胰腺癌预后分子标志物NLRC4及检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种胰腺癌预后分子标志物NLRC4及检测试剂盒及其应用。

背景技术

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，其发病隐匿、进展迅速、手术切除率低、放化疗效果不佳，预后极差，总体5年生存率不到5％，在全球癌症发病率中占第13位，排在所有恶性肿瘤致死原因的第四位。大多数的胰腺癌患者往往确诊时已出现淋巴、肝或血运转移，从而失去了根治性手术治疗的机会。胰腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤早期即发生局部侵袭或远处转移，也是制约患者预后的主要因素。目前胰腺癌的侵袭转移机制尚不明确，了解胰腺癌的恶性生物学行为发生机制，并给予适当的干预措施，对于提高胰腺癌的临床诊治水平并改善患者的预后具有十分重要的现实意义。

目前，临床上主要通过检测血清中肿瘤标志物(CA199、CEA、CA125)的变化并结合临床症状、影像学诊断、病理学检查对胰腺癌做出诊断及预后判断，但是其水平变化并不能直接代表肿瘤组织分子生物学的改变，并且对胰腺导管腺癌的早期诊断以及治疗预后评价的准确性低、特异性较差，需要大量的人力财力支持。其中：针对胰腺癌患者的手术标本可进行多种肿瘤标志物的检测，因此我们迫切需要其它的可以简便，准确，特异判断胰腺癌病人预后的标志物，来评估肿瘤患者的治疗情况和预后状况，并选择最佳的治疗方式，以提高患者生活质量和生存率。

发明内容

针对临床上还没有理想的分子指标来评估胰腺癌预后及发生转移的风险，本发明所要解决的技术问题是提供一种新的、可以准确且特异性判断胰腺癌预后的生物标志物及检测试剂盒及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种用于预估胰腺癌疗效或预后的分子标志物，所述分子标志物为NLRC4。其中，所述胰腺癌优选胰腺导管腺癌。

NLRC4是NOD样受体家族中的一员，主要感受细菌的鞭毛蛋白和III型分泌系统等成分，从而引发对相关病原菌入侵的免疫应答。NLRC4在正常情况下通过自抑制作用处于静息状态；当病原菌成分进入细胞内时，会被另一类NOD样受体家族蛋白--NAIP亚家族蛋白所识别并激活，从而进一步活化NLRC4；活化的NLRC4会发生自身多聚化并招募Caspase-1，形成炎症小体，产生一系列的免疫应答反应。本发明通过一些列的基因筛选方法筛选出促进胰腺癌侵袭转移的基因之一：NLRC4；并在此基础上，通过免疫组化试验确定NLRC4在胰腺癌肿瘤细胞中表达，且表达量与胰腺癌侵袭转移高度相关；其中：胰腺癌肿瘤细胞中高表达NLRC4者与术后复发转移相关，其无复发生存期(Relapse-freesurvival，RFS)及总生存期(Overall Survival，OS)短；因此，可将其作为判断胰腺癌预后的分子标志物，单独或协同其它分子标志物作为胰腺癌患者预后判断的重要指标，指导胰腺癌患者手术后用药，进而患者提高生存质量。

本发明所述的胰腺癌预后分子标志物NLRC4可应用于制备胰腺癌预后的检测试剂盒中；所述检测试剂盒包括NLRC4、NLRC4的片段或NLRC4抗体。

本发明的另一方面是提供一种可以快速检测NLRC4表达量的免疫组化试剂盒，包括酶标一抗、酶标二抗、抗体稀释液、显色液和磷酸盐缓冲液；其中：所述酶标一抗为酶标NLRC4抗体；所述酶标二抗为羊抗小鼠IgG或兔IgG；所述显色液是HRP显色液。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

1、本发明通过多种不同的基因筛选方法，筛选得到促进胰腺癌侵袭转移的基因NLRC4；并通过选取104例初次手术人胰腺癌组织芯片，进行NLRC4免疫组化，对组化结果进行评分，将其分为在NLRC4高表达组及NLRC4低表达组，并根据随访统计绘制OS、RFS生存曲线，经试验验证NLRC4在胰腺癌间质的表达量与胰腺癌侵袭转移高度相关，与OS、RFS呈负相关，由此得到NLRC4在胰腺癌肿瘤细胞中高表达时，胰腺癌患者具有不良预后，因此，NLRC4能够作为预估胰腺癌疗效或预后的分子标志物，用以判断或协同其它分子标志物共同评估胰腺癌的治疗情况和预后状况，以提高患者生存质量。

2、本发明提供的胰腺癌疗效预测或预后的分子标志物NLRC4以及含有该分子标志物抗体的免疫组化试剂盒能够应用于胰腺癌疗效预测或预后，具有灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。

3、本发明提供的免疫组化试剂盒能够快速检测NLRC4的表达量，并通过评分方法快速评价NLRC4表达量，可以直接地判断胰腺癌患者的诊疗效果，病情进展以及预后评估，继而实现指导胰腺癌患者手术后用药，提高患者提高生存率，降低复发风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明筛选促进胰腺癌侵袭转移的基因NLRC4的过程图；

图2为本发明筛选促进胰腺癌侵袭转移的基因NLRC4数据统计图；其中：A)采用CRISPR文库筛选肝转移相关基因数据统计图；B)采用单细胞测序方法筛选肝转移相关基因火山图；C)转录组测序KEGG富集分析差异基因散点图；D)三种筛选方法取得的基因交集结果图；

图3为胰腺癌组织芯片NLRC4免疫组化染色图；其中：图(a)为NLRC4-high组免疫组化染色图；图(b)为NLRC4-low组免疫组化染色图。

图4为NLRC4-high组NLRC4-low组RFS、OS曲线绘制图。

图5为TCGA数据库中不同NLRC4表达组RFS、OS的曲线绘制图。

图6为随访过程中不同NLRC4表达组出现肝转移的统计分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

试验例：一、筛选出促进胰腺癌侵袭转移的基因NLRC4，具体方法如下：

如图1、2所示，本申请采用CRISPR文库筛选出肝转移相关基因(图2A)；采用单细胞测序方法筛选出肝转移相关基因(图2B)；采用转录组测序KEGG富集分析差异基因(图2C)；取上述三种筛选方法的基因交集得到39种基因，如图2D所示，部分数据统计结果如下表所示：(上述三种基因筛选方法均为现有技术，本发明不再赘述)

表1

取上述三种筛选方法的基因交集得到排名靠前的基因，NLRC4排名第一，所以将NLRC4作为最终筛选得到促进胰腺癌侵袭转移的基因。

二、将NLRC4作为判断胰腺癌治疗疗效或预后的分子标志物，并根据NLRC4的表达量判断胰腺癌患者的诊疗效果，病情进展以及预后评估。

(1)通过免疫组化染色快速检测NLRC4表达量：

通过免疫组化的方法，利用HRP偶连NLRC4一抗快速检测(2小时内即可得到结果)，提高检测精度，增加检测速度，简化检测手段，降低检测成本，具体试验方案如下：

样本收集：

采用104例患者术后胰腺癌组织芯片；

操作方法：

实验试剂：一抗、即用型Max vision二抗：羊抗小鼠IgG和兔IgG，(或普通生物素化二抗还有三抗)；蒸馏水及0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲(PBS)，稀释抗体和洗片子用；二甲苯，无水乙醇(及可用无水乙醇配制的梯度酒精)，盐酸，氨水，苏木染液；抗原修复液：枸橼酸缓冲液或柠檬酸缓冲液(pH6.0)；H2O2，灭活内源性过氧化物酶；抗体稀释液；HRP显色液。其中：一抗为酶标NLRC4抗体。

具体步骤如下：

1.石蜡包埋的组织块切片，切片厚度为4μm，置烤片机上烤2h；

2.石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯1-2分别15min，无水乙醇1-2分别5-10min，梯度酒精95％、85％、75％、60％、蒸馏水各5min)；

3.迅速将水化过的片子浸入盛有抗原修复液(枸橼酸或柠檬酸缓冲液)的不锈钢杯中，盖紧锅盖后加热至喷气，开始计时2min；

4.自然冷却至室温，切片放入盛有过氧化氢浸片架盒中，常温下避光孵育10min，阻断内源性过氧化物酶活性；

5.PBS浸洗片子3次，每次5-10min(还原PH环境)；

6.用抗体稀释液稀释一抗(NLRC4一抗)，切片平行架于湿盒中，组织区域滴加一抗(抗体要覆盖过全部组织边缘1mm)，4℃过夜；

7.同一抗操作前，滴加即用型HPR标记的Max vision二抗工作液，湿盒放入37℃温箱孵育30min；

8.配制DAB染色，组织区域滴加DAB染液(DAB染液要覆盖过全部组织边缘1mm)，显微镜下观察至黄褐色出现，约3–10min；

9.显色后迅速蒸馏水浸洗，苏木素复染10mim，复染完后自来水振洗，盐酸酒精分化(颜色变红即可)蒸馏水振洗，氨水返蓝(3min)蒸馏水振洗；

10.梯度酒精脱水(梯度酒精60％、75％、85％、95％、无水乙醇1-2分别20min、二甲苯1-2分别10min)。中性树胶封片(压片时注意勿有气泡)。

(2)通过评分方法快速确定NLRC4的表达量

通过评分快速评价NLRC4的表达量并判断病人预后，将检测结果通过免疫组化评分的方式进行评判，并与现有数据库中的标准值进行对比，得到病人NLRC4表达量水平，并判断病人预后，后续可根据病人预后情况制定相应治疗方案。

具体方案如下：切片无杂染，以抗体正常着色部位出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，在20X10倍光镜下随机选取4个视野对间质阳性着色部分进行观察评分。按照阳性细胞所占比例及分布情况进行评分1-5％＝1分，5％-10％为2分，10％-20％＝3分，>20％为4分；目的蛋白染色强度：弱阳性为1分，中度阳性为2分，高度阳性为3分，强阳性为4分。每个视野阳性细胞百分数得分和目的蛋白染色强度得分乘积并求总和。

将胰腺导管腺癌病人的手术标本芯片进行切片IHC染色之后根据标本NLRC4的表达量将其分为NLRC4-high组和NLRC4-low组，如图3所示；并对NLRC4-high组和NLRC4-low组对应的患者进行随访统计，绘制OS及RFS曲线，如图4所示；其中，根据图4可知，NLRC4-high组相对于NLRC4-low组OS及RFS显著缩短，继而得出结论如下：NLRC4表达量与胰腺癌病人的预后(OS、RFS)呈负相关；NLRC4可作为判断胰腺癌患者预后的重要指标。

进一步地，如图5所示，本申请对TCGA数据(肿瘤基因族图谱)库中胰腺癌数据进行统计分析同样可得出上述结论。其中：NLRC4-high为NLRC4高表达组，NLRC4-low为NLRC4低表达组；censored为删失数据，即将发生复发前死亡的个体、失访个体和未发生复发的个体。

进一步地，如图6所示，本申请对其中90例在远期随访过程中出现肝转移的患者进行统计分析，并对肝转移的发生与NLRC4表达的关系进行卡方检验，发现NLRC4高表达组肝转移比例显著高于NLRC4低表达组，进而进一步验证得到NLRC4的表达与胰腺癌患者生存预后呈负相关，NLRC4可作为预估胰腺癌疗效或预后的分子标志物。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。