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经优化的新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途

文献发布时间：2023-06-19 18:32:25

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及经优化的新型冠状病毒嵌合核酸疫苗、其相关产品及其用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(也称COVID-19)是由新型冠状病毒(也称新冠病毒， SARS-CoV-2)感染导致的一种急性呼吸道传染病。新冠病毒属于冠状病毒科β-冠状病毒属，具有囊膜，是单股正链RNA病毒。新冠病毒表面的刺突蛋白(又称S蛋白)负责病毒与宿主细胞膜受体的结合和膜融合，S蛋白上存在受体结合结构域(RBD)，其是一个重要的疫苗靶点，能激发中和抗体的产生，具有免疫聚焦的优势。

目前，新冠病毒变异株不断出现和流行，特别是，新冠病毒Omicron变异株还存在多种亚型(例如，BA.1，BA.2，BA.1.1， BA.3亚型)，具有超过Delta的传播速度；其中，BA.2亚型毒株的传播速度高于其他的Omicron亚型，现在已经占据了最大的比例。Omicron变异株的S蛋白上具有超过50个氨基酸突变，相比之前的Delta突变株的氨基酸突变大大增多。

由于这些新出现的新冠病毒变异株中S蛋白或RBD的序列存在很多突变，导致现有的基于新冠病毒原型株(Prototype)设计和开发的疫苗所激发的免疫反应在面对变异株(如Omicron变异株)时的效力大大下降，这种变异株突破疫苗、抗体保护的现象称为免疫逃逸。免疫逃逸的现象在Omicron的多种亚型上表现得尤为明显。为了解决新冠病毒变异株的免疫逃逸问题，需要开发新型疫苗以使其适应新出现的变异株(如Omicron 变异株及其各种亚型)，使其对当前的流行株具有较强保护效果；同时，由于目前存在多种变异株(特别是多种Omicron亚型)同时流行的现象，新型疫苗需要能够诱导广谱的免疫反应，以尽可能地同时防范多种新冠病毒毒株，这对于新冠疫情的防控可以起到至关重要的作用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了两种多核苷酸，其相关产品及其在制备用于预防和/或治疗新冠病毒疫苗中的用途，基于所述多核苷酸或其相关产品的嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物，以及包括所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物的试剂盒；其中，一种多核苷酸为编码新冠病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域与Beta变异株S蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽的、经序列优化的DNA分子或mRNA分子，另一种多核苷酸为编码新冠病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域与Omicron变异株S蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽的、经序列优化的DNA分子或mRNA分子，这些多核苷酸均可在体内高水平地表达重组嵌合抗原肽，基于所述多核苷酸的嵌合核酸疫苗针对多种新冠病毒毒株均可提供较强的免疫保护效力，并且在与其他类型疫苗(如灭活疫苗)进行序贯免疫时可诱导针对新冠病毒各型毒株的(即，广谱的)、显著增高的免疫反应水平。

具体地，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如SEQ ID NO:1所示的新型冠状病毒Delta变异株与Beta变异株S蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽；

其特征在于：

所述多核苷酸为DNA分子，所述DNA分子包含或由如下序列之一组成：SEQ ID NO:2、3、4或5所示DNA序列；或者，

所述多核苷酸为mRNA分子，所述mRNA分子包含或由如下序列之一组成：SEQ IDNO:6、7、8或9所示mRNA序列。

第二方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如SEQ ID NO:10所示的新型冠状病毒Delta变异株与Omicron变异株S蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽；

其特征在于：

所述多核苷酸为DNA分子，所述DNA分子包含或由如下序列之一组成：SEQ ID NO:11、12、13或14所示DNA序列；或者，

所述多核苷酸为mRNA分子，所述mRNA分子包含或由如下序列之一组成：SEQ IDNO:15、16、17或18所示mRNA序列。

第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第一或第二方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。

第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第一或第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。

第六方面，本发明提供了如上述第一或第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒的疫苗中的应用；

优选地，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的新型冠状病毒疫苗进行序贯免疫；进一步优选地，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗包括灭活疫苗。

第七方面，本发明提供了一种嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一或第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。

在一个具体实施方案中，所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒DNA 疫苗，所述DNA疫苗包括：

(i)真核表达载体；和

(ii)构建入所述真核表达载体中的、编码如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的DNA序列，其中，所述编码如SEQ ID NO:1所示的重组嵌合抗原肽的 DNA序列选自：SEQ ID NO:2、3、4或5所示DNA序列，所述编码如SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的DNA序列选自：SEQ ID NO:11、12、13或14所示DNA序列；

优选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。

在另一个具体实施方案中，所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：

(I)编码如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的mRNA序列，其中，所述编码如SEQ ID NO:1所示的重组嵌合抗原肽的mRNA序列选自：SEQ ID NO:6、 7、8或9所示mRNA序列，所述编码如SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的mRNA 序列选自：SEQID NO:15、16、17或18所示mRNA序列；优选地，所述mRNA序列为经5’端加帽修饰的；和

(II)脂质纳米颗粒。

在另一个具体实施方案中，所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒- 病毒载体疫苗，其包括：

(1)病毒骨架载体；和

(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的DNA序列，其中，所述编码如SEQ ID NO:1所示的重组嵌合抗原肽的DNA序列选自：SEQ ID NO:2、3、4或5所示DNA序列，所述编码如SEQ ID NO:10所示的重组嵌合抗原肽的DNA序列选自：SEQ ID NO:11、12、13或14所示DNA序列；

可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。

在可行的实现方式中，所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；

优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括如上述第七方面所述的嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的新型冠状病毒疫苗，所述嵌合核酸疫苗或免疫原性组合物与所述其他类型的新型冠状病毒疫苗单独包装；

优选地，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒灭活疫苗。

本发明的发明人设计了编码新冠病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域与Beta变异株S 蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽的、经序列优化的DNA分子或mRNA分子，和编码新冠病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域与Omicron变异株S蛋白RBD结构域的重组嵌合抗原肽的、经序列优化的DNA分子或mRNA分子；这些经序列优化的DNA分子或mRNA分子可在细胞内高水平地表达相应的重组嵌合抗原肽，所表达的重组嵌合抗原肽针对多种新冠病毒毒株均可提供较强的免疫保护效力，并且在与其他类型疫苗进行序贯免疫时可诱导针对新冠病毒各型毒株的(即，广谱的)、显著增高的免疫反应水平；鉴于这些DNA 分子或mRNA分子在体内的高水平表达，以及其所表达的嵌合抗原肽针对多种新冠病毒毒株所提供的广谱且较强的免疫保护效力，因此，基于这些序列优化的DNA分子或 mRNA分子的嵌合核酸疫苗也可针对多种新冠病毒毒株提供广谱且较强的免疫保护效力，这一点儿已得到了实验证实；进一步地，发明人进行的实验还证实，本发明的嵌合核酸疫苗在与其他类型疫苗(如灭活疫苗)进行序贯免疫时可诱导针对新冠病毒各型毒株的(即，广谱的)、显著增高的免疫反应水平。因此，本发明的基于上述序列优化的 DNA分子或mRNA分子的嵌合核酸疫苗将非常适用于当前复杂的疫情防控，具有潜在的临床应用价值和前景。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中构建的新冠病毒原型株RBD二聚体mRNA疫苗(简称PP mRNA疫苗，作为对照疫苗)、Delta变异株RBD与Beta变异株RBD连接形成的嵌合RBD 二聚体mRNA疫苗(简称DB mRNA疫苗)、Delta变异株RBD与Omicron变异株RBD连接形成的嵌合RBD二聚体mRNA疫苗(简称DO mRNA疫苗)的结构示意图；图上标注了 mRNA疫苗的各个区段，其中，5’UTR表示5’端非翻译区，3’UTR表示3’端非翻译区， SP表示信号肽序列，Poly(A)表示多聚腺苷酸尾，Protype RBD表示原型株的RBD序列， Delta RBD表示Delta变异株的RBD序列，BetaRBD表示Beta变异株的RBD序列，Omicron (BA.1)RBD表示Omicron变异株的RBD序列，其中，Delta RBD、Beta RBD和Omicron RBD上还标注了其各自相对于原型株RBD的氨基酸突变。

图2显示了本发明实施例1中所构建的PP、DB、DO mRNA疫苗所激发的体液免疫水平，如实施例3和4中所检测的，其中，LNP代表采用脂质纳米颗粒免疫的阴性对照组；其中，图2a为mRNA疫苗免疫小鼠及采样程序示意图；图2b和图2c分别为在用mRNA 疫苗免疫小鼠后第14天、第28天所采集的血清分别针对新冠病毒原型株、Delta变异株、 Beta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的RBD抗原的结合抗体滴度，在图2b和图2c的柱形图中，每个柱上方的数字表示该柱所代表的抗体滴度与LNP 组中的相应柱所代表的抗体滴度的比值，并且，如图中箭头所示，图2b和2c右侧的热图基于这些数字制作；图2d为在用mRNA疫苗免疫小鼠后第28天所采集的血清在假病毒中和实验中中和新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、 BA.3亚型的假病毒的NT

图3显示了本发明实施例1中所构建的PP、DB、DO mRNA疫苗所激发的细胞免疫水平，如实施例5中所检测的，LNP代表采用脂质纳米颗粒免疫的阴性对照组；其中，图3a为mRNA疫苗免疫小鼠及脾脏样本采集时间示意图；图3b为显示ELISpot检验 mRNA疫苗免疫小鼠后第21天采集的脾脏细胞在分别被4种肽库(新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株亚型BA.1RBD构建的肽库)刺激后产生的 IFNγ+细胞数量的柱形图，柱形图上方的数字表示该柱所代表的IFNγ+细胞数量与LNP 组中相应的柱所代表的IFNγ+细胞数量的比值；所有数据的展示方式为Mean±SEM。

图4显示了采用灭活疫苗与本发明实施例1中所构建的PP、DB、DO mRNA疫苗对小鼠进行序贯免疫后，相较于序贯免疫前(即，未用mRNA疫苗加强的组)，血清结合抗体滴度的提高倍数；其中，图4a为小鼠序贯免疫和血清、脾脏采样程序示意图，IV 代表灭活疫苗；图4b显示了各免疫程序在第35天(以空心圆显示)、第49天(以实心圆显示)所采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3RBD抗原的血清结合抗体滴度水平，以及后者(即，第49天)相对于前者(即，第35天)抗体滴度的提高倍数(每张图上面的“数字×”表示提高倍数)，其中，图4b(i)～(iv)分别代表两次灭活疫苗+PP mRNA疫苗免疫组、两次灭活疫苗+DB mRNA疫苗免疫组、两次灭活疫苗+DO mRNA疫苗免疫组、三次灭活疫苗免疫组。

图5显示了采用灭活疫苗与本发明实施例1中所构建的PP、DB、DO mRNA疫苗对小鼠进行序贯免疫后的免疫反应水平，其免疫程序参照图4a；在各柱形图中，“PP”代表两次灭活疫苗+PP mRNA疫苗免疫组，“DB”代表两次灭活疫苗+DB mRNA疫苗免疫组，“DO”代表两次灭活疫苗+DO mRNA疫苗免疫组，“IV”代表三次灭活疫苗免疫组，“LNP”代表两次灭活疫苗佐剂(即，Al佐剂)+脂质纳米颗粒(LNP)免疫组，作为阴性对照；其中，图5a为第49天采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3抗原的血清结合抗体滴度，在图 5a的柱形图中，每个柱上方的第一行的数字表示该柱所代表的抗体滴度与灭活疫苗(IV) 组中的相应柱所代表的抗体滴度的比值，第二行的数字表示该柱所代表的抗体滴度与 LNP组中的相应柱所代表的抗体滴度的比值，并且如图中箭头所示，图5a右侧的热图基于第二行数字制作；图5b为第49天采集的血清在假病毒中和实验中中和6种假病毒(原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3)的NT

图6为实施例10中所记载的、通过Western Blot检测未优化的DB或DO mRNA和经过序列优化的DB或DO mRNA在细胞内的表达情况图，其中，DB、DO泳道代表未优化的DB、DOmRNA，DB1-4、DO1-4泳道分别代表经过序列优化的DB、DO mRNA，各四种。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：mRNA疫苗的构建、体外制备与包装

按照图1所示的PP、DB和DO mRNA疫苗的结构示意图，发明人设计了一种PP mRNA疫苗、五种DB mRNA疫苗和五种DO mRNA疫苗。

具体方案如下：

PP mRNA疫苗的DNA编码序列如SEQ ID NO:19所示；

五种DB mRNA疫苗分别称为DB、DB1、DB2、DB3和DB4 mRNA疫苗，其中，DB mRNA疫苗的编码区采用未优化版本的DNA编码序列(其序列如SEQ ID NO:20所示)， DB1、DB2、DB3和DB4 mRNA疫苗的编码区则为经过优化的DNA编码序列(其序列分别如SEQ ID NO:2、3、4或5所示)；

五种DO mRNA疫苗分别称为DO、DO1、DO2、DO3和DO4 mRNA疫苗，其中， DO mRNA疫苗的编码区采用未优化版本的DNA编码序列(其序列如SEQ ID NO:21所示)，DO1、DO2、DO3和DO4 mRNA疫苗的DNA编码区则为经过优化的DNA编码序列 (其序列分别如SEQ ID NO:11、12、13或14所示)。

然后，根据下述程序进行mRNA疫苗的构建、体外制备与包装：

1)mRNA疫苗的体外转录和加帽

本实施例中，用于体外转录mRNA疫苗的基础质粒为pUC57，由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

在基础质粒pUC57上，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的DNA表达元件，包括：(1)T7启动子，(2)mRNA疫苗的DNA编码区，(3)在编码区上游的5’端UTR 序列(几种mRNA疫苗的5’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:22所示序列)，(4)信号肽序列(即SP，如SEQ IDNO:23所示序列)，和(5)下游的3’端UTR序列(几种 mRNA疫苗的3’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:24所示序列)，和多聚腺苷酸尾 (Poly-Atail)。

首先，使用限制性内切酶BamHI对上述体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；然后，基于该模板，使用T7RNA 体外转录试剂盒(E131-01A，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)进行体外转录，获得体外转录的mRNA；最后，使用氯化锂回收试剂盒(S125，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，通过氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化，获得提纯的体外转录mRNA。

然后，使用加帽酶试剂盒Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，对上述提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，使用与上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化，获得纯化的经5’端加帽修饰的mRNA。

2)脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)包装mRNA

将阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质按照50：10：38.5：1.5的比例进行混合，然后使用Precision Nano Systems公司生产的Nanoassemblr Benchtop纳米脂质体包装仪，将其与上述5’端加帽修饰的mRNA进行混合、包装。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。完成包装后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iT RibogreenRNAreagent试剂盒，对mRNA包装效率进行鉴定。结果显示，各mRNA疫苗的包装效率均符合使用需求。

实施例2：实验动物免疫和样品采集

本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验；实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组，其中，mRNA疫苗免疫组包括PP mRNA 疫苗免疫组、DB mRNA疫苗免疫组和DO mRNA疫苗免疫组，分别采用上述实施例1所制备的PP mRNA疫苗、DB mRNA疫苗和DO mRNA疫苗进行免疫；所述阴性对照组为 LNP免疫组。

mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种同一种设计的mRNA疫苗(即，PP、DB或DO mRNA疫苗)，阴性对照组的小鼠在同样的时间、注射相同量的空的LNP；接种方法均为肌肉注射，接种剂量为每只小鼠每次5μg mRNA疫苗或空LNP；分别在第14天和第28天采集小鼠血清样本，用于检验免疫小鼠血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。此外，还在第21天采集小鼠脾脏样本，用于检验T细胞免疫。

mRNA疫苗免疫小鼠及采样程序如图2a、3a所示。

实施例3：小鼠血清抗体滴度的检验

用新冠病毒原型株(Protype)、Beta变异株、Delta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的RBD抗原肽(0.2μg/ml，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25-31 所示)分别包被ELISA板，将包被好的ELISA板在5％脱脂牛奶中封闭1小时；然后，将实施例2中的、由各实验组小鼠采集的血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将经过灭活的血清样本从1:200或1:1000开始进行三倍梯度稀释，然后将稀释液加入每个孔，随后将ELISA板在37℃下孵育1小时；将山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(购自柏奥易杰 (EASYBio))添加到板中作为二抗，并在37℃下再次孵育1小时；最后，用3,3',5,5'- 四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，显色完成后用2M盐酸终止反应，使用酶标仪 (PerkinElmer)测量450nm和630nm处的吸光度。通过从同一孔的450nm处的吸光度减去630nm处的吸光度，来计算吸光度值。终点滴度定义为：血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度减去630nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的三分之一。

各实验组小鼠在免疫程序的第14天、第28天所采集的血清针对上述七种新冠病毒RBD抗原的结合抗体滴度分别如图2b和图2c所示，在图2b和图2c中，左侧为终点滴度 vs疫苗种类的柱形图，右侧为相应的热图，所述热图是基于各mRNA疫苗的终点抗体滴度与LNP组的终点抗体滴度的比值制作的，如附图说明中所述。

图2c为抗体水平较为稳定的、第28天血清的结果，由图2c可以看出：

(1)DB mRNA疫苗

针对所测试的新冠病毒原型株和各变异株，DB mRNA疫苗均能诱导出较高的结合抗体水平；并且，其针对各型新冠病毒毒株所诱导的结合抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗，有的高达4倍以上；

(2)DO mRNA疫苗

针对所测试的新冠病毒原型株和各变异株，DO mRNA疫苗均能诱导出较高的结合抗体水平；特别是，其针对Omicron变异株的各亚型所诱导的血清抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗；例如，针对BA.1亚型，DO mRNA疫苗所诱导的抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高2倍以上，针对BA.1.1亚型，DO mRNA疫苗所诱导的抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高5倍以上，针对BA.2亚型所诱导的抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高将近6 倍，针对BA.3亚型所诱导的抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高3倍以上；这提示，本发明的DO mRNA疫苗针对Omicron变异株各亚型均可诱导出明显更高的抗体滴度水平，说明其针对Omicron各型变异株都将具有明显更高的免疫保护效力；并且，DO mRNA对于新冠病毒原型株和其他变异株也诱导出了较高的抗体滴度水平，这提示其具有很好的广谱性。

实施例4：新冠病毒毒株假病毒的包装和血清中和

本实施例中，分别检测上述实施例2所采集的免疫小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的假病毒的50％假病毒中和滴度(pVNT

分别将编码新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的S蛋白的后18位氨基酸的核苷酸去掉，所得核苷酸分别命名为WT-S-del18、Delta-S-del18、BA.1-S-del18、BA.1.1-S-del18、BA.2-S-del18、BA.3-S-del18，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:32～37所示，由苏州金唯智公司进行合成；然后，将这些核苷酸序列各自克隆到pCAGGS表达载体上，分别得到表达质粒pCAGGS-WT-S-del18、 pCAGGS-Delta-S-del18、pCAGGS-BA.1-S-del18、pCAGGS-BA.1.1-S-del18、 pCAGGS-BA.2-S-del18、pCAGGS-BA.3-S-del18。

1)在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞密度至80％左右。培养液为含10％FBS的DMEM培养基。

2)将上文所制备的截短的、新冠病毒各型株的S蛋白的表达质粒，用PEI转染培养皿中的细胞(30μg/10cm细胞培养皿)。目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，37℃培养24h。

3)将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。

4)收上清，3000rpm离心10min，在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。

通过上述步骤，分别得到新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的假病毒。

将实施例2中的、于第28天采集的各实验组小鼠血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将灭活后的血清样本进行稀释，从1:80开始进行2倍梯度稀释。然后，将每种假病毒与等体积的稀释后血清混合，在37℃下孵育1小时。取100μl病毒-血清混合物加入到 96孔板中预铺板的Vero细胞上。孵育15小时后，使用CQ1共聚焦图像细胞仪，检测转导单位(TU)数，从而计算免疫小鼠血清对上述新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron 变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的假病毒的中和能力。

结果如图2d所示；如图2d的附图说明中所述，图2d的左侧柱形图显示了各免疫组血清中和原型株、Delta变异株和Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的假病毒的pVNT

由图2d可以看出：

(1)DB mRNA疫苗针对原型株、Delta变异株、Omicron变异株各亚型所诱导的血清中和抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗；具体地，DB mRNA疫苗针对原型株所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高3倍以上，针对Delta变异株所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高5倍以上，针对Omicron变异株BA.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近45倍，针对Omicron变异株BA.1.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近30倍，针对Omicron变异株BA.2亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高将近48倍，针对Omicron变异株BA.3亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高将近69倍；这提示，本发明的DB mRNA疫苗针对新冠病毒各型毒株均可诱导出明显更高的中和抗体滴度水平，说明其针对新冠病毒各型毒株都将具有明显更高的免疫保护效力。

(2)DO mRNA疫苗针对原型株、Delta变异株、Omicron变异株各亚型所诱导的血清中和抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗；具体地，DO mRNA疫苗针对原型株所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高将近13倍，针对Delta变异株所诱导的中和抗体滴度水平比PP mRNA疫苗高将近5倍，针对Omicron变异株BA.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近200倍，针对Omicron变异株BA.1.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近163倍，针对Omicron变异株BA.2亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近230倍，针对Omicron变异株BA.3亚型所诱导的中和抗体滴度水平比PPmRNA疫苗高将近407倍；这提示，本发明的DO mRNA疫苗针对新冠病毒各型毒株均可诱导出明显更高的中和抗体滴度水平，说明其针对新冠病毒各型毒株都将具有明显更高的免疫保护效力。

实施例5：mRNA疫苗诱导细胞免疫水平的评价

本实施例中，采用实施例2中的、于第21天采集的各实验组小鼠的脾脏样本(小鼠免疫和脾脏样本采集时间示意图如图3a所示)，检测mRNA疫苗诱导的细胞免疫水平。

具体方法如下：

用细胞匀浆器在1ml无血清DMEM中将小鼠脾脏细胞制备成单细胞匀浆，用40μm 细胞过滤器过滤，用红细胞裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，R1010)裂解红细胞；然后，细胞经过清洗液(PBS+0.5％FBS)清洗后，用0.4％台盼蓝溶液(Gibco，15250061) 染色，使用Cell drop FL自动细胞计数器进行计数。

将10μg/ml anti-mouse IFN-γ抗体(购自BD公司)在平底96孔板中在4℃过夜孵育，以包被该平底96孔板，第二天，在室温下封闭2小时。将新鲜的小鼠脾脏单细胞悬液 (4×10

结果如图3b所示，由图3b可知，在使用上述四种新冠病毒RBD肽库刺激后，DB、 DOmRNA疫苗免疫的小鼠脾脏细胞所产生的IFN-γ+细胞的数量与PP mRNA疫苗免疫的小鼠相当，它们均远远高于LNP对照组，这表明：DB、DO mRNA疫苗均能有效激发细胞免疫应答，并且其所激发的细胞免疫水平与PP mRNA疫苗相当。

实施例6：mRNA疫苗与灭活疫苗的序贯免疫

本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验，所用灭活疫苗来自国药中生BBBIP-CorV。

实验分组为：三次灭活疫苗免疫组(即，“IV”组)、两次灭活疫苗+PP mRNA疫苗免疫组(简称“PP”组)、两次灭活疫苗+DB mRNA疫苗免疫组(简称“DB”组)、两次灭活疫苗+DOmRNA疫苗免疫组(简称“DO”组)和灭活疫苗佐剂+LNP免疫组(简称“LNP”组，作为阴性对照组)。

“IV”组：所有小鼠在第0天、第21天和第35天分别接种一剂灭活疫苗；

“DB”组、“DO”组：所有小鼠在第0天、第21天分别接种一剂灭活疫苗，然后在第35天接种一剂相应的mRNA疫苗；

“LNP”组：所有小鼠在第0天、第21天接种灭活疫苗的佐剂——Al佐剂，在第35 天接种空的LNP。

上述各疫苗的接种方法均为肌肉注射，其中，灭活疫苗接种剂量为每只小鼠每次2.6 U(为人用剂量的0.4剂)，各mRNA疫苗或空的LNP的接种剂量为每只小鼠每次5μg。

分别在第35天和第49天采集小鼠血清样本，用于检验免疫小鼠血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。此外，在第49天还采集了小鼠脾脏样本，用于检验T细胞免疫。

小鼠序贯免疫和血清、脾脏样本采样程序示意图如图4a所示。

实施例7：序贯免疫小鼠血清对新冠病毒各毒株RBD抗原的结合抗体滴度水平检测

本实施例中，采用实施例3中所记载的方法，检测了实施例6中所采集的各免疫组小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的RBD抗原的结合抗体滴度。

结果如图4b所示。其中，图4b(i)～(iv)分别显示了以PP、DB、DO和灭活疫苗进行第三次加强免疫的组，前三组为序贯免疫，最后一组为对照；如附图说明中所述，其显示了各免疫程序在第35天(以空心圆显示)、第49天(以实心圆显示)所采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、 BA.2、BA.3RBD抗原的结合抗体滴度水平，以及后者(即，第49天)相对于前者(即，第35天)结合抗体滴度的提高倍数(每张图上面的“数字×”表示提高倍数)，这种血清抗体滴度的提高倍数反映了采用mRNA疫苗进行序贯免疫后、较序贯免疫前的抗体滴度水平的提高程度；由这些结果可知：采用各mRNA疫苗进行序贯免疫后，其血清抗体滴度水平基本上均较序贯免疫前有显著提高，表明：本申请的mRNA疫苗可用于序贯免疫，以加强免疫反应水平。

此外，与PP mRNA疫苗序贯免疫组相比：

1)DB mRNA疫苗序贯免疫组

针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株和Omicron亚型BA.2变异株，DBmRNA疫苗序贯免疫后血清抗体滴度的提高倍数均远远高于PP mRNA疫苗，最多可高出将近6倍(针对Beta变异株)；

2)DO mRNA疫苗序贯免疫组

针对上述七种新冠病毒毒株，DO mRNA疫苗序贯免疫后血清抗体滴度的提高倍数均远远高于PP mRNA疫苗，最多可高出5倍以上(针对原型株)。

此外，各免疫组在第49天采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3抗原的结合抗体滴度结果如图 5a所示。

图5a显示，与PP mRNA疫苗序贯免疫组相比：

1)DB mRNA疫苗序贯免疫组

针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株和Omicron亚型BA.2变异株，其所诱导的结合抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗；而针对其他类型毒株，两者所诱导的结合抗体滴度水平相当；

2)DO mRNA疫苗序贯免疫组

针对上述七种新冠病毒毒株，其所诱导的结合抗体滴度水平均远远高于PP mRNA疫苗。

实施例8：序贯免疫小鼠血清对新冠病毒各毒株的假病毒的抑制效果的评价

本实施例中，采用实施例4中所记载的方法，检测了实施例6中在第49天所采集的各免疫组小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Beta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3亚型的假病毒的中和抗体滴度。

结果如图5b所示。图5b显示：与PP mRNA疫苗序贯免疫组相比：

1)DB mRNA疫苗序贯免疫组

针对除新冠病毒Omicron BA.1.1以外的其他所有类型毒株的假病毒所诱导的中和抗体滴度水平，DB mRNA疫苗均显著高于PP mRNA疫苗；而针对新冠病毒Omicron BA.1.1假病毒所诱导的中和抗体滴度水平，DB mRNA疫苗与PP mRNA疫苗效果相当；

2)DO mRNA疫苗序贯免疫组

针对新冠病毒Omicron变异株的各亚型毒株的假病毒，其所诱导的中和抗体滴度水平高于PP mRNA疫苗，或与其相当。

实施例9：序贯免疫所诱导细胞免疫水平的评价

本实施例中，采用实施例5中所记载的方法，和实施例6中在第49天所采集的各免疫组小鼠的脾脏样本，检测序贯免疫所诱导的细胞免疫水平。

结果如图5c所示，由图5c可知，在使用上述四种新冠病毒RBD肽库刺激后，DB、 DOmRNA疫苗序贯免疫的小鼠脾脏细胞所产生的IFN-γ+CD4+、IFN-γ+CD8+细胞的数量与PPmRNA疫苗序贯免疫的小鼠相当，它们均远远高于LNP对照组，这表明：采用DB、DO mRNA疫苗进行的序贯免疫均能有效激发细胞免疫应答，并且其所激发的细胞免疫水平与PP mRNA疫苗序贯免疫组相当。

实施例10：经序列优化的DB或DO mRNA的细胞内表达效果检验

本实施例中，通过如下实验，检验了实施例1中所构建的未优化的DB mRNA疫苗、经过序列优化的DB1、DB2、DB3和DB4 mRNA疫苗、未优化的DO mRNA疫苗、经过序列优化的DO1、DO2、DO3和DO4 mRNA疫苗的mRNA在细胞内的表达效果。

具体程序如下：

1)mRNA转染

在12孔板中铺HEK293T细胞，使第二天细胞密度至50％左右。分别将1μg未优化的DB或DO mRNA、经过序列优化的DB或DO mRNA(各4种)与TransIT-mRNA试剂(2μl) 和增强试剂(2μl)一起加入100ul无血清Opti-MEM中，孵育3分钟，然后滴加到12孔板中。转染后36小时，收集上清液。

未优化的DB mRNA序列如SEQ ID NO:38所示；

未优化的DO mRNA序列如SEQ ID NO:39所示；

经过序列优化的DB1、DB2、DB3和DB4 mRNA序列分别如SEQ ID NO:6、7、8或 9所示；

经过序列优化的DO1、DO2、DO3和DO4 mRNA序列分别如SEQ ID NO:15、16、 17或18所示。

2)Western Blot

将步骤1)所得上清液样品与含有二硫苏糖醇(DTT)的loading buffer混合，通过10％SDS-PAGE分离；分离完成后进行转膜，将蛋白转移到PVDF膜上；然后，用5％脱脂牛奶稀中封闭膜，用SARS-CoV-2Spike/RBD一抗(Sino Biological)和山羊抗兔 IgG-HRP(EASYBio)二抗先后孵育PVDF膜各1小时；最后，使用Beyotime Beyo ECL Plus显色液显色。

其结果如图6所示，图6显示了未优化的和经序列优化的DB或DO mRNA在细胞内的表达情况；由图6可知，与未优化的DB mRNA相比，经过序列优化的四种DB mRNA 在细胞内的表达水平明显增高，并且，与未优化的DO mRNA相比，经过序列优化的四种DO mRNA在细胞内的表达水平明显增高；这些结果提示，DB1、DB2、DB3和DB4 mRNA疫苗较DB mRNA疫苗有更高的体内表达水平，DO1、DO2、DO3和DO4 mRNA 疫苗较DO mRNA疫苗有更高的体内表达水平。

鉴于上述，经过序列优化的四种DB mRNA与未优化的DB mRNA均表达相同的嵌合抗原肽，而前者的细胞内表达效率明显高于后者，由此可知，经过序列优化的四种DB mRNA作为嵌合核酸疫苗将诱导明显高于未优化的DB mRNA的免疫水平；同理，经过序列优化的四种DO mRNA与未优化的DO mRNA均表达相同的嵌合抗原肽，而前者的细胞内表达效率明显高于后者，由此可知，经过序列优化的四种DO mRNA作为嵌合核酸疫苗将诱导明显高于未优化的DO mRNA的免疫水平；这一点也得到了发明人进一步的实验验证。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 经优化的新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途

<130> 1087-220107F

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 434

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> DB核酸疫苗所编码的重组嵌合抗原肽

<222> (1)..(434)

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

210 215 220

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

225 230 235 240

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

245 250 255

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

260 265 270

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

275 280 285

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

290 295 300

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

305 310 315 320

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

325 330 335

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

340 345 350

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

355 360 365

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn

370 375 380

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val

385 390 395 400

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

405 410 415

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

420 425 430

Asn Lys

<210> 2

<211> 1302

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> 经过序列优化的DB1mRNA疫苗的DNA编码序列

<222> (1)..(1302)

<400> 2

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc ggtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaaa 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttgt gcagcccacc 660

gagagcatcg tgcggttccc caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 720

gccacccggt tcgccagcgt gtacgcctgg aaccggaagc ggatcagcaa ctgcgtggcc 780

gactacagcg tgctgtacaa cagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgagc 840

cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgg 900

ggcgacgagg tgcggcagat cgcccccggc cagaccggca acatcgccga ctacaactac 960

aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggacagc 1020

aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac cggctgttcc ggaagagcaa cctgaagccc 1080

ttcgagcggg acatcagcac cgagatctac caggccggca gcaccccctg caacggcgtg 1140

aagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct tccagcccac ctacggcgtg 1200

ggctaccagc cctaccgggt ggtggtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1260

gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca ag 1302

<210> 3

<211> 1302

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> 经过序列优化的DB2 mRNA疫苗的DNA编码序列

<222> (1)..(1302)

<400> 3

cgggtgcagc ccaccgagag catcgtgcgg ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60

ggcgaggtgt tcaacgccac ccggttcgcc agcgtgtacg cctggaaccg gaagcggatc 120

agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag caccttcaag 180

tgctacggcg tgagccccac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 240

agcttcgtga tccggggcga cgaggtgcgg cagatcgccc ccggccagac cggcaagatc 300

gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaacagc 360

aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaactacc ggtaccggct gttccggaag 420

agcaacctga agcccttcga gcgggacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcaag 480

ccctgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag 540

cccaccaacg gcgtgggcta ccagccctac cgggtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 600

cacgcccccg ccaccgtgtg cggccccaag aagagcacca acctggtggt ccaaccaaca 660

gaatctattg ttagatttcc taatattaca aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac 720

gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct 780

gattattctg tcctatataa ttccgcatca ttttccactt ttaagtgtta tggagtgtct 840

cctactaaat taaatgatct ctgctttact aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga 900

ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg caaactggaa atattgctga ttataattat 960

aaattaccag atgattttac aggctgcgtt atagcttgga attctaacaa tcttgattct 1020

aaggttggtg gtaattataa ttacctgtat agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct 1080

tttgagagag atatttcaac tgaaatctat caggccggta gcacaccttg taatggtgtt 1140

aaaggtttta attgttactt tcctttacaa tcatatggtt tccaacccac ttatggtgtt 1200

ggttaccaac catacagagt agtagtactt tcttttgaac ttctacatgc accagcaact 1260

gtttgtggac ctaaaaagtc tactaatttg gttaaaaaca aa 1302

<210> 4

<211> 1302

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> 经过序列优化的DB3 mRNA疫苗的DNA编码序列

<222> (1)..(1302)

<400> 4