt 4140

ctgggatcac taacgtcata gttgtgttcc aggatgagat cgtcataggc catttttaca 4200

aagcgcgggc ggagggtgcc agactgcggt ataatggttc catccggccc aggggcgtag 4260

ttaccctcac agatttgcat ttcccacgct ttgagttcag atggggggat catgtctacc 4320

tgcggggcga tgaagaaaac ggtttccggg gtaggggaga tcagctggga agaaagcagg 4380

ttcctgagca gctgcgactt accgcagccg gtgggcccgt aaatcacacc tattaccggg 4440

tgcaactggt agttaagaga gctgcagctg ccgtcatccc tgagcagggg ggccacttcg 4500

ttaagcatgt ccctgactcg catgttttcc ctgaccaaat ccgccagaag gcgctcgccg 4560

cccagcgata gcagttcttg caaggaagca aagtttttca acggtttgag accgtccgcc 4620

gtaggcatgc ttttgagcgt ttgaccaagc agttccaggc ggtcccacag ctcggtcacc 4680

tgctctacgg catctcgatc cagcatatct cctcgtttcg cgggttgggg cggctttcgc 4740

tgtacggcag tagtcggtgc tcgtccagac gggccagggt catgtctttc cacgggcgca 4800

gggtcctcgt cagcgtagtc tgggtcacgg tgaaggggtg cgctccgggc tgcgcgctgg 4860

ccagggtgcg cttgaggctg gtcctgctgg tgctgaagcg ctgccggtct tcgccctgcg 4920

cgtcggccag gtagcatttg accatggtgt catagtccag cccctccgcg gcgtggccct 4980

tggcgcgcag cttgcccttg gaggaggcgc cgcacgaggg gcagtgcaga cttttgaggg 5040

cgtagagctt gggcgcgaga aataccgatt ccggggagta ggcatccgcg ccgcaggccc 5100

cgcagacggt ctcgcattcc acgagccagg tgagctctgg ccgttcgggg tcaaaaacca 5160

ggtttccccc atgctttttg atgcgtttct tacctctggt ttccatgagc cggtgtccac 5220

gctcggtgac gaaaaggctg tccgtgtccc cgtatacaga cttgagaggc ctgtcctcga 5280

gcggtgttcc gcggtcctcc tcgtatagaa actcggacca ctctgagaca aaggctcgcg 5340

tccaggccag cacgaaggag gctaagtggg aggggtagcg gtcgttgtcc actagggggt 5400

ccactcgctc cagggtgtga agacacatgt cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg 5460

gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg ttcctgaagg ggggctataa aagggggtgg 5520

gggcgcgttc gtcctcactc tcttccgcat cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg 5580

agtactccct ctgaaaagcg ggcatgactt ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg 5640

aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg tgatgccttt gagggtggcc gcatccatct 5700

ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa gcttggtggc aaacgacccg tagagggcgt 5760

tggacagcaa cttggcgatg gagcgcaggg tttggttttt gtcgcgatcg gcgcgctcct 5820

tggccgcgat gtttagctgc acgtattcgc gcgcaacgca ccgccattcg ggaaagacgg 5880

tggtgcgctc gtcgggcacc aggtgcacgc gccaaccgcg gttgtgcagg gtgacaaggt 5940

caacgctggt ggctacctct ccgcgtaggc gctcgttggt ccagcagagg cggccgccct 6000

tgcgcgagca gaatggcggt agggggtcta gctgcgtctc gtccgggggg tctgcgtcca 6060

cggtaaagac cccgggcagc aggcgcgcgt cgaagtagtc tatcttgcat ccttgcaagt 6120

ctagcgcctg ctgccatgcg cgggcggcaa gcgcgcgctc gtatgggttg agtgggggac 6180

cccatggcat ggggtgggtg agcgcggagg cgtacatgcc gcaaatgtcg taaacgtaga 6240

ggggctctct gagtattcca agatatgtag ggtagcatct tccaccgcgg atgctggcgc 6300

gcacgtaatc gtatagttcg tgcgagggag cgaggaggtc gggaccgagg ttgctacggg 6360

cgggctgctc tgctcggaag actatctgcc tgaagatggc atgtgagttg gatgatatgg 6420

ttggacgctg gaagacgttg aagctggcgt ctgtgagacc taccgcgtca cgcacgaagg 6480

aggcgtagga gtcgcgcagc ttgttgacca gctcggcggt gacctgcacg tctagggcgc 6540

agtagtccag ggtttccttg atgatgtcat acttatcctg tccctttttt ttccacagct 6600

cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagtactc ttggatcgga aacccgtcgg 6660

cctccgaacg gtaagagcct agcatgtaga actggttgac ggcctggtag gcgcagcatc 6720

ccttttctac gggtagcgcg tatgcctgcg cggccttccg gagcgaggtg tgggtgagcg 6780

caaaggtgtc cctgaccatg actttgaggt actggtattt gaagtcagtg tcgtcgcatc 6840

cgccctgctc ccagagcaaa aagtccgtgc gctttttgga acgcggattt ggcagggcga 6900

aggtgacatc gttgaagagt atctttcccg cgcgaggcat aaagttgcgt gtgatgcgga 6960

agggtcccgg cacctcggaa cggttgttaa ttacctgggc ggcgagcacg atctcgtcaa 7020

agccgttgat gttgtggccc acaatgtaaa gttccaagaa gcgcgggatg cccttgatgg 7080

aaggcaattt tttaagttcc tcgtaggtga gctcttcagg ggagctgagc ccgtgctctg 7140

aaagggccca gtctgcaaga tgagggttgg aagcgacgaa tgagctccac aggtcacggg 7200

ccattagcat ttgcaggtgg tcgcgaaagg tcctaaactg gcgacctatg gccatttttt 7260

ctggggtgat gcagtagaag gtaagcgggt cttgttccca gcggtcccat ccaaggttcg 7320

cggctaggtc tcgcgcggca gtcactagag gctcatctcc gccgaacttc atgaccagca 7380

tgaagggcac gagctgcttc ccaaaggccc ccatccaagt ataggtctct acatcgtagg 7440

tgacaaagag acgctcggtg cgaggatgcg agccgatcgg gaagaactgg atctcccgcc 7500

accaattgga ggagtggcta ttgatgtggt gaaagtagaa gtccctgcga cgggccgaac 7560

actcgtgctg gcttttgtaa aaacgtgcgc agtactggca gcggtgcacg ggctgtacat 7620

cctgcacgag gttgacctga cgaccgcgca caaggaagca gagtgggaat ttgagcccct 7680

cgcctggcgg gtttggctgg tggtcttcta cttcggctgc ttgtccttga ccgtctggct 7740

gctcgagggg agttacggtg gatcggacca ccacgccgcg cgagcccaaa gtccagatgt 7800

ccgcgcgcgg cggtcggagc ttgatgacaa catcgcgcag atgggagctg tccatggtct 7860

ggagctcccg cggcgtcagg tcaggcggga gctcctgcag gtttacctcg catagacggg 7920

tcagggcgcg ggctagatcc aggtgatacc taatttccag gggctggttg gtggcggcgt 7980

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cgtacagggg cccaactcgg ccgcctgtgg actattctgc tgcatgtttc tccacgcctt 21600

tgccaactgg ccccaaactc ccatggatca caaccccacc atgaacctta ttaccggggt 21660

acccaactcc atgctcaaca gtccccaggt acagcccacc ctgcgtcgca accaggaaca 21720

gctctacagc ttcctggagc gccactcgcc ctacttccgc agccacagtg cgcagattag 21780

gagcgccact tctttttgtc acttgaaaaa catgtaaaaa taatgtacta gagacacttt 21840

caataaaggc aaatgctttt atttgtacac tctcgggtga ttatttaccc ccacccttgc 21900

cgtctgcgcc gtttaaaaat caaaggggtt ctgccgcgca tcgctatgcg ccactggcag 21960

ggacacgttg cgatactggt gtttagtgct ccacttaaac tcaggcacaa ccatccgcgg 22020

cagctcggtg aagttttcac tccacaggct gcgcaccatc accaacgcgt ttagcaggtc 22080

gggcgccgat atcttgaagt cgcagttggg gcctccgccc tgcgcgcgcg agttgcgata 22140

cacagggttg cagcactgga acactatcag cgccgggtgg tgcacgctgg ccagcacgct 22200

cttgtcggag atcagatccg cgtccaggtc ctccgcgttg ctcagggcga acggagtcaa 22260

ctttggtagc tgccttccca aaaagggcgc gtgcccaggc tttgagttgc actcgcaccg 22320

tagtggcatc aaaaggtgac cgtgcccggt ctgggcgtta ggatacagcg cctgcataaa 22380

agccttgatc tgcttaaaag ccacctgagc ctttgcgcct tcagagaaga acatgccgca 22440

agacttgccg gaaaactgat tggccggaca ggccgcgtcg tgcacgcagc accttgcgtc 22500

ggtgttggag atctgcacca catttcggcc ccaccggttc ttcacgatct tggccttgct 22560

agactgctcc ttcagcgcgc gctgcccgtt ttcgctcgtc acatccattt caatcacgtg 22620

ctccttattt atcataatgc ttccgtgtag acacttaagc tcgccttcga tctcagcgca 22680

gcggtgcagc cacaacgcgc agcccgtggg ctcgtgatgc ttgtaggtca cctctgcaaa 22740

cgactgcagg tacgcctgca ggaatcgccc catcatcgtc acaaaggtct tgttgctggt 22800

gaaggtcagc tgcaacccgc ggtgctcctc gttcagccag gtcttgcata cggccgccag 22860

agcttccact tggtcaggca gtagtttgaa gttcgccttt agatcgttat ccacgtggta 22920

cttgtccatc agcgcgcgcg cagcctccat gcccttctcc cacgcagaca cgatcggcac 22980

actcagcggg ttcatcaccg taatttcact ttccgcttcg ctgggctctt cctcttcctc 23040

ttgcgtccgc ataccacgcg ccactgggtc gtcttcattc agccgccgca ctgtgcgctt 23100

acctcctttg ccatgcttga ttagcaccgg tgggttgctg aaacccacca tttgtagcgc 23160

cacatcttct ctttcttcct cgctgtccac gattacctct ggtgatggcg ggcgctcggg 23220

cttgggagaa gggcgcttct ttttcttctt gggcgcaatg gccaaatccg ccgccgaggt 23280

cgatggccgc gggctgggtg tgcgcggcac cagcgcgtct tgtgatgagt cttcctcgtc 23340

ctcggactcg atacgccgcc tcatccgctt ttttgggggc gcccggggag gcggcggcga 23400

cggggacggg gacgacacgt cctccatggt tgggggacgt cgcgccgcac cgcgtccgcg 23460

ctcgggggtg gtttcgcgct gctcctcttc ccgactggcc atttccttct cctataggca 23520

gaaaaagatc atggagtcag tcgagaagaa ggacagccta accgccccct ctgagttcgc 23580

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gcttgaggag gaggaagtga ttatcgagca ggacccaggt tttgtaagcg aagacgacga 23700

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gctgttgaag catctgcagc gccagtgcgc cattatctgc gacgcgttgc aagagcgcag 23880

cgatgtgccc ctcgccatag cggatgtcag ccttgcctac gaacgccacc tattctcacc 23940

gcgcgtaccc cccaaacgcc aagaaaacgg cacatgcgag cccaacccgc gcctcaactt 24000

ctaccccgta tttgccgtgc cagaggtgct tgccacctat cacatctttt tccaaaactg 24060

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gcagggcgct gtcatacctg atatcgcctc gctcaacgaa gtgccaaaaa tctttgaggg 24180

tcttggacgc gacgagaagc gcgcggcaaa cgctctgcaa caggaaaaca gcgaaaatga 24240

aagtcactct ggagtgttgg tggaactcga gggtgacaac gcgcgcctag ccgtactaaa 24300

acgcagcatc gaggtcaccc actttgccta cccggcactt aacctacccc ccaaggtcat 24360

gagcacagtc atgagtgagc tgatcgtgcg ccgtgcgcag cccctggaga gggatgcaaa 24420

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gcttcaaacg cgcgagcctg ccgacttgga ggagcgacgc aaactaatga tggccgcagt 24540

gctcgttacc gtggagcttg agtgcatgca gcggttcttt gctgacccgg agatgcagcg 24600

caagctagag gaaacattgc actacacctt tcgacagggc tacgtacgcc aggcctgcaa 24660

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cgactgcgtt tacttatttc tatgctacac ctggcagacg gccatgggcg tttggcagca 24840

gtgcttggag gagtgcaacc tcaaggagct gcagaaactg ctaaagcaaa acttgaagga 24900

cctatggacg gccttcaacg agcgctccgt ggccgcgcac ctggcggaca tcattttccc 24960

cgaacgcctg cttaaaaccc tgcaacaggg tctgccagac ttcaccagtc aaagcatgtt 25020

gcagaacttt aggaacttta tcctagagcg ctcaggaatc ttgcccgcca cctgctgtgc 25080

acttcctagc gactttgtgc ccattaagta ccgcgaatgc cctccgccgc tttggggcca 25140

ctgctacctt ctgcagctag ccaactacct tgcctaccac tctgacataa tggaagacgt 25200

gagcggtgac ggtctactgg agtgtcactg tcgctgcaac ctatgcaccc cgcaccgctc 25260

cctggtttgc aattcgcagc tgcttaacga aagtcaaatt atcggtacct ttgagctgca 25320

gggtccctcg cctgacgaaa agtccgcggc tccggggttg aaactcactc cggggctgtg 25380

gacgtcggct taccttcgca aatttgtacc tgaggactac cacgcccacg agattaggtt 25440

ctacgaagac caatcccgcc cgccaaatgc ggagcttacc gcctgcgtca ttacccaggg 25500

ccacattctt ggccaattgc aagccatcaa caaagcccgc caagagtttc tgctacgaaa 25560

gggacggggg gtttacttgg acccccagtc cggcgaggag ctcaacccaa tccccccgcc 25620

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aggttttgga cgaggaggag gaggacatga tggaagactg ggagagccta gacgaggaag 25800

cttccgaggt cgaagaggtg tcagacgaaa caccgtcacc ctcggtcgca ttcccctcgc 25860

cggcgcccca gaaatcggca accggttcca gcatggctac aacctccgct cctcaggcgc 25920

cgccggcact gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg 25980

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catggcgcgg gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct 26100

ccttcgcccg ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc 26160

attactaccg tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca 26220

gcagcggcca cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa 26280

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tcgacccgcg agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc 26400

aggggccaag aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgatccct cacccgcagc 26460

tgcctgtatc acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc ggaggctctc 26520

ttcagtaaat actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc tcaaatttaa 26580

gcgcgaaaac tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt cgtcagcgcc 26640

attatgagca aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca aatgggactt 26700

gcggctggag ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac 26760

atgatatccc gggtcaacgg aatccgcgcc caccgaaacc gaattctctt ggaacaggcg 26820

gctattacca ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg 26880

taccaggaaa gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt 26940

cagatgacta actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc 27000

gggcagggta taactcacct gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg 27060

gtgagctcct cgcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgt 27120

ccttcattca cgcctcgtca ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc 27180

tctggaggca ttggaactct gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac 27240

cccttctcgg gacctcccgg ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta 27300

aaggactcgg cggacggcta cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg 27360

aaacacctgg tccactgtcg ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc 27420

tactttgaat tgcccgagga tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc 27480

cagggagagc ttgcccgtag cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag 27540

cgggacaggg gaccctgtgt tctcactgtg atttgcaact gtcctaacct tggattacat 27600

caagatcttt gttgccatct ctgtgctgag tataataaat acagaaatta aaatatactg 27660

gggctcctat cgccatcctg taaacgccac cgtcttcacc cgcccaagca aaccaaggcg 27720

aaccttacct ggtactttta acatctctcc ctctgtgatt tacaacagtt tcaacccaga 27780

cggagtgagt ctacgagaga acctctccga gctcagctac tccatcagaa aaaacaccac 27840

cctccttacc tgccgggaac gtacgagtgc gtcaccggcc gctgcaccac acctaccgcc 27900

tgaccgtaaa ccagactttt tccggacaga cctcaataac tctgtttacc agaacaggag 27960

gtgagcttag aaaaccctta gggtattagg ccaaaggcgc agctactgtg gggtttatga 28020

acaattcaag caactctacg ggctattcta attcaggttt ctctagaatc ggggttgggg 28080

ttattctctg tcttgtgatt ctctttattc ttatactaac gcttctctgc ctaaggctcg 28140

ccgcctgctg tgtgcacatt tgcatttatt gtcagctttt taaacgctgg ggtcgccacc 28200

caagatgatt aggtacataa tcctaggttt actcaccctt gcgtcagccc acggtaccac 28260

ccaaaaggtg gattttaagg agccagcctg taatgttaca ttcgcagctg aagctaatga 28320

gtgcaccact cttataaaat gcaccacaga acatgaaaag ctgcttattc gccacaaaaa 28380

caaaattggc aagtatgctg tttatgctat ttggcagcca ggtgacacta cagagtataa 28440

tgttacagtt ttccagggta aaagtcataa aacttttatg tatacttttc cattttatga 28500

aatgtgcgac attaccatgt acatgagcaa acagtataag ttgtggcccc cacaaaattg 28560

tgtggaaaac actggcactt tctgctgcac tgctatgcta attacagtgc tcgctttggt 28620

ctgtacccta ctctatatta aatacaaaag cagacgcagc tttattgagg aaaagaaaat 28680

gccttaattt actaagttac aaagctaatg tcaccactaa ctgctttact cgctgcttgc 28740

aaaacaaatt caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt 28800

cctgctcaat accattcccc tgaacaattg actctatgtg ggatatgctc cagcgctaca 28860

accttgaagt caggcttcct ggatgtcagc atctgacttt ggccagcacc tgtcccgcgg 28920

atttgttcca gtccaactac agcgacccac cctaacagag atgaccaaca caaccaacgc 28980

ggccgccgct accggactta catctaccac aaatacaccc caagtttctg cctttgtcaa 29040

taactgggat aacttgggca tgtggtggtt ctccatagcg cttatgtttg tatgccttat 29100

tattatgtgg ctcatctgct gcctaaagcg caaacgcgcc cgaccaccca tctatagtcc 29160

catcattgtg ctacacccaa acaatgatgg aatccataga ttggacggac tgaaacacat 29220

gttcttttct cttacagtat gattaaatga gacatgattc ctcgagtttt tatattactg 29280

acccttgttg cgcttttttg tgcgtgctcc acattggcta agtaatagtt aattaaacaa 29340

gtttgtacaa aaaagcaggc ttcgaaggag atagaaccaa ttctctaagg aaatacttaa 29400

ccatggctct agagatatac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 29460

taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 29520

tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 29580

tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 29640

ccatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta 29700

atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct 29760

cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt 29820

ttcccctgga aattccatat tggcactcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 29880

ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc 29940

agatcgaatt actagtcagg gaattcgcca ccatgtgtca ccagcagttg gtcatctctt 30000

ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc tcgtggccat atgggaactg aagaaagatg 30060

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gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc agaaagaacc caaaaataag acctttctaa 30360

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ctgatttgac attcagtgtc aaaagcagca gaggctcttc tgacccccaa ggggtgacgt 30480

gcggagctgc tacactctct gcagagagag tcagagggga caacaaggag tatgagtact 30540

cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc cagctgctga ggagagtctg cccattgagg 30600

tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt atgaaaacta caccagcagc ttcttcatca 30660

gggacatcat caaacctgac ccacccaaga acttgcagct gaagccatta aagaactctc 30720

ggcaggtgga ggtcagctgg gagtaccctg acacctggag tactccacat tcctacttct 30780

ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa gatagagtct 30840

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cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga gcgaatgggc atctgtgccc tgcagtgttc 30960

ctggagtagg ggtacctggg gtgggcgcca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag 31020

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tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga 31380

tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca 31440

acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa 31500

tcaagctctg catacttctt catgctttca gaatacgggc agtgactatt gatagagtga 31560

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tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatcgtcta gcatcgaaga 31740

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acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 31860

aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttgctc 31920

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acacacttgg cggttctttc gggtgacaaa gacgactgct gggttggagc acttgccact 32040

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tttccaattc ttcaaaatgc ctaagaaaag agttccatta tccgctacat ctgaatgacc 32640

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gccaagagaa cccaaaacga tgcagagctg aaaagccaag atataacttg tatatttcat 32760

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caaggactta cattcaattc aaacaacatt tgcattgatg acaatattaa caccttatgg 33780

acaggagtca accccaccga agccaactgt caaatcatga actccagtga atctaatgat 33840

tgcaaattaa ttctaacact agttaaaact ggagcactag tcactgcatt tgtttatgtt 33900

ataggagtat ctaacaattt taatatgcta actacacaca gaaatataaa ttttactgca 33960

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ccacttaatc ataaatcagg acaaaacatg gctactggtg ccattactaa tgctaaaggt 34080

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gtaactgcag cacagcacca caatattgtt caaaatccca cagtgcaagg cgctgtatcc 35040

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