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一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对、试剂盒及方法

文献发布时间：2023-06-19 16:11:11

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对、试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌是数十年内全球最常见的癌症，每年在我国的发病约有78.1万例，死亡约有62.6万例，是目前我国发病率和死亡率均最高的癌症。世界卫生组织(WHO)将肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，非小细胞肺癌占全部肺癌病例的80％以上。近年来，随着分子诊断技术不断发展与新型靶向药物陆续出现，非小细胞肺癌治疗已进入靶向治疗时代。

非小细胞肺癌驱动基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA等多个基因，与肿瘤的发生、发展、药物疗效相关。目前国内已有多种针对非小细胞肺癌的靶向药物上市，相关的包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥希替尼，此外，美国FDA上市NSCLC靶向药物还针对BRAF突变的达拉非尼与曲美替尼等多种药物。此外还有多种靶向药物正在进行临床试验。

分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序（Sanger）、高通量测序技术（NGS）、实时荧光PCR（RQ-PCR）、数字PCR等，而高通量靶向测序技术主流的又以多重PCR的靶向测序和捕获探针的靶向测序为主。与一代(Sanger)测序技术相比，多重PCR的靶向测序技术具有更高的灵敏度，并且能够定量检测出基因突变负荷率；与捕获探针的靶向测序相比，多重PCR的靶向测序技术文库构建流程更加简单，能提供更经济、快速的测序方案，而实时荧光PCR(RQ-PCR)及数字PCR大多数是针对基因中已知突变位点的进行检测，并且实验过程中引物探针费用较高，做多基因突变筛查可行性较差。但是，目前商用的靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的试剂盒存在检测成本较高，耗时较长和检出率受限于DNA基因样品用量的问题。

因此，非常有必要开发一种基于多重PCR的靶向高通量测序的肺癌多基因突变的方法及试剂盒，可以快速简单、低成本的完成肺癌多基因突变的检测，有助于对肺癌多基因突变相关的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对，试剂盒及其应用，从而实现快速简单、低成本和能在较低基因组DNA用量的情况下高灵敏地检测肺癌多基因突变。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的的引物对，包括如下核酸序列：

(1) 检测KRAS基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID 18所示；

(2) 检测BRAF基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQ ID 28和SEQ ID 29/SEQ ID 30所示；

(3) 检测PIK3CA基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID31/SEQ ID 32和SEQ ID 33/ SEQ ID 34所示；

(4) 检测EGFR基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID35/SEQ ID 36所示；

(5) 以上所述引物的5’端为通用引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 37/SEQ ID 38所示；

上述种基于一种多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对序列在本发明的保护范围之内。

本发明的另一种技术方案为：一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的试剂盒，包含上述所示引物对SEQ ID 1/ SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID5/ SEQ ID 6，SEQ ID 7/SEQ ID 8，SEQ ID ,9/ SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID 12，SEQID13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/ SEQ ID 16，SEQ ID 17/SEQ ID 18，SEQ ID 19/SEQ ID 20，SEQ ID 21/SEQ ID 22, SEQ ID 23/ SEQ ID 24，SEQ ID 25/SEQ ID 26，SEQ ID 27/SEQID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30, SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34，SEQ ID 35/SEQ ID 36和SEQ ID 37/SEQ ID 38，靶向扩增缓冲液、文库扩增缓冲液，I5标签、I7标签、纯化磁珠。

进一步地，所述靶向扩增缓冲液包括高保真DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合物、盐离子。

进一步地，所述文库扩增缓冲液包括高保真DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物。

进一步地，所述纯化磁珠是用于靶向扩增产物与文库扩增产物的纯化中分选目的大小范围的DNA。

一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的方法，包括如下步骤：(1)提取人外周血、细胞、或新鲜组织基因组DNA；(2)以提取的人外周血、细胞、或新鲜组织基因组DNA中的其中一种为模板、上述所示引物对SEQ ID 1/ SEQ ID 2，SEQ ID 3/ SEQ ID4，SEQ ID 5/ SEQ ID 6，SEQ ID 7/SEQ ID 8，SEQ ID ,9/ SEQ ID 10，SEQ ID 11/SEQ ID12，SEQ ID13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/ SEQ ID 16，SEQ ID 17/SEQ ID 18，SEQ ID 19/SEQID 20，SEQ ID 21/SEQ ID 22, SEQ ID 23/ SEQ ID 24，SEQ ID 25/SEQ ID 26，SEQ ID27/SEQ ID 28，SEQ ID 29/SEQ ID 30, SEQ ID 31/SEQ ID 32，SEQ ID 33/SEQ ID 34，SEQID 35/SEQ ID 36和SEQ ID 37/SEQ ID 38的混合引物对，靶向扩增缓冲液和双蒸水，进行PCR反应扩增目标区域；(3) 采用磁珠对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化，得到扩增子液体；(4) 在步骤(3)中获得的扩增子液体中加入文库扩增缓冲液、I5标签、I7标签和双蒸水，进行PCR反应使扩增子两侧带上测序接头序列；(5) 采用磁珠对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化，得到扩增子文库；（6）对步骤(5)获得的文库进行测序和结果分析。

作为优选，所述步骤(2)中，扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，1-400纳克基因组DNA，2微升浓度为0.1-0.5微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。

作为又以优选，所述步骤(2)中，扩增目标区域的PCR反应程序为：在105摄氏度下热盖；95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，15-45个循环，最后72摄氏度延伸5分钟，然后将反应体系在4摄氏度进行放置。

作为优选，所述步骤(3)中，采用磁珠对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化的步骤为：第一步，向步骤(2)中获得的PCR产物内加入一定体积磁珠，充分混合均匀后，室温孵育一定时间；第二步，将第一步所得到的混合物瞬离后置于磁力架一段时间，待液体澄清后小心弃去上清；第三步，往第二步所得到的混合物加入一定体积 80%乙醇，洗涤磁珠，静置一段时间，弃去乙醇（重复该步骤一次）；第四步，对第三步所得到的混合物弃尽乙醇，晾干至磁珠呈磨砂状；第五步，往第四步所获得的混合物加入一定体积无核酸酶纯水重悬磁珠，室温静置一段时间后洗脱；第六步，将第五步所获得的混合物瞬离后置于磁力架上一段时间，待液体澄清后将上清转移到新低吸附离心管中。

作为又以优选，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为9:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为5:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为6:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为7:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为8:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为10:10。在一些实施例中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物的体积比为11:10。

作为又以优选，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为10分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为6分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为7分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为8分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为9分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为11分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，磁珠和步骤(2)中获得的PCR产物充分混合均匀后，室温孵育的时间为12分钟。

作为又以优选，所述步骤(3)中，含有磁珠的混合物瞬离后置于磁力架上的时间为2分钟或大于2分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，含有磁珠的混合物瞬离后置于磁力架上的时间为1.5分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，含有磁珠的混合物瞬离后置于磁力架上的时间为3分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，含有磁珠的混合物瞬离后置于磁力架上的时间为4分钟。在一些实施例中，所述步骤(3)中，含有磁珠的混合物瞬离后置于磁力架上的时间为5分钟。

作为又以优选，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为8:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为4:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为5:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为6:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为7:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为9:1。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于洗涤磁珠的80%乙醇与所加入磁珠的体积比为10:1。

作为又以优选，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为30秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为20秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为22秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为24秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为26秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为28秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为32秒。在一些实施例中，所述步骤(3)中，用于80%乙醇洗涤磁珠时，混合物静置的时间为34秒。

作为又以优选，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为10:9。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为7:9。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为8:9。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为9:9。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为11:9。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于重悬磁珠的无核酸酶纯水与所加入磁珠的体积比为12:9。

作为又以优选，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为5分钟。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为2分钟。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为3分钟。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为4分钟。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为5分钟。一些实施例中，所述步骤(3)中，用于无核酸酶纯水重悬磁珠时，混合物静置的时间为6分钟。

作为优选，所述步骤(4)中，使扩增子两侧带上测序接头序列的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升文库扩增缓冲液，1微升浓度为45微摩尔每升的正向文库扩增引物I5，1微升浓度为0.45微摩尔每升的反向文库扩增引物I7，13微升所述步骤(3)中获得的扩增子液体及适量双蒸水。

作为又以优选，所述步骤(4)中，使扩增子两侧带上测序接头序列的PCR反应程序为：在105摄氏度下热盖，95摄氏度预变性3分钟；95摄氏度变性20秒，61摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸30秒，循环数设定为7；72摄氏度终延伸5分钟，然后将反应体系在4摄氏度进行放置。

作为优选，所述步骤(5)中，采用磁珠对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化的技术方案为：第一步，向步骤(4)中获得的PCR产物内加入一定体积磁珠充分混合均匀；第二步，往第一步所得到的混合物加入一定体积 80%乙醇，漂洗两次；第三步，对第二步所得到的混合物用去离子水进行洗脱，将洗脱液转移到新的PCR管内。

作为又以优选，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为9:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为5:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为6:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为7:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为8:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为10:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为11:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，磁珠和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为12:10。

作为又以优选，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为9:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为5:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为6:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为7:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为8:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为10:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为11:10。一些实施例中，所述步骤(5)中，去离子水和步骤(4)中获得的PCR产物的体积比为12:10。

本发明的积极效果如下：

本发明提供了一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的试剂盒，可以促进肺癌多基因突变的检测高效完成。此外，相比于国内已上市的商用肺癌多基因突变检测的试剂盒而言，本发明试剂盒检测样本的时间缩短了25%，检测成本减少30%。与此同时，本发明试剂盒能够检测出1纳克DNA中频率低至1%的肺癌多基因突变（含有点突变、插入缺失突变和基因重排），检出率和特异性达到100%，优于目前商用试剂盒的10纳克DNA检测用量和95%的检出率，从而更有效地完成肺癌多基因突变的检测，有助于对肺癌多基因突变患者的肿瘤预后进行风险评估，用药建议以及为数据库的建立提供基因检测技术支持，同时可以为病患和医院带来临床检测收益。

附图说明

图1 是实施例1-16的技术流程图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中图1是实施例1-16的技术开发原理示意图。

实施例1

步骤1：DNA提取

按照血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

对每个样本，配制扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，1纳克基因组DNA，2微升浓度为0.5微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。体系配制完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列扩增程序：热盖温度设定为105摄氏度；首先95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，15个循环；最后72摄氏度延伸5分钟。

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2 分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

对每个样本，配制扩增子两侧加上测序接头序列的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升文库扩增缓冲液，1微升浓度为45微摩尔每升的正向文库扩增引物I5，1微升浓度为45微摩尔每升的反向文库扩增引物I7，13微升所述步骤(3)中获得的扩增子液体及适量双蒸水。体系配制完成后，混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列反应程序：热盖温度设定为105摄氏度；95摄氏度预变性3分钟；95摄氏度变性20秒，61摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸30秒，循环数设定为7；72摄氏度终延伸5分钟。

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

往步骤(4)中获得的PCR产物中加入27微升磁珠进行纯化，随后用80%的乙醇漂洗2次，让DNA片段被吸附在磁珠上，最终使用30微升去离子水进行洗脱，同时将洗脱液转移到新的PCR管内，管中液体则为制备好的扩增子文库，并通过Qubit 3.0荧光定量仪对扩增子进行定量。

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例2

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例3

步骤1：DNA提取

按照血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

对每个样本，配制扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，2纳克基因组DNA，2微升浓度为0.4微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。体系配制完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列扩增程序：热盖温度设定为105摄氏度；首先95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，20个循环；最后72摄氏度延伸5分钟。

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

对每个样本，配制扩增子两侧加上测序接头序列的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升文库扩增缓冲液，1微升浓度为45微摩尔每升的正向文库扩增引物I5，1微升浓度为0.45微摩尔每升的反向文库扩增引物I7，13微升所述步骤(3)中获得的扩增子液体及适量双蒸水。体系配制完成后，混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列反应程序：热盖温度设定为105摄氏度；95摄氏度预变性3分钟；95摄氏度变性20秒，61摄氏度退火30秒，72摄氏度延伸30秒，循环数设定为7；72摄氏度终延伸5分钟。

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例4

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例5

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

对每个样本，配制扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，5纳克基因组DNA，2微升浓度为0.3微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。体系配制完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列扩增程序：热盖温度设定为105摄氏度；首先95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，25个循环；最后72摄氏度延伸5分钟。

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例6

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例7

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

对每个样本，配制扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，10纳克基因组DNA，2微升浓度为0.2微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。体系配制完成后，用移液器轻轻吹打混匀并瞬时离心，置于PCR仪上运行下列扩增程序：热盖温度设定为105摄氏度；首先95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，30个循环；最后72摄氏度延伸5分钟。

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例8

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。

实施例9 临床样品1的检测

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例10 临床样品2的检测

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例11 临床样品3的检测

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例12 临床样品4的检测

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例13 临床样品5的检测

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例14 临床样品6的检测

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例15 临床样品7的检测

步骤1：DNA提取

按照血液DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行血液样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例16 临床样品8的检测

步骤1：DNA提取

按照新鲜组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)说明书进行新鲜组织、样本的DNA提取，并用Qubit 3荧光计进行浓度测定，-20℃冷冻保存备用。

步骤2：扩增目标区域的PCR反应

步骤3：对步骤(2)中获得的PCR产物进行纯化

向步骤(2)中获得的30微升PCR产物内加入27微升磁珠，充分混合均匀后，在室温孵育10分钟以便DNA与磁珠结合；将所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后小心弃去上清；随后加入200微升 80%乙醇洗涤混合物中的磁珠，静置30秒，弃去乙醇（重复该步骤一次）；在弃尽乙醇后，把混合物晾干至磁珠呈磨砂状，再往混合物中加入31微升无核酸酶纯水重悬磁珠，于室温静置5分钟洗脱；把所获得的混合物瞬离后置于磁力架上2分钟，待液体澄清后将30微升上清转移到新的1.5毫升低吸附离心管中，管中液体即为步骤(2)扩增得到的扩增子；同时用Qubit 3.0荧光定量仪对所获得的扩增子进行定量。

步骤4：在步骤(3)中获得的扩增子两侧加上测序接头序列

步骤5：对步骤(4)中获得的PCR产物进行纯化

步骤6：上机测序

通过Bioptic Qsep100全自动核酸蛋白分析仪对测序文库进行质控，随后采用Nextseq 550 (Illumina)进行测序。

步骤7：数据分析

采用生物信息软件对测序结果进行分析。与临床检测结果一致。说明检出成功，检出率为100%，特异性为100%。

实施例17 与商用高通量测序检测肺癌多基因突变试剂盒比较

本发明实例1-16中的肺癌多基因突变检测结果与商用高通量测序检测肺癌多基因突变试剂盒的检测结果非常一致，但本发明相比商用高通量测序检测肺癌多基因突变试剂盒检测样本的时间缩短了25%，大大提高了检测效率。此外，本发明相比商用高通量测序检测肺癌多基因突变试剂盒，把样本检出率提高到了100%。

实施例18 本发明试剂盒检测标样的情况

将实施例1-16中所述的引物对组合，靶向扩增缓冲液，靶向扩增缓冲液、文库扩增缓冲液，I5标签、I7标签、纯化磁珠与内部质控和阳性质控进行组合，分别构建16个肺癌多基因突变检测试剂盒，用于肺癌多基因突变标准样品检测。结果表明所构建得16个肺癌多基因突变检测试剂盒均能准确地检出肺癌多基因突变标准样品，检出率和特异性分别为100%。

实施例19 本发明试剂盒检测样本的情况

将实施例18中所构建的16个肺癌多基因突变检测试剂盒对所采集的血液和组织等样本进行检测，结果表明实施例18中所构建的16个肺癌多基因突变检测试剂盒检测地结果均能准确地反应样本中肺癌多基因突变的情况。与商品化肺癌多基因突变检测试剂盒比较，实施例18中所构建的16个肺癌多基因突变检测试剂盒不仅检出率和特异性分别高达100%，而且检测时间短，检测条件温和。按成本价计算，每个样本的检测费平均节省30%，不仅利于医院医保的采购使用，而且给检测者节省了不少检测费用。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 杭州奥明医学检验实验室有公司

<120> 一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对、试剂盒及方法

<141> 2022-06-12

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tcctagtata gcataattga gagaaa 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggctcaggac ttagcaagaa 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cctgtcttgt ctttgctgat gt 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

actctgaaga tgtacctatg gtcc 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctgttctaga aggcaaatca ca 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gacaaaagtt gtggacaggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

catggcatta gcaaagactc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggggagggct ttctttgtgt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

caatttaaac ccacctataa tggt 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tcgacacagc aggtcaagag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ttgacctgct gtgtcgagaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tgaagtaaaa ggtgcactgt 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tcatgaaaat ggtcagagaa acct 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tgccttgacg atacagctaa 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tgttggatca tattcgtcca ca 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

aggcctgctg aaaatgactg a 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ccaccagctc caactaccac 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

aggtactggt ggagtatttg a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aactcagcag catctcaggg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

agtgggtccc atcagtttga 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

tggatccaga caactgttca 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tcttcatgaa gacctcacag t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ggacccactc catcgagatt 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

tgcttgctct gataggaaaa tga 23

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gaacagtgaa tatttccttt gatga 25

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

gggcagatta cagtgggaca 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

tgccactttc ccttgtagac t 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

agacgggact cgagtgatga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

tcgagtcccg tctaccaagt 20

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

aggcataagg taatgtactt agggt 25

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

tccagagggg aaaaatatga ca 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

ttagcactta cctgtgactc ca 22

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

acattcgaaa gaccctagcc tt 22

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

tgcatgctgt ttaattgtgt gga 23

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

agcagggtct tctctgtttc ag 22

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

cacctcctta ctttgcctcc tt 22

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 38

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34

完整全部详细技术资料下载

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：童云广;任永丽;邓贵;
专利申请人：杭州奥明医学检验实验室有限公司;

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