一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物法生产高含量天然小分子RNA的方法。

背景技术

酵母是一种天然存在的单细胞真菌，酵母的营养价值极高，含有丰富的蛋白质、核酸、维生素和微量元素等营养物质，核酸是生命的最基本物质之一，根据化学组成不同，核酸可分为脱氧核糖核酸(以下简称DNA)和核糖核酸(以下简称RNA)。从酵母中提取的天然RNA类物质目前已广泛应用于医药、保健食品以及婴幼儿食品中。

RNA是由多种核糖核苷酸聚合而成的一种多聚核糖核苷酸，RNA种类较多，一般分子大小大约在300个核苷酸以下的RNA称为小分子RNA。小分子RNA在生命体内发挥着重要的作用，它在细胞生长和凋亡，细胞分化，基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，胚胎发育等过程中发挥重要作用。目前，小分子RNA多数以合成的方法进行生产，对天然小分子RNA的提取主要集中在以动物和植物为原料，利用生物发酵法大规模生产高含量天然小分子RNA的方法尚未见报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供了一种利用生物法生产高含量天然小分子RNA的方法。本发明通过诱变选育获得高核糖核酸含量的产朊假丝酵母菌种(又称杰丁塞伯林德纳氏酵母)，经发酵培养后得到的酵母浆，在酶的作用下进行酶解，再经过提取，分离，干燥等后续工艺得到高含量的天然小分子RNA。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供一株产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)ZAB 01，于2022年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25374，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路一号院三号。

本发明另一方面提供一种利用上述的产朊假丝酵母ZAB 01生产小分子RNA的方法，主要包括以下步骤：

(1)将产朊假丝酵母ZAB 01在种子培养基中扩培后，接种到发酵培养基中，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母；

(2)将步骤(1)获得高核糖核酸含量的酵母经过酶解反应、提取、分离和干燥，获得小分子RNA。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)包括以下步骤：

1)将产朊假丝酵母ZAB 01接种于液体种子培养基中，培养温度为25～35℃，通风搅拌培养6～24h，获得种子菌液；

2)将步骤1)得到的种子菌液接种至发酵培养基中，通风搅拌发酵，发酵温度为25～40℃，发酵后获得高核糖核酸含量的酵母。

基于上述技术方案，进一步地，步骤1)和步骤2)中空气流量为0.01-1.5VVM，搅拌速度100～300rpm。

基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的碳源包括糖蜜、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖、果糖和D-木糖。

基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的氮源包括蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素、硝酸钾、氨水和铵盐。

基于上述技术方案，进一步地，所述的液体种子培养基和发酵培养基中的磷源包括磷酸和磷酸盐。

基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中发酵方式为间歇发酵、半连续发酵和连续发酵中的任意一种。

基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)包括以下步骤：

1)酶解反应：将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，利用酵母自身的酶酶解酵母中的RNA，酶解反应结束后，降温至室温；

或者，将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆，移到酶反应容器中，升温至40～60℃，保温1～96h，降温至20～40℃，加入酵母菌体0.0001～0.1wt％的核糖核酸酶，酶解1～10h，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶酶解酵母中的RNA，反应结束后，降温至室温；

2)提取：通过离心将步骤1)得到的酵母浆酶解液浓缩，使浓缩液中干物质浓度为5-15％，然后利用盐法、碱法或盐碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取；

3)分离：离心步骤2)得到的浆液，所得的轻相液体经超滤膜过滤处理，将所得的滤过液降温至1～10℃，调节pH值至1～3，使小分子RNA沉淀；

4)干燥：除去小分子RNA沉淀中的水分，再经过干燥得到小分子RNA。

基于上述技术方案，进一步地，步骤1)中酵母浆中酵母的浓度为1-20wt％。

基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述盐法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入食盐或食盐水溶液，调节NaCl的浓度为5％～15％，继续保温30min～5h，之后冷却至室温，调节pH值至中性。

基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述碱法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入NaOH或者NaOH水溶液，调节pH值为8～11，保温30min～5h，冷却至室温，调节pH值至中性；

或者，将浓缩液中加入NaOH或者NaOH水溶液，调节NaOH的浓度为0.5％～5％，降温至0～10℃，保温30min～5h，调节pH值至中性。

基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中所述盐碱法具体为：将浓缩液升温至80℃～95℃，加入食盐或食盐水溶液，调节NaCl的浓度为1％～10％，同时加入NaOH或者NaOH水溶液，调节pH值为8～11，保温30min～5h，冷却至室温，调节pH值至中性。

基于上述技术方案，进一步地，步骤3)中所述的超滤膜过滤处理的具体过程：采用超滤机，利用不同截留分子量的超滤膜，获得不同分子量的小分子RNA，(例如利用截留分子量为10000Da或100000Da的超滤膜，获得分子量10000Da以下或100000Da以下的小分子RNA，也可分别利用截留分子量为10000Da和100000Da的超滤膜，获得分子量10000～100000Da的小分子RNA)，运行压力：0.2MPa，温度35℃。

基于上述技术方案，进一步地，步骤2)和步骤3)中离心的转速为5000～8000rpm。

本发明还提供上述方法得到的小分子RNA。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明通过诱变筛选获得一株高产核糖核酸且产量稳定的产朊假丝酵母，以添加了无机盐以及磷酸的糖蜜为培养基，发酵培养后得到核酸含量较高的酵母浆(菌体RNA含量在18％以上)，所得的酵母浆转移到酶反应容器中，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶酶解酵母细胞中的RNA，酶反应结束后，再利用盐法、碱法或盐碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取，离心后得到的轻相液体利用超滤膜进行过滤，调节pH值使小分子RNA沉淀，最后经干燥得到小分子RNA成品，小分子RNA的收率均在60％以上。

2.利用该方法生产的小分子RNA，来源纯天然，比合成方法生产的小分子RNA更易于吸收利用，而且利用生物发酵的方法生产，与利用动物和植物为原料进行提取相比，原料来源稳定易得，成本较低，操作简便，安全环保，更易于工业化大规模的生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为实施例1筛选获得的4株产量较高的菌株核糖核酸含量稳定性评价结果。

图2为产朊假丝酵母ZAB 01在麦芽汁琼脂斜面培养后的图片。

图3为产朊假丝酵母ZAB 01在液体培养基中培养后酵母形态的图片；

图4为500L发酵罐中发酵过程中产朊假丝酵母ZAB 01的菌体浓度以及RNA含量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

本实施例以生产中使用的产核糖核酸的产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)为出发菌株筛选能够高产核糖核酸的产朊假丝酵母，主要包括以下步骤：

(1)首先将出发菌株接种到液体种子培养基，进入对数生产期时，将适量的菌液转移到无菌培养皿中，于30W紫外线灯下(距离为30cm)对菌悬液进行紫外照射诱变处理，死亡率控制在90％左右，然后将悬浮液在无菌环境下于麦芽汁固体平板上涂布，放置于黑暗环境中，于温度为30±2℃的培养箱中倒置培养48h，挑选生长良好的菌株；

(2)将步骤(1)挑选的生长良好的菌株分别接种到液体种子培养基中，待菌液OD

(3)将步骤(2)挑选的生长良好的菌株分别接种到10mL的液体种子培养基中，于温度为30±2℃，150rpm条件下培养24h，然后以10％的接种量转接到50mL液体发酵培养基中，于温度为30±2℃，200rpm条件下培养12h，检测发酵所得的产朊假丝酵母中的核糖核酸含量，筛选获得4株产量较高的菌株，分别编号为A、B、C和D；

(4)将步骤(3)筛选获得4株产量较高的菌株分别以10％的接种量转接到液体发酵培养基中，于温度为30±2℃，200rpm条件下培养12h，再将所得的菌液转接到新的液体发酵培养基中，重复上述操作5次，检测每次发酵所得的产朊假丝酵母中的核糖核酸含量，结果如图1所示(进行三组平行实验)，由图1可以看出，菌株B产量最高且产量稳定，该菌株命名为ZAB 01，于2022年07月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25374，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路一号院三号。

产朊假丝酵母ZAB 01具有如下特征：

在麦芽汁琼脂斜面上，菌落呈乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐，如图2所示。

液体培养基中培养(30℃)3天后，细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为3～5μm×7～13μm，如图3所示。

本实施例中使用的培养基的配方如下所示：

(1)麦芽汁固体培养基：麦芽汁150mL、琼脂3g，115℃高压灭菌20分钟后，冷却后无菌条件下倒平板即得。

(2)液体种子培养基：糖蜜35g/L、酵母膏10g/L、硫酸铵15g/L，115℃高压灭菌20分钟即得。

(3)液体发酵培养基：糖蜜50g/L、硫酸镁1.5g/L、硫酸铵1.5g/L、硫酸锌0.3g/L、硫酸亚铁0.3g/L、氯化钠0.2g/L、磷酸3mL/L，115℃高压灭菌20分钟即得。

本实施例中核糖核酸含量的测定方法如下：取5mL发酵菌液于10ml离心管内，在5000r/min离心10min，弃上清，称量菌体湿重；用10mL生理盐水悬浮菌体，5000rpm离心5min，再用10mL生理盐水悬浮后取2mL菌悬液于干净试管，加入2mL高氯酸，摇匀，在65～70℃下保温20min(每4-5min振摇1次)，取1mL加入离心管中，用紫外分光光度计于260nm处测OD；核糖核酸含量测定的公式为：RNA(％)＝A/(w×R×32)×稀释倍数×100；其中，A为OD

实施例2

本实施例选用实施例1中筛选的产朊假丝酵母ZAB 01进行发酵培养，主要包括以下步骤：

(1)将实施例1筛选的产朊假丝酵母ZAB 01经扩大培养后接种于1000mL液体种子培养基中，于温度为30±2℃，180rpm条件下摇床培养24h，然后以5％的接种量转接到装有液体种子培养基的10L发酵罐中，罐温为30±2℃，控制罐压在0.5-1kPa之间，空气流量0.8-1.0VVM，搅拌速度150rpm，通风搅拌培养12h，获得种子菌液；

(2)将步骤(1)得到的种子菌液接种至装有300L液体发酵培养基的500L发酵罐，控制发酵罐压力5-10kPa，空气流量0.8-1VVM，搅拌速度110rpm，罐温维持在30±2℃；

(3)当发酵罐内糖蜜浓度降低至5g/L时，开始流加液体发酵培养基以维持发酵罐内糖蜜浓度在5g/L左右，24h后停止补料，于28h终止发酵。

500L发酵罐中发酵过程中产朊假丝酵母ZAB 01的菌体浓度以及RNA含量检测结果如图4所示(进行三组平行实验)，由图4可以看出，产朊假丝酵母ZAB 01种子菌液接种至发酵罐后，短时间内菌体繁殖速度明显快，干菌浓度高达28.1g/L，菌体RNA含量均在18％以上。

实施例3

本实施例选用实施例2制备的发酵液制备小分子RNA的方法，主要包括以下步骤：

(1)酶解反应：将发酵后经过分离得到的酵母加水制得酵母浆(酵母的浓度为10wt％)，转移到酶反应容器中，升温至50℃，保温24h，降温至37℃，加入酵母菌体0.02wt％的核糖核酸酶Ⅰ，利用酵母自身的酶和加入的核糖核酸酶Ⅰ进行酶促反应，以酶解酵母细胞中的RNA，酶解5h，反应结束后，降温至室温；

(2)提取：利用离心机(6000rpm)将经酶解反应后的酵母浆通过离心进行浓缩，使浓缩液中的干物质浓度浓缩至11％，之后利用盐法对酵母浆中的RNA类物质进行提取：将得到的酵母浆快速升温至85℃，在酵母浆中加入食盐，调节酵母浆中NaCl的浓度为10％，之后升温至95℃，继续保温3h，之后冷却至室温，用HCl调酵母浆pH值至中性；

(3)提取后的浆液用离心机进行离心(6000rpm)，离心后得到的轻相液体，将得到的轻相液体浓缩，利用截留分子量为10000Da和100000Da的超滤膜进行超滤处理，截留获得10000Da～100000Da的小分子RNA，降温至10℃，用磷酸调节pH值至2，使小分子RNA沉淀；

(4)干燥：通过吸滤机吸滤的方式除去小分子RNA沉淀中水分，再经酒精洗涤后通过真空抽滤后进入闪蒸干燥机干燥得到小分子RNA。

根据酵母的投料量和小分子RNA的产量，计算得到小分子RNA的收率为60.5％。

实施例4

本实施例具体过程与实施例3相同，区别仅在于提取过程中利用碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取，具体过程如下：

方法一：将得到的浓缩液快速升温至60℃，加入NaOH，调节pH值为11，继续保温2h，冷却至室温，用HCl调节pH值至中性。

方法二：将得到的浓缩液中加入NaOH，调节浓缩液中NaOH的浓度为1％，之后降温至10℃，继续保温30min，之后用HCl调节pH值至中性。

采用方法一的提取方法时，根据酵母的投料量和小分子RNA的产量，计算得到小分子RNA的收率为61.2％。

采用方法二的提取方法时，根据酵母的投料量和小分子RNA的产量，计算得到小分子RNA的收率为62.8％。

实施例5

本实施例具体过程与实施例3相同，区别仅在于提取过程中利用盐碱法对酵母浆中的RNA类物质进行提取，具体过程如下：

将得到的浓缩液快速升温至60℃，加入食盐，调节浓缩液中NaCl的浓度为5％，同时在酵母浆中加入NaOH，调节pH值为11，继续保温30min，之后再冷却至室温，用HCl调节pH值至中性。

根据酵母的投料量和小分子RNA的产量，计算得到小分子RNA的收率为63.2％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。