一种红细胞保存试剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种红细胞保存试剂及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

红细胞试剂应用范围广泛，主要用于血型反定型检测、血型抗体效价测定和红细胞抗体筛查与鉴定。其中，血型反定型检测是供受血者输血前必须进行的检测项目，英国药典中特别强调进行输血前必须检测红细胞表面抗原和血浆中抗体两方面，只有正反定型一致，才能进行下一步操作；血型抗体效价测定和红细胞抗体筛查与鉴定是人血液制品质量的最基本保证，血液制品必须检测ABO血型抗体效价，才能有效避免溶血性输血反应，其余不规则抗体的漏检则可引起迟发性溶血性输血反应。

但是，现阶段，血型反定型检测、血型抗体效价测定和红细胞抗体筛查与鉴定使用的商品化红细胞试剂的保存期在配合低温(一般为4℃)的情况下仅有2～3个月，且易溶血，抗原稳定性也不高，严重影响临床应用。与红细胞试剂相比，使用超低温冷冻和冻干对红细胞进行保存的保存期更长，一般可达6个月以上，且相对不易溶血，抗原稳定性也更好。然而，超低温冷冻(一般为-80℃)需要超低温冰箱或液氮罐，要消耗大量的液氮或电能，运输困难，复温和洗涤去除低温保护剂(一般为高浓度甘油)的操作过程复杂，费时费力，并且，难以保证在不损失过量红细胞的前提下在合理的时间以合理的成本添加和去除低温保护剂；冻干则需要专门的冻干设备和冻干保护剂，且其也具有操作过程复杂，费时费力的缺点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种红细胞保存试剂，所述红细胞保存试剂的成分包含溶剂、戊二醛和多聚甲醛；所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.004％～0.006％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.04％～0.06％。

在本发明的一种实施方式中，所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.005％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.05％。

在本发明的一种实施方式中，所述溶剂为含有柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、葡萄糖、蔗糖、腺嘌呤、肌酐、卡那霉素、氯霉素、戊二醛和/或多聚甲醛的溶液。

本发明还提供了一种保存红细胞的方法，所述方法为：将红细胞添加至上述红细胞保存试剂中以对红细胞进行保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将红细胞添加至上述红细胞保存试剂中至质量分数为1～10％以对红细胞进行保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将红细胞添加至上述红细胞保存试剂中至质量分数为5％以对红细胞进行保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将红细胞用溶剂稀释至质量分数为1～20％，得到红细胞稀释液；将红细胞稀释液与上述红细胞保存试剂按照体积比1：0.5～2混合后，先用滚轴·混匀仪于18～25℃下滚轴滚动5～20min，再留取压积红细胞；将压积红细胞用上述红细胞保存试剂稀释至质量分数为1～10％以对红细胞进行保存。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将红细胞用溶剂稀释至质量分数为10％，得到红细胞稀释液；将红细胞稀释液与上述红细胞保存试剂按照体积比1：1混合后，先用滚轴·混匀仪于18～25℃下滚轴滚动10min，再留取压积红细胞；将压积红细胞用上述红细胞保存试剂稀释至质量分数为5％以对红细胞进行保存。

本发明还提供了上述红细胞保存试剂或上述保存红细胞的方法在保存红细胞中的应用。

本发明还提供了一种红细胞保存液，所述红细胞保存液是使用上述保存红细胞的方法对红细胞进行保存而得；所述红细胞保存液的成分包含溶剂、戊二醛、多聚甲醛和红细胞；所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.004％～0.006％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.04％～0.06％；所述红细胞在溶剂中的质量分数为1～10％。

在本发明的一种实施方式中，所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.005％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.05％；所述红细胞在溶剂中的质量分数为5％。

本发明还提供了上述红细胞保存试剂或上述保存红细胞的方法或上述红细胞保存液在血型反定型检测、血型抗体效价测定或红细胞抗体筛查与鉴定中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种红细胞保存试剂，所述红细胞保存试剂的成分包含溶剂、戊二醛和多聚甲醛；所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.004％～0.006％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.04％～0.06％。所述红细胞保存试剂能够固定红细胞膜抗原，使红细胞体积增大，变形能力减弱，渗透脆性减弱，耐渗透压能力增高、抗原稳定；研究表明，使用所述红细胞保存试剂于4℃下保存红细胞，在红细胞的质量分数为5％时，保存期可达到6个月，且不易溶血、抗原稳定性好，因此，使用所述红细胞保存试剂保存红细胞而得的红细胞保存液可作为红细胞试剂，广泛应用于血型反定型检测、血型抗体效价测定或红细胞抗体筛查与鉴定中。

进一步地，所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.005％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.05％；此配方下的红细胞保存试剂保存红细胞的效果最佳。

附图说明

图1：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后的抗原强度检测结果(试管法)。

图2：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后的抗原强度检测结果(柱凝胶法+使用抗体试剂)。图2中，-A代表使用抗-A试剂所得结果；-B代表使用抗-B试剂所得结果。

图3：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后的抗原强度检测结果(柱凝胶法+使用血浆标本)。图3中，A代表使用A型血浆所得结果；B代表使用B型血浆所得结果；O代表使用O型血浆所得结果；AB代表使用AB型血浆所得结果。

图4：红细胞在红细胞保存试剂中保存不同时间后的上清游离血红蛋白检测结果(A型红细胞)。

图5：红细胞在红细胞保存试剂中保存不同时间后的上清游离血红蛋白检测结果(B型红细胞)。

图6：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后上清液与红细胞压积的分层情况(保存24h)。

图7：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后上清液与红细胞压积的分层情况(保存6month)。

图8：红细胞在不同红细胞保存试剂中保存后的分散情况。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：一种红细胞保存试剂及其制备方法

本实施例提供了一种红细胞保存试剂，所述红细胞保存试剂的成分由生理盐水、戊二醛和多聚甲醛组成；所述戊二醛在生理盐水中的质量分数为0.005％；所述多聚甲醛在生理盐水中的质量分数为0.05％。

所述红细胞保存试剂的制备方法如下：

将戊二醛(购自国药公司)用生理盐水稀释至质量分数为0.01％，得到戊二醛稀释液；将多聚甲醛(购自国药公司)用生理盐水稀释至质量分数为0.1％，得到多聚甲醛稀释液；将戊二醛稀释液和多聚甲醛稀释液按照体积比1：1混合，得到红细胞保存试剂1(于4℃下保存)。

实施例2：一种红细胞保存试剂及其制备方法

本实施例提供了一种红细胞保存试剂，所述红细胞保存试剂在实施例1的基础上：将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂2；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.18％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂3；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.16％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂4；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.14％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂5；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.12％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂6；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.1％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂7；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.04％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂8；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.03％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂9；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.02％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂10；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.01％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0％，得到红细胞保存试剂11；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.05％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，得到红细胞保存试剂12；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.04％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，得到红细胞保存试剂13；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.03％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，得到红细胞保存试剂14；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.02％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，得到红细胞保存试剂15；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.01％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.2％，得到红细胞保存试剂16；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.01％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.05％，得到红细胞保存试剂17；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.02％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.1％，得到红细胞保存试剂18；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.02％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.05％，得到红细胞保存试剂19；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.005％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.1％，得到红细胞保存试剂20；

将戊二醛在生理盐水中的质量分数调整为0.005％，同时，将多聚甲醛在生理盐水中的质量分数调整为0.05％，得到红细胞保存试剂21。

实施例3：一种红细胞保存液及其制备方法

本实施例提供了一种红细胞保存液，所述红细胞保存液的成分由生理盐水、戊二醛、多聚甲醛和红细胞组成；所述戊二醛在溶剂中的质量分数为0.005％；所述多聚甲醛在溶剂中的质量分数为0.05％；所述红细胞在生理盐水中的质量分数为5％。

所述红细胞保存液的制备方法如下：

将A、B、O、AB型新鲜红细胞分别用生理盐水洗涤(洗涤的离心参数为：1200rpm离心5min)三次后，留取压积红细胞A；将压积红细胞A用生理盐水稀释至质量分数为10％，得到红细胞稀释液；将红细胞稀释液与实施例1的红细胞保存试剂1按照体积比1：1混合后，先用滚轴·混匀仪于室温(25℃)下滚轴滚动10min，再用生理盐水洗涤(洗涤的离心参数为：1200rpm离心5min)四次，留取压积红细胞B；将压积红细胞B用实施例1的红细胞保存试剂稀释至质量分数为5％，得到红细胞保存液。

实施例4：一种红细胞保存液及其制备方法

本实施例提供了一种红细胞保存液，所述红细胞保存液在实施例3的基础上：将实施例1的红细胞保存试剂1分别替换为实施例2的红细胞保存试剂，得到红细胞保存液。

实验例1：红细胞保存试剂对红细胞的保存能力验证

本实验例根据红细胞试剂相关指标检测对红细胞保存试剂的保存能力进行验证，红细胞试剂相关指标检测包括抗原强度、抗体特异性、上清游离血红蛋白、保存外观和分散性。具体验证过程如下：

实验一：抗原强度检测

使用试管法(试管法凝集强度判读标准见表1)和柱凝胶法(柱凝胶法凝集强度判读标准见表2)对使用实施例3～4的方法所得红细胞保存液中红细胞的抗原强度进行检测；

其中，试管法为：以未醛化A型红细胞为对照，取红细胞保存液将醛化A型红细胞配制成质量分数为5％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置不同时间(24h、1month、2month、3month、4month、5month、6month)后，取100μL红细胞悬液分别与100μL抗-A试剂(购自上海血液生物)混合后，于1000rpm离心1min，取沉淀；肉眼观察沉淀的凝集强度，并将其结果与对照组的未醛化红细胞进行比较，检测及比较结果见图1；

柱凝胶法为：以未醛化A、B型红细胞为对照，取红细胞保存液将醛化A、B型红细胞分别配制成质量分数为0.8％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置不同时间(1month、6month)后，取50μL红细胞悬液分别与50μL抗-A试剂(购自上海血液生物)、抗-B试剂(购自上海血液生物)以及人A、B、O、AB型血浆(来自吉林大学中日联谊医院)混合后，于900rpm离心2min，最后于1800rpm离心8min，取沉淀；观察红细胞在微柱凝胶卡中的分布情况，并将其结果与对照组的未醛化A、B型红细胞进行比较，检测及比较结果见图2～3。

如图1所示，0.005％戊二醛和0.05％多聚甲醛红细胞保存液中红细胞的抗原凝集强度在6个月内为4+，与未醛化处理的红细胞结果一致；0.01％戊二醛和0.05％多聚甲醛红细胞保存液中的红细胞3个月内抗原凝集强度大于2+，后呈现减弱趋势；0.02％戊二醛和0.05％多聚甲醛红细胞保存液中的红细胞24小时内抗原强度为2+，其余时间低于2+。

如图2～3所示，保存6个月时，0.005％戊二醛和0.05％多聚甲醛红细胞保存液中的红细胞和试剂或血浆反应后，微柱凝胶卡中阴性结果背景清晰，而其他红细胞保存液中的红细胞和试剂或血浆反应后，微柱凝胶卡中阴性结果背景不清晰。

实验二：抗体特异性检测

使用试管法(试管法凝集强度判读标准见表1)对使用实施例3～4的方法所得红细胞保存液中红细胞的抗体特异性进行检测；

其中，试管法为：以未醛化A、B型红细胞为对照，取红细胞保存液将未醛化A、B型红细胞分别配制成质量分数为5％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置24h后，取100μL红细胞悬液分别与100μL抗-A试剂(购自上海血液生物)、抗-B试剂(购自上海血液生物)、抗-AB试剂(购自上海血液生物)以及人AB型红细胞血浆(来自吉林大学中日联谊医院)混合后，于1000rpm离心1min，取沉淀；肉眼观察沉淀的凝集强度，并将其结果与对照组的未醛化A、B型红细胞进行比较，检测及比较结果见表3。

如表3所示，醛化红细胞与未醛化红细胞抗体特异性相同；以醛化A型红细胞与未醛化A型红细胞为例，与抗-A抗体试剂、抗-AB试剂出现4+凝集情况；与抗-B抗体试剂反应，凝集结果为阴性。

实验三：上清游离血红蛋白检测

以未醛化A、B型红细胞为对照，取红细胞保存液将未醛化A、B型红细胞分别配制成质量分数为5％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置不同时间(1month、2month、3month、4month、5month、6month)后，使用南京建成血红蛋白检测试剂盒(比色法)对红细胞悬液中的上清游离血红蛋白进行检测，检测结果见图4～5。

如4～5所示，对比未醛化红细胞与醛化红细胞在同一时间的上清游离血红蛋白占比情况，前两个月未醛化红细胞溶血所得上清游离血红蛋白占比小于0.005％戊二醛和0.05％红细胞保存液中红细胞溶血所得上清游离血红蛋白占比；后4个月未醛化红细胞的上清游离血红蛋白明显增加，大于0.005％戊二醛和0.05％红细胞保存液中红细胞溶血所得上清游离血红蛋白。

实验四：外观检测

以未醛化A、B型红细胞为对照，取红细胞保存液将醛化A、B型红细胞分别配制成质量分数为5％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置不同时间(24h、6month)后，通过肉眼观察不同保存时期红细胞保存液中上清液与红细胞压积的分层情况，观察结果见图6～7。

图6可见上层液体清澈，上层液体与红细胞分层明显。图7可见未醛化红细胞上层液体变红，上层液体与红细胞分层明显，而醛化红细胞仍保持上层液体清澈，上层液体与红细胞分层明显。

实验五：分散性检测

以未醛化A、B型红细胞和新鲜A、B型红细胞为对照，取红细胞保存液将醛化A、B型红细胞分别配制成质量分数为5％的红细胞悬液；将红细胞悬液于室温(25℃)下放置6month后，通过镜下观察红细胞保存液中红细胞的分散情况，观察结果见图8。

如8所示，保存6个月时，醛化红细胞在镜下分散性良好，无任何凝集或叠连情况。

表1试管法凝集强度判读标准

表2柱凝胶法凝集强度判读标准

表3红细胞保存液(0.005％戊二醛和0.05％多聚甲醛)中红细胞的抗体特异性检测结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。