枇杷EjFAD2基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjFAD2蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica)是蔷薇科枇杷属亚热带常绿果树；其果实有润肺、止咳化痰的保健功能，且果实成熟时恰逢水果淡季，因此具有良好的经济价值及市场潜力。枇杷坐果之时正是一年中最冷的季节，霜冻常造成枇杷产业巨大经济损失，因此研究枇杷耐寒机理选育耐寒品种对于推动产业发展具有重要价值。

低温不仅限制植物地理分布，而且常导致农业巨大经济损失。植物在适应低温的过程中通过增加不饱和脂肪酸的含量提高膜的流动性，从而增强植物的耐寒性，这一过程主要由脂肪酸去饱和酶基因(FAD)基因家族成员来完成。大多FAD基因表达量受低温调控，研究较多的FAD2基因属于ω-6型，催化与甘油结合的单烯脂肪酸在ω-6处引入第2个双键形成双烯脂肪酸，其主要受低温诱导表达；如棉花子叶、鳄梨果实、马齿苋叶片中FAD2基因在低温胁迫下表达量显著上调。拟南芥FAD2突变体长期低温导致其死亡。过表达PtFAD2基因的杂交杨，以及过表达FAD2基因的马铃薯植株的耐寒性明显增强。但是，关于枇杷EjFAD2基因的功能研究及应用未见报道。

发明内容

本发明目的是提供枇杷EjFAD2蛋白及其编码基因与应用。

首先，本发明提供枇杷EjFAD2蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的枇杷EjFAD2蛋白的基因。

其中，所述基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。优选的，所述载体为过表达载体。

本发明还提供所述基因在植物耐寒育种中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述EjFAD2基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，增强植物的耐寒性。

本发明还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述EjFAD2基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

其中，所述的转基因植株与野生型相比，显著增强其耐寒性。

本本发明从枇杷叶片中克隆了1个枇杷耐寒密切相关的EjFAD2基因。通过实时荧光定量PCR证实了低温诱导EjFAD2基因大量表达，其表达量在耐寒性强的枇杷材料中高于耐寒性弱的枇杷材料。利用基因工程的手段构建了EjFAD2基因的过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能显著增强拟南芥的耐寒性。本发明为被子植物耐寒育种提供了很好的应用前景。

附图说明

图1是枇杷EjFAD2基因编码区序列验证的电泳照片。M为DL2000 DNA marker，1为EjFAD2基因ORF的PCR产物。

图2是枇杷EjFAD2基因编码区的cDNA核苷酸序列图。

图3是枇杷EjFAD2蛋白质的氨基酸序列和结构域划分图。

图4是枇杷EjFAD2基因在枇杷叶片中受低温诱导表达。

图5是EjFAD2转基因拟南芥植株的PCR鉴定。

图6是在拟南芥中过表达EjFAD2的植株形态表型。低温处理的野生型拟南芥萎蔫失水状态比转基因植株严重，且多数叶片边缘开始出现浸渍卷曲状态，老叶边缘开始变黄，而转基因植物只有少量嫩叶边缘冻伤，部分老叶边缘也开始变黄。

图7是过表达EjFAD2拟南芥叶片的电解质渗漏及MDA含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjFAD2基因cDNA序列的克隆

提取枇杷叶片总RNA，反转录成cDNA。通过转录组数据和枇杷基因组的序列比对，找到EjFAD2完整的cDNA序列，并使用Oligo7设计基因的克隆引物，FLEjFAD2-F：5'-ATGGGTGCCGGTGGAAATAT-3'；FLEjFAD2-R：5'-CACAGCTTTTTCTTGTACCAGAAG-3'。采用PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1/d2/d3)试剂盒扩增基因，EjFAD2基因的扩增体系为2×Phanta Max Buffer为25μL,dNTP Mix(10mM)1.0μL,F(10μM)2.0μL,R(10μM)2.0μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase1.0μL,cDNA为1.0μL，加ddH

将回收的目的片段与载体pTOPO-Blunt Vector连接后转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对测序结果进行分析和拼接，得到枇杷EjFAD2基因cDNA序列全长(SEQ ID No.1)，其序列图片见图2。

使用BioEdit软件，对枇杷EjFAD2基因的cDNA序列全长，进行蛋白质序列翻译(SEQID No.2)，并根据蛋白质特点进行跨膜结构域、组氨酸簇保守结构域的划分，结果显示EjFAD2蛋白质序列具有3个保守的组氨酸簇(Histidine boxes:HECGH、HRRHH、HVAHH)，同时也是典型的膜结合蛋白，共有6个跨膜区(图3)。

实施例2枇杷EjFAD2基因的表达量分析

选取耐寒性有差异的四倍体枇杷(2n＝4x＝68)B431、三倍体枇杷B431×GZ23(2n＝3x＝51)，经耐寒鉴定，其耐寒性为B431×GZ23(LT

根据枇杷EjFAD2基因的cDNA序列全长，利用oligo 7.0软件设计实时荧光定量引物，qEjFAD2-F：5'-GGATGCTGACACCCACAAGA-3'和qEjFAD2-R：5'-GGCTTTCTTGACCTCACCGA-3'。用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qEjactin-F：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qEjactin-R：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'。采用三步法进行扩增，每个反应3个生物学重复。PCR反应程序为：95℃预变性1min；95℃20s，58℃20s，72℃30s，45个循环；收集溶解曲线。根据得到的Ct值，利用2-ΔΔCT方法，分别计算低温胁迫下三倍体、四倍体枇杷中EjFAD2基因表达量，结果表明EjFAD2基因受低温诱导表达在耐寒性最强的三倍体枇杷B431×GZ23中表达量较四倍体B431中的表达量高(图4)。

实施例3枇杷EjFAD2基因的植物转基因载体pFGC5941-EjFAD2构建

采用PCR扩增，在枇杷EjFAD2基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷叶片总RNA反转录的cDNA为模板，以EjFAD2-F：5′-

实施例4将转基因表达载体pFGC5941-EjFAD2转入野生型拟南芥

取2μg pFGC5941-EjFAD2的质粒，加100μL农杆菌感受态细胞，吸打混合均匀；冰浴30min，转入液氮，迅速冷冻1min，37℃水浴5min，冰浴10min，加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，均匀涂布，在28℃倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mLKan+10μg/mL Rif)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.8。取2mL菌液至100mLLB液体培养基(50μg/mL Kan和50μg/mL Rif)培养至OD600＝0.7-0.8，将菌液转至2个50mL离心管(灭菌)，常温，5000rpm离心5min，倒掉上清液，每管加入2mL侵染缓冲液(0.5％Silwet L-77，5％蔗糖，1/2MS培养基)轻轻悬浮菌体，再加入48mL侵染缓冲液(100mL侵染缓冲液：5g蔗糖、50μL Silwet L-77，1/2MS培养基)。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h处理后播种至营养土，在温度22℃，湿度75％，14h黑暗/10h光照条件下培养；在转基因的前一天，将拟南芥植株浇透水；在浸染前剪去拟南芥植株上已有角果剪掉，将花序浸入pFGC5941-EjFAD2农杆菌浸染液中60s左右，用作浸染转化；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜，放回正常环境继续生长。上述方法侵染3-4次，间隔时间为7d。

实施例5枇杷EjFAD2基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjFAD2转基因拟南芥成熟种子。37℃烘箱放置7d左右烘干种子，放于4℃冰箱春化。将种子播种在草炭土上，待苗子长至十天左右喷洒20mg/L的草铵膦(载体pFGC5941抗草铵膦)，每三天喷洒一次，一共喷洒3-4次，存活的苗按照常规的水肥管理，直至开花结种子。

提取EjFAD2转基因拟南芥DNA，并以野生型拟南芥的DNA作为对照，根据pFGC5941载体上的35S的启动子设计鉴定引物(35s-F：TGAGACTTTTCAACAAAGGATAATT，35s-R：TGTCCTCTCCAAATGAAATGAAC)对存活苗进行PCR鉴定，同时用目的基因的克隆引物进行PCR鉴定，筛选出阳性苗。PCR扩增程序：95℃4min；95℃30s，56℃30s，72℃40s，进行25个循环；72℃10min。反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中检测(图5)，结果显示共获得10株拟南芥植株，其中9株为阳性植株。

将野生型拟南芥(Wt)和T3代纯合转基因植株种植在草炭土中培养，每3株为一盆，每一盆为一个生物学重复，共3个生物学重复，培养温度约23±0.5℃，湿度约60％，光照的光量子通量密度(PPFD)50±5μmol·m

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。