一种土著益生复合芽孢杆菌液和使用方法及用途

技术领域

本发明属于农作物病害生态防控技术领域，具体为一种土著益生复合芽孢杆菌液和使用方法及用途。

背景技术

长期过量使用化肥、农药和连茬耕作，造成了土壤退化、板结，土壤肥力下降、生产力降低，土壤微生物区系发生改变，病原微生物及其抗药性增加，作物各类病害发病严重，从而导致恶性循环，最终使作物品质下降，农药残留增加，药害肥害严重，严重阻碍农业的可持续发展，威胁到国家粮食安全。许多作物病害病原菌可以在正常环境条件下以孢子的形式在土壤中存活多年，这使得这类病害难以防治，因此被称为植物癌症。化学防治由于其具有见效快、成本低，是目前最主要的防治方法。但是，长期不科学的施用化学农药，会污染环境，降低土壤自我修复能力，使病原菌产生抗药性，使土壤理、化、生性状和微生物区系发生较大变化等危害。物理防治主要包括暴晒消毒、水蒸气消毒等方法。但这些方法都非常耗时，费力且效果有限。生物防治则是利用生物或其代谢产物控制病虫害的发生。生物防治具有无污染、保护生态平衡，较好的防治效果等特点，被称为绿色防治方法，是现在和将来防治植物病害的发展方向，符合绿色农业和可持续发展农业的要求。利用生防菌进行生物防治是生物防治的主要手段，生防菌的生防作用机制主要包括竞争、拮抗、重寄生、诱导植物抗病性和促进植物生长等几个方面，其生防效果往往是多种方式的协同作用的结果。很多研究表明，生物菌剂在防治作物病上也有一定的防控效果，然而，单一微生物制剂效果并不理想。混合发酵在一定程度上能够充分利用生防菌之间的协同互补优势，可以克服单一生防菌抗逆性差、防病谱狭窄、存活定殖能力低的缺点，利用多种生防微生物防治可在土壤中植入大量的有益微生物，可以竞争、抑制病原菌，减轻病原压力，诱导植物抗性，促进植物生长，进而能够更高效更环保的防治植物病害，维持植物的健康生长，从而达到较好的防治效果。然而，当前生产上主要应用的生防菌剂为单一生防菌发酵产品或几个生防菌发酵后混合制备的菌剂，这些菌剂均需较高成本的专业设备和技术人员生产，生产成本较高；此外菌剂应用过程中常常存在定殖困难、防控效果不稳定等问题。继续寻求一种方便、成本低生防菌株培养扩繁方法，促进生物防治措施在病害防控领域的应用仍是十分必要的。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种土著益生复合芽孢杆菌液和使用方法及用途的技术方案，利用健康农作物根际环境土壤中丰富益生芽孢杆菌，通过提取和制备益生芽孢杆菌种，通过筛选定向培养基，在一定温度和充氧条件，富集培养土著根际益生芽孢杆菌液。在农作物种子消毒、喷施防病和作物灌根防病等农作物防病过程中应用。将土著益生复合芽孢杆菌液通过浸种消毒、喷施防病、灌根防病等技术方法进行利用，提高了农作物种传病害的防除、控制农作物地上部病害传播和土传根部病害的防控，提高农作物种苗素质、减少病害发生、提高水稻稻谷产量和改善产量构成。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于采用以下方法制备：

1）菌种液制备：提取当时当地1-20种绿色健康植物根系及粘附土壤100-1000克，用清水溶解提取根系及粘附土壤，溶解用清水质量为根系及粘附土壤的1-5倍，用滤网过滤根系及粘附土壤溶解液，用离心机离心过滤后的根系及粘附土壤溶解液，即为根际土壤菌种液；

2）芽孢杆菌富集培养：

a.配制芽孢杆菌群富集培养基，培养基含葡萄糖10-30g/L、 L-谷氨酸钠1-10g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L、硫酸镁0.1-2g/L、氯化钾0.1-2g/L、硫酸锰1-10mg/L、硫酸亚铁0.01-1mg/L、硫酸铜0.1-1mg/L，加水定容；

b.将根际土壤菌种液，加入芽孢杆菌群富集培养基中培养，添加菌种液为芽孢杆菌群富集培养基质量的0.1%-10%，培养温度为25-35℃，培养时充空气源氧气量为芽孢杆菌群富集培养基体积的100-500倍/小时；

c.持续培养3-10天，即得土著益生复合芽孢杆菌液。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤1）中：绿色植物为水稻、稗草、异型莎草、节节菜、水龙、鸭舌草、矮慈姑、日照飘拂草、牛毛毡、水莎草、碎米莎草、千金子中的一种或以上以上植物；或为小麦、雀麦、看麦娘、罔草、芥菜、播娘蒿、猪殃殃、麦瓶草中的一种或以上以上植物；或为玉米、马唐、香附子、狗尾草、牛筋草、稗、马齿苋、藜、反枝苋、菟丝子、白茅中的一种或以上以上植物。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤1）中：绿色健康植物根系及粘附土壤质量为200-800克，优选400-600克；溶解用清水质量为根系及粘附土壤的2-4倍，优选3-3.5倍；滤网的目数为50-200目，优选80-120目，更优选90-100目。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤1）中：离心机离心速率为5000-6000转/分钟，优选5200-5800转/分钟，更优选5310-5350转/分钟；离心机离心运转时间1-10分钟，优选2-8分钟，更优选3-5分钟。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤2）的芽孢杆菌群富集培养基中含有：葡萄糖12-25g/L、 L-谷氨酸钠2-8g/L、磷酸氢二钾0.4-1.8g/L、硫酸镁0.4-1.7g/L、氯化钾0.4-1.5g/L、硫酸锰2-8mg/L、硫酸亚铁0.05-0.8mg/L、硫酸铜0.2-0.8mg/L。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤2）的芽孢杆菌群富集培养基中含有：葡萄糖15-20g/L、 L-谷氨酸钠4-6g/L、磷酸氢二钾1-1.5g/L、硫酸镁1-1.3g/L、氯化钾1-1.2g/L、硫酸锰4-5mg/L、硫酸亚铁0.1-0.5mg/L、硫酸铜0.4-0.6mg/L。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤2）中：添加菌种液为芽孢杆菌群富集培养基质量的1%-8%，优选3%-5%。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液，其特征在于步骤2）中：培养温度为28-31℃，培养时充空气源氧气量为芽孢杆菌群富集培养基体积的200-400倍/小时，优选300-350倍/小时；持续培养时间为4-8天。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液的使用方法，其特征在包括：

1)使用土著益生复合芽孢杆菌液防除农作物种传病害，根据不同农作物种子特性，采用不同稀释比例浸泡种子，一般为1-1000倍，优选100-800倍，更优选300-600倍，再优选400-500倍；

2)使用土著益生复合芽孢杆菌液液体菌肥稀释后喷施农作物，稀释比例为50-500倍，优选100-400倍，更优选200-300；

3)使用土著益生复合芽孢杆菌液稀释灌根作物，稀释1-20倍，优选5-15倍，更优选10-12倍。

所述的一种土著益生复合芽孢杆菌液在制备浸种消毒、喷施防病、灌根防病的制剂中的应用。

芽孢杆菌：芽孢杆菌属（Bacillus），细菌的一属，能形成芽孢（内生孢子）。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌属细菌较大(4-10μm)，革兰氏阳性、是严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌属可分为以下亚群：多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌（包括蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。芽孢杆菌具有耐高温、快速复活和较强分泌酶等特点，在有氧和无氧条件下都能存活。在营养缺乏、干旱等条件下形成芽孢，在条件适宜时又可以重新萌发成营养体。芽孢杆菌属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是一类能产生抗力内生孢子的革兰氏阳性菌，细胞呈杆状且外层覆盖大量的吡啶二羧酸钙。其皮层位于核心和芽孢壳之间，含丰富的肽聚糖；核心是一种高度浓缩的、惰性的染色体；最外层的外壁为一层肽聚糖壁，且一层或多层的成分为蛋白质的芽孢衣。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强，对染料不易着色，稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温，能长期耐受 60 ℃高温，在温度 120 ℃下能存活 20 min，且耐酸碱，在胃酸环境中能保持活性，这可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。同时还具有广谱抗菌活性，能产生细菌素，抑制病原菌。目前应用较多的有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等类型。芽孢又称为孢子。最先由Cohn在枯草芽孢杆菌中发现，随后Koch在炭疽芽孢杆菌中发现并对其进行了描述。Cohn阐述了枯草芽孢杆菌的抗热性，而Koch则详细描述了炭疽芽孢杆菌的芽孢形成的周期。由于芽孢形成于细胞内部，所以又被称为内生孢子，最终孢子要从母细胞或芽孢囊释放出来。芽孢是自然界已经发现的最具耐受性的细胞。处于休眠状态的芽孢对热、干燥、辐射、酸、碱和有机溶剂等杀菌因子具有极强的抵抗力。芽孢能在不利的环境条件下存活达十余年，甚至成千上万年。当环境条件适宜时，芽孢又可萌发形成能够分裂繁殖的菌体细胞。芽孢杆菌在工农业及医药生产中均有广泛应用。芽孢杆菌产生的抗菌物质能防治多种植物病害，已有一些芽孢杆菌生防菌株得到商品化或得到有限商品化生产应用许可。苏云金芽孢杆菌形成过程中可以产生一种伴孢晶体，它已成为世界上产量最大的微生物杀虫剂。侧孢短芽孢杆菌的一些菌株也能产生晶体蛋白及酶类物质，对于无脊椎生物具有毒性作用。芽孢杆菌具有解磷、解钾、固氮等生物活性，有利于提高作物产量，而且芽孢杆菌抗逆性好，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌等被广泛用于生产生物肥料。芽孢杆菌产生的抗菌物质对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的作用，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。芽孢杆菌产生的抗菌肽的杀菌机制非常独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，因而抗菌肽作为一种新型饲料添加剂，是目前饲料业的一个新的研发方向。大多数芽孢杆菌属细菌是无害的，但有一些对人和动物是有致病性的。蜡样芽孢杆菌可引起食物中毒，症状与金黄色葡萄球菌食物中毒相似。一些菌株在食物中可产生耐热性毒素，该毒素与芽孢萌发有关，在被食入后1-5h出现呕吐症状。其他菌株产生不耐热肠毒素，在食入后10-15h内引起腹泻。已知蜡样芽孢杆菌在免疫受损患者可引起菌血症以及其他症状如呕吐和腹泻。炭疽杆菌可引起人和动物炭疽。

富集培养基：是一种为了分离某类微生物而加入助长该类微生物的营养物质或加入抑制其他微生物生长的抑菌剂的培养基。在这类培养基中，某种微生物将比其他微生物生长繁殖更快，能以明显的生长优势而抑制其他类微生物的生长。因此利用这类培养基可以从杂居多种微生物的样品中较容易地分离出目的微生物，但能在这种培养基上生长的微生物并不是一个纯种，而是营养要求或者抗性类似的类群，所以这种富集和选择性只是相对的。利用这种培养基分离或者富集所需要的某种微生物时，若能将培养基的营养成分和培养的环境条件，如通气、温度、渗透压、光等结合起来，分离效果更佳。化学抑制物质一般为染色剂、抗菌素、结构类似物和食盐等。

富集培养：亦称增殖培养、加富培养。是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，人为地提供一些特定的环境条件，使特定种（类）微生物旺盛生长，使其在数量上占优势，更利于分离出该特定微生物，并引向纯培养。富集的方法主要有三种：选择能促进富集特定种（类）目的微生物生长繁殖的培养基或培养条件；选择能抑制其他微生物生长繁殖的培养基或培养条件；采用连续培养法，在一定稀释率下，比生长速率小的细胞溢出（被淘汰），比生长速率大的细胞保留并继续培养。富集培养的因素可根据所需分离微生物的生理特点从物理、化学、生物及综合因素等多方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等。对于分离得到的菌株，还必须进行性能测定和复筛才能决定是否符合生产上或研究工作的要求。在适于目标微生物而不适于其他微生物生长的条件下继续培养，则目标微生物将成为优势种而得到纯培养。这种方法是在前一世纪九十年代由维诺格拉德斯基和贝耶林克所创造的，他们应用此法对硝化细菌、硫酸还原细菌的分离获得了成功。富集培养：一类使混合微生物群体中某特定微生物比例激增的培养方法。其一可用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件，其二可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。如用于增殖好氧性自生固氮菌的Ashby无氮培养基，增殖土壤真菌用的Martin培养基等。其三可用连续培养法，在一定稀释率下，使生长速率小的细胞溢出培养器，而生长速率大的细胞留在培养器中。它的原理是利用不同微生物间生命活动特点的不同制定特定的环境条件使得仅适用于该条件的微生物旺盛生长。

上述一种土著益生复合芽孢杆菌液和使用方法及用途，菌液兑水稀释后浸泡消毒农作物种子、兑水喷施农作物植株和灌根作物等，利用土著益生复合芽孢杆菌液的的大量芽孢杆菌及其代谢功能物质，可以灭活农作物中携带的病菌并促进种子萌芽、减少农作物病害和促使壮苗并提高植株免疫抗性、改善农田土壤微生物种群结构、提高施肥效率和和农作物产量和品质。

本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，均指质量百分含量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：（1）菌种液制备：2018年6月23日浙江省杭州市富阳区中国水稻研究所实验基地（皇田畈农场）稻田里水稻及周边附近稗草、异型莎草、节节菜、水龙、鸭舌草、矮慈姑、日照飘拂草、牛毛毡、水莎草、碎米莎草、千金子等12种植物根系及根系粘附土壤480克，用自来水6公斤溶解，用100目塑料滤网过滤，用湘仪离心机仪器有限公司生产的TG16-WS台式高速离心机5700转/分钟离心5分钟，即为浙江省杭州市富阳区中国水稻研究所实验基地（皇田畈农场）水稻田土著菌种液。（2）芽孢杆菌富集培养：按比例配制富集培养基（葡萄糖19克、L-谷氨酸钠6克、磷酸氢二钾1.5克、硫酸镁0.9克、氯化钾0.6克、一水硫酸锰8毫克、七水硫酸亚铁0.31毫克、五水硫酸铜0.19毫克，用自来水定容至1升）。在培养基中加入菌种液，添加量为培养的0.25%，培养温度30℃，培养时充空气源氧气量为培养基体积的400倍，持续培养时间为4天。

实施例2：（1）菌种液制备：2019年浙江省海宁市浙江省农业科学院杨渡实验基地冬小麦地里冬小麦及周边附近雀麦、看麦娘、罔草、芥菜、播娘蒿、猪殃殃、麦瓶草等8种植物根系及根系粘附土壤350克，用拉林河水3.5公斤溶解，用80目塑料滤网过滤，用湘仪离心机仪器有限公司生产的TG16-WS台式高速离心机6000转/分钟离心5分钟，即为浙江省海宁市浙江省农业科学院杨渡实验基地冬小麦地土著菌种液。（2）芽孢杆菌富集培养：按比例配制富集培养基（葡萄糖18克、L-谷氨酸钠6克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.6克、氯化钾0.5克、一水硫酸锰5毫克、七水硫酸亚铁0.35毫克、五水硫酸铜0.24毫克，用自来水定容至1升）。在培养基中加入菌种液，添加量为培养的0.45%，培养温度24℃，培养时充空气源氧气量为培养基体积的400倍，持续培养时间为7天。

实施例3：（1）菌种液制备：2020年7月3日黑龙江省五常市鲜食玉米地里玉米及周边附近马唐、香附子、狗尾草、牛筋草、稗、马齿苋、藜、反枝苋、菟丝子和白茅等11种植物根系及根系粘附土壤600克，用拉林河水3公斤溶解，用80目塑料滤网过滤，用湘仪离心机仪器有限公司生产的TG16-WS台式高速离心机5500转/分钟离心3分钟，即为五常市玉米地土著菌种液。（2）芽孢杆菌富集培养：按比例配制富集培养基（葡萄糖25克、L-谷氨酸钠8克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁1克、氯化钾0.8克、一水硫酸锰7毫克、七水硫酸亚铁0.25毫克、五水硫酸铜0.21毫克，用拉林河水定容至1升）。在培养基中加入菌种液，添加量为培养的0.15%，培养温度26℃，培养时充空气源氧气量为培养基体积的300倍，持续培养时间为5天。

上述根围土土著菌种液制备所需的植物根系及其粘附土壤为大田农作物及农田周边的绿色植物的一种或一种以上混合物替代。

上述一种土著益生复合芽孢杆菌液的使用方法，包括：

1)使用土著益生复合芽孢杆菌液防除农作物种传病害，根据不同农作物种子特性，采用不同稀释比例浸泡种子，一般为1-1000倍，优选100-800倍，更优选300-600倍，再优选400-500倍；

2)使用土著益生复合芽孢杆菌液液体菌肥稀释后喷施农作物，稀释比例为50-500倍，优选100-400倍，更优选200-300；

3)使用土著益生复合芽孢杆菌液稀释灌根作物，稀释1-20倍，优选5-15倍，更优选10-12倍。

上述一种土著益生复合芽孢杆菌液在制备浸种消毒、喷施防病、灌根防病的制剂中的应用。1)土著益生复合芽孢杆菌液稀释后浸种消毒农作物种子种传病原菌；2)土著益生复合芽孢杆菌液稀释后喷施农作物防控病原菌；3)土著益生复合芽孢杆菌液稀释灌根作物，防控农作物土传病害。

以下通过相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。

试验例：

1)浸种：土著益生复合芽孢杆菌液用自来水稀释500倍后浸种恶苗病易感早籼稻品种“中早39”。浸种时稀释土著益生复合芽孢杆菌液淹没中早39水稻种子，浸泡48小时后，捞出中早39种子，用自来水冲洗干净，然后用催芽箱35℃破胸12小时、30℃催芽36小时，计数发芽率后，播种于机插塑盘，塑料大棚育秧，以咪鲜胺浸种为对照，播种出苗15天调查恶苗病。

2)秧苗喷施：土著益生复合芽孢杆菌液用池塘水200倍后喷施单季籼粳杂交稻“甬优15”机插塑盘秧苗，分别于秧苗立锥时、1叶1心时、2叶1心时和3叶1心(移栽前3天)，每平方米喷施稀释土著益生复合芽孢杆菌液1升，以不喷施液体菌肥为对照，于机插前秧盘取样秧苗和机插后3天田间取样秧苗，移栽前调查秧苗病害。

3)大田水稻喷施：土著益生复合芽孢杆菌液用水田灌溉沟水稀释20倍后喷施机插单季杂交籼稻“中浙优8号”，分别于机插后的返青分蘖期、分蘖期、盛蘖期、促花期、保花期、齐穗期、灌浆期等共喷施7次，每亩稻田喷施100公斤稀释液体菌肥，以不喷施液体菌肥为对照，田间考察中浙优8号的病害。

4)稻田底肥冲施：土著益生复合芽孢杆菌液2000公斤随泡田水做底肥冲施，稻田耕整机插单季籼粳杂交稻“甬优1540”，以不冲施土著益生复合芽孢杆菌液为对照，田间调查“甬优1540”的病害发生情况。

5)旱种水稻液土著益生复合芽孢杆菌液灌根追肥冲施：分别于返青期、分蘖期、穗分化期和灌浆结实期，冲施500公斤机插单季籼粳杂交稻“甬优1540”，以不冲施土著益生复合芽孢杆菌液为对照，田间调查“甬优1540”病害发生情况。

试验于2018年、2019年和2020年，在中国水稻研究所试验基地(浙江富阳黄田畈)的标准试验田进行。试验采用大区对比，大区面积5×6m

上述实施例中，各水稻试验区内施用土著益生复合芽孢杆菌液的均表现较好的病害防治效果。

表1土著益生复合芽孢杆菌浸种防治水稻恶苗病效果

表2土著益生复合芽孢杆菌浸种防治水稻立枯病效果

表3 土著益生复合芽孢杆菌不同施用方式对水稻产量及病害发生的影响

根据上述试验结果，可以得出结论：在水稻浸种、秧苗喷施、底肥冲施、灌根等应用健康植物根系及其粘附土壤制备的土著益生复合芽孢杆菌液（实施例1）能有效灭活水稻种子携带的病菌、有效防控水稻育秧期间、水稻田种植期间和水稻旱种期间的病害防控。

此外，采用其他实施例的健康植物根系及其粘附土壤制备的土著益生复合芽孢杆菌液进行玉米、小麦等栽培应用，进行上述同样的试验。试验表明：在玉米和小麦的种子处理、幼苗期喷施、田间冲施、灌根等应用健康植物根系及其粘附土壤制备的土著益生复合芽孢杆菌液能有效灭活玉米和小麦种子携带的病菌、有效防控田间病害发生。