一种乌木的组织培养快速高效繁殖方法

技术领域

本发明涉及组织培养快速高效繁殖技术领域，特别是涉及一种乌木的组织培养快速高效繁殖方法。

背景技术

乌木(Echeveria agavoides'Ebony')，也叫黑檀汁，是景天科(Crassulaceae)拟石莲属(Echeveria)东云(Echeveria Agavoides)系多年生植物，原产墨西哥，具有三大特点：玉底，黑边，颗粒纹。乌木是中大型园艺种，植株叶片光滑，叶片比较宽，叶缘发红发紫，强光照下颜色看起来乌紫色，颈部粗壮，随着生长而逐渐长粗需要阳光充足和凉爽、干燥的环境，耐半阴，怕水涝，忌闷热潮湿，夏季高温时整个植株生长缓慢或完全停止，需要通风良好且适当遮光，避免曝晒，节制浇水，不能长期雨淋，以免植株腐烂，冬天室内能耐零下4℃左右低温，再低会冻伤，干枯死亡。因为它的叶插成活率非常低，生长缓慢，所以不管是在国内还是国外，乌木价格都是很贵。

乌木的繁殖常用一般是扦插和叶插，生长非常慢，同时受季节和栽培技术限制，每年繁殖数量有限，不利于乌木的推广。植物组织培养技术被公认为是目前最高效的植物种苗快繁技术手段。目前，国内利用植物组培技术对乌木进行快繁的文献报道几乎没有，产业化生产体系尚未建立。。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌木的组织培养快速高效繁殖方法，提高各部分的利用率、提高外植体的增殖频率及快速繁殖的方法，为乌木种苗产业化生产、新品种创制及品质遗传改良等提供技术支持。

为实现上述目的，本发明提供了一种乌木的组织培养快速高效繁殖方法包括下列步骤：

(1)乌木外植体的选取：分别选取乌木叶片和花剑作为组培外植体；

(2)乌木外植体无菌处理：在超净工作台内使用75％酒精、无菌水、0.1％升汞消毒液对所述外植体进行消毒处理；

(3)愈伤组织和芽的诱导：将经过消毒的所述外植体转移到无菌接种盘内，用无菌滤纸吸去所述外植体表面多余水分，然后对所述外植体进行裁剪，将裁剪后的所述外植体接种到培养基上进行培养，培养后的所述外植体切口边缘处形成大量绿色愈伤组织，随后绿色愈伤组织上形成潜在的芽点，再逐渐分化成肉眼可见的绿色不定芽；

所述愈伤组织和所述不定芽的诱导培养基均为改良B5培养基+6-BA 3.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.7-5.8，所述培养的温度为25±2℃，光照时间为16h/d，所述培养的时间为7-10d左右；

(4)芽的增殖：在所述超净工作台中将所述不定芽分丛，每个不定芽丛中含有1-3个所述不定芽，用无菌解剖刀在所述不定芽的基部轻轻制造一些伤口，然后将所述不定芽丛接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，所述增殖培养基为改良B5培养基+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖为30g/L+琼脂8g/L，pH为5.7-5.8，所述增殖培养的培养温度为25±2℃，光照时间为16h/d；

(5)生根培养：步骤(4)中的所述不定芽长至2-3cm大小时，在所述超净工作台上从所述不定芽丛基部分开切下单个所述不定芽，并将其转入组培瓶中进行生根培养，所述组培瓶内有生根培养基，所述生根培养基为改良B5培养基+IBA 0.5mg/L+椰子汁90g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.7-5.8，所述生根培养的培养温度为25±2℃，光照时间为16h/d；

(6)驯化移栽：步骤(5)的所述不定芽基部长出的不定根达到2-3cm后，将所述组培瓶打开瓶盖，继续培养3-5d天后，将组培苗从所述组培瓶中取出，洗掉根部残留的所述生根培养基，移栽进基质，在湿度为50％-60％的条件下培养7d，然后再在温室下正常培养。

优选的，步骤(1)中所述消毒先用所述75％酒精消毒30s-50s，然后用所述无菌水冲洗2-3次，再用所述0.1％升汞消毒5-7min，最后用所述无菌水漂洗3次。

优选的，步骤(2)中所述裁剪是将所述叶片剪成0.5cm×0.5cm大小，将所述花剑剪成1cm长短。

优选的，所述改良B5培养基的配方为：硝酸钾1000mg，氯化钙150mg，硫酸镁250mg，硫酸铵134mg，磷酸二氢钠150mg，碘化钾0.75mg，硼酸3mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg，肌醇100mg，烟酸1mg，盐酸吡哆醇1mg，盐酸硫胺素6mg。

本发明的有益效果：

(1)提高一种乌木的组织培养快速高效繁殖方法，保留了乌木的优良特性，有利于乌木优良品种的保存；

(2)本发明中用乌木的叶片和花剑均能成功诱导分化形成再生植株，极大提高了各部分的利用率，显著提高了外植体的再生频率，为乌木的组培快繁奠定了坚实基础；

(3)通过组培快繁技术进行乌木种苗繁殖，生产不受地区和季节的限制，可工厂化育苗，种苗质量、数量均可控，可为乌木的推广种植提供优质种苗保障；并且其诱导率98％，生根率100％，移栽成活率100％，完全达到工厂化育苗的要求，且目前尚未见关于乌木组织培养的文献报道；

(4)建立的乌木组培快繁体系有利于本属其他品种组培快繁体系建立借鉴和推广，该体系可为今后利用植物生物技术对乌木进行新品种培育等研究奠定基础。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是本发明诱导获得的乌木不定芽示意图；

图2是本发明诱导生根后形成乌木植株示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，对本发明进一步描述。

实施例

一种乌木高效组织培养快速繁殖的方法，包括下列步骤：

(1)乌木外植体的选取

分别选取乌木叶片和花剑作为组培外植体；

(2)乌木外植体的无菌处理

在超净工作台内将外植体用75％酒精消毒30s-50s，然后用无菌水冲洗2-3次，再用0.1％升汞消毒5-7min，随后用无菌水漂洗3次；

(3)愈伤组织和芽的诱导

将经过消毒的外植体转移到无菌接种盘内，用无菌滤纸吸去外植体表面多余水分，将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小，花剑剪成1cm长短，接种到培养基上进行培养；

叶片和花剑愈伤组织和芽的诱导培养基均为改良B5培养基+6-BA 3.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，改良B5培养基的配方为：硝酸钾1000mg，氯化钙150mg，硫酸镁250mg，硫酸铵134mg，磷酸二氢钠150mg，碘化钾0.75mg，硼酸3mg，硫酸锰10mg，硫酸锌2mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg，肌醇100mg，烟酸1mg，盐酸吡哆醇1mg，盐酸硫胺素6mg，pH为5.7-5.8，培养温度25±2℃，光照时间16h/d；

上述外植体培养7-10d左右后，切口边缘处形成大量绿色愈伤组织，随后绿色愈伤组织上形成潜在的芽点，再逐渐分化成肉眼可见的绿色不定芽；

(4)芽的增殖

在超净工作台中将经愈伤诱导获得的不定芽1-3个为一丛，用无菌解剖刀在基部轻轻制造一些伤口，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，不定芽增殖培养基为改良B5培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.7-5.8，培养温度25±2℃，光照时间16h/d；

(5)生根培养

当不定芽长至2-3cm大小时，在超净工作台上从基部分开切下单个芽，并将其转入盛有生根培养基的组培瓶中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基+IBA 0.5mg/L+椰子汁90g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.7-5.8，培养温度25±2℃，光照时间16h/d；

(6)驯化移栽

不定芽基部长出的不定根达到2-3cm后，将组培瓶打开瓶盖，培养3-5d后，可将组培苗从组培瓶中取出，洗掉根部残留的培养基，移栽进基质，保持湿度为50％-60％的条件下培养7d，然后再在温室正常培养。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。