一种落羽杉TdADH3基因及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种落羽杉TdADH3基因及其表达蛋白和应用。

背景技术

落羽杉(Taxodium distichum)是柏科落羽杉属的落叶乔木，又名落叶松，是古老的“孑遗植物”。它具有耐水淹、抗风、抗污染、抗病虫害等优点，并且其叶片在不同的季节呈现不同的色泽，极具观赏价值。此外，落羽杉的木材重、结构较粗、纹理直、硬度适中、耐腐力强，可作建筑、电杆、家具、造船等用。1917年，我国就开始进行落羽杉的引种栽培，其表现出较强的适应能力，为我国江南低湿地区的通道建设、湿地保护、工业区造林等都做出了积极贡献。

乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1)是脱氢酶/还原酶(Dehydrogenase/reductase，MDR)蛋白基因超家族成员之一。ADH基因家族成员在植物抵抗涝害、干旱、冷害等胁迫环境中起着非常重要的作用。近年来，科研工作者发现ADH3基因和植物的耐盐性密切相关。在水稻中过量表达ADH3基因可以明显增强盐碱敏感型水稻对于盐胁迫的适应性。而目前关于ADH3基因在木本植物的耐盐适应性方面研究的较少，落羽杉属植物中更是未见相关报道。江苏省中国科学院植物研究所科研人员对落羽杉的全基因组数据进行挖掘，获得了落羽杉的TdADH3基因全长，并对其进行耐盐性功能研究，希望能为深入开展落羽杉属树木的抗逆机理研究提供理论基础。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种落羽杉TdADH3基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述落羽杉TdADH3基因的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种落羽杉TdADH3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的落羽杉TdADH3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，含有所述的落羽杉TdADH3基因的表达盒、载体、宿主菌或细胞系。

进一步地，所述的载体是植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体是pBWA(V)KS::TdADH3。

进一步地，所述的落羽杉TdADH3基因在植物育种或提高植物耐盐性中的应用。

进一步地，所述的落羽杉TdADH3基因在提高植物耐盐性中的应用，包括以下步骤：

1)构建落羽杉TdADH3基因的载体；

2)将所构建的落羽杉TdADH3基因的载体转化到植物中；

3)培育筛选得到耐盐性更高的转基因植物。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明以落羽杉组培苗根为材料，通过RACE技术克隆了落羽杉TdADH3全长基因。同时，采用GATEWAY技术构建其过量表达载体pBWA(V)KS-TdADH3，转入木本模式植物杨树中，TdADH3基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，TdADH3在杨树中高效表达。转基因杨树和未转基因杨树在含100moL/LNaCl溶液中生长30天后，未转基因杨树生长受到抑制，叶片发黄，出现死亡现象。转基因植株长势良好，生长未受明显影响。表明TdADH3基因是植物响应盐胁迫的重要基因。

附图说明

图1为盐胁迫下，落羽杉组培苗根、茎、叶中TdADH3基因的表达变化情况图；

图2为植物过量表达载体pBWA(V)KS示意图；

图3为pBWA(V)KS::TdADH3转基因植株在盐胁迫下与未转基因植株的表型差异图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1：通过RACE技术克隆TdADH3基因

对落羽杉全基因数据进行筛选，筛选到15个ADH家族基因片段，对15个基因片段在美国国家生物技术信息中心(NCBI https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，最终筛选出目标基因，和瑞士黑麦草LrADH3基因(Sequence ID：XM_047227036.1)相似度最高。

1、总RNA的提取与cDNA的合成

1)每2mL离心管中吸取1mL RNA Plant Reagent裂解液，加入3g左右经液氮研磨精细的落羽杉叶片样品，大力涡旋使其充分混匀；

2)室温将离心管水平放置10min，让裂解液充分裂解核蛋白；

3)用高速冷冻离心机1200rpm，4℃，离心5min，将上清转移至新的离心管中；

4)加入200μL 5M/L氯化钠溶液，轻轻混匀后再加入300μL氯仿，上下颠倒混匀；

5)4℃，12×1000rpm离心10min，轻轻吸取上清移至新的2mL离心管；

6)重复步骤4)、5)；

7)加与所得上清等体积异丙醇，充分混匀，室温静置10min；

8)4℃，12×1000rpm离心10min，弃上清，留底部沉淀；

9)接着用RNeasy plant Mini Kit试剂盒(QIAGEN，USA)提取；

10)加入0.5mL新鲜配置的RLT buffer(1mL)RLT和10μL β-硫基乙醇，彻底涡旋；

11)加入0.5mL无水乙醇，吹打混匀；

12)将混合液转移至收集柱RNeasy mini column(pink)中，12000rpm离心15s弃滤液，离心管可重复使用；

13)在收集柱RNeasy mini column中加入350μL RWI Buffer 12000rpm离心15s，弃滤液和离心管；

14)将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管，加入500μL BufferRPE.12000rpm离心15s，弃滤液；

15)重新加入500μL Buffer RPE 12000rpm离心2min，弃滤液和离心管；

16)将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管13000rpm离心1min；

17)将收集柱RNeasy mini colum放入新的RNA收集管中，加入适量RNase freewater到膜中央，静置1min 12000rpm离心1min；

18)将滤液重新加入到收集柱RNeasy mini column，12000rpm离心1min，回收滤液，得总RNA；

19)用紫外分光光度计检测确定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

20)得到的总RNA样品，采用Promega公司的ImProm-IITM Reverse Transcriptase进行反转录。其反应体系为：Total RNA(1ug)；4.0μL ImProm-II5×Reacation Buffer；2.5μL MgCl

2、RACE巢式PCR扩增

(1)3’RACE cDNA反转录反应

以总RNA为模板，反应体系如下：1μL 3’RACE Adaptor(5μM)；2μL 5×M-MLVBuffer；1μL dNTP Mixture(10mMeach)；0.25μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)(200U/μL)；0.25μL RNase Inhibitor(40U/μL)；加RNase Free dH

(2)3’RACE Outer PCR

3’RACE Outer PCR是利用已知的cDNA片段设计上游外侧特异性引物TdADH3 3’outer Primer与3′RACE Outer Primer进行的PCR反应。反应体系如下：2μL反转录反应液；8μL 1×cDNA Dilution buffer II；2μL 3’RACE Outer Primer(10μM)；2μL TdADH3 outerPrimer(10μM)；4μL 10×LATaq Buffer II(Mg

3’RACE outer Primer：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′；

TdADH33’outer Primer：5′-CACCTCTGATTCTTGCCCCTTCCGCAAC-3′。

(3)3’RACE Inner PCR

3’RACE Inner PCR是以Outer PCR反应产物为模板，利用上游内侧特异性引物TdADH3 3’Inner Primer与3′RACE Inner Primer这对引物进行PCR扩增，反应体系为：1μLOuter PCR反应产物；8μL dNTP Mixture(10mM each)；5μL MgCl

3’RACE Inner Primer：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTA-3′；

TdADH33’Inner Primer：5′-TTTCCAGCTTCACCGAATACACTGTTGTAGAA-3′。

(4)5’RACE去磷酸化反应

1)反应体系如下：2-5μg Total RNA；5μL 10×Alkaline Phosphatase Buffer(MgCl

2)向上述反应液加入20μL的3M CH

3)加入200μL的酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5mL的离心管中；

4)加入200μL的氯仿，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5mL的离心管中；

5)加入2μL的NA Carrier后均匀混合，再加入200μL的异丙醇，充分混匀后，-40℃放置2h以上；

6)4℃，13000×g离心20min，弃上清；

7)加入500μL的75％的预冷乙醇漂洗，4℃，13000g离心5min，弃上清后干燥；

8)加入7μL的DEPC水溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5′帽子结构，并保留一个磷酸基团。反应体系为：7μL CIAP-treated RNA；1μL 10×TAP Reaction Buffer；1μLTobacco Acid Pyrophosphatase(0.5U/μL)；1μL RNase Inhibitor(40U/μL)；37℃反应1h，取5μL用于5′RACE Adaptor连接反应。

(5)5’Adaptor的连接

1)反应体系为：5μL CIAP/TAP-treated RNA；1μL 5’RACE Adaptor(15μM)；4μLRNase Free dH

2)向上述反应液中加入20μL的3M CH

3)加入200μL的苯酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5mL的离心管中；

4)加入200μL的氯仿，充分混匀后13000g室温离心5min，将上层水相转移至新的1.5mL的离心管中；

5)加入2μL的NA Carrier后充分混匀；再加入200μL的异丙醇，-40℃放置2h；

6)加入500μL的75％的预冷乙醇漂洗，4℃，13000g离心5min，弃上清后再离心1min后彻底吸干溶液后干燥；

7)加入7μL的RNase Free dH

(6)5’RACE cDNA反转录反应

反应体系为：6μL Ligate RNA；2μL 5×M-MLV Buffer；1μL dNTP(10μM each)0.5μL Random 9 mers(50μM)；0.25μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)(200U/μL)；0.25μL RNase Inhibitor(40U/μL)；总体系为10μL。反应程序为：30℃，10min；42℃，1h；70℃，15min；4℃，保持。

(7)5’RACE Outer PCR

反应体系为：2.0μL步骤(6)稀释过5倍的反转录反应液；2.0μL 5’RACE OuterPrimer(10μM)；2.0μL TdADH3 5’outer Primer(10μM)；5.0μL 10×ExTaq Buffer II(Mg

5’RACE Outer Primer：5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′；

TdADH3 5’outer Primer：5′-AAGACCATGAAAAGCCTGTTCACCAGGT-3′。

(8)5’RACE Inner PCR

反应体系为：2.0μL 5’RACE Outer PCR反应产物；2.0μL 5′RACE Inner Primer(10μM)；2.0μL TdADH3 5’Inner Primer(10μM)；5.0μL 10×ExTaq Buffer II(Mg

5′RACE Inner Primer：5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′；

TdADH3 5’Inner Primer：5′-GTTTCCAGCTTCACCGAATACACTGTTGTA-3′。

对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上读片、摄像，然后用切胶回收试剂盒回收，连接T载体，转化，菌液PCR检测，送英俊公司测序。

将测序获得的3’RACE及5’RACE产物利用Bioedit软件进行拼接，获得含有1434bp碱基的目的基因，Blast确认目的基因和水稻ADH3基因同源，命名为TdADH3，SEQ ID NO.1所示。其包含一个1182bp的完整编码阅读框，翻译成氨基酸后为394bp，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。包含一个1182bp的完整编码阅读框(156-1337)，翻译成氨基酸后为394bp，

实施例2：落羽杉组培苗盐胁迫后的分子检测

取8长势基本一致的落羽杉组培苗进行盐胁迫处理，温度控制25℃，光强4000lux，每天10小时光照，4利用去离子水培养，4利用100moL/L NaCl溶液进行培养，光照培养箱培养7天后，对植株进行定量PCR检测，实时定量引物采用Oligo6.6软件设计，引物Tm值在60℃，引物序列如下所示：

q ADH3F：5′-TGGAAGTGGGGTGGATTA-3′，

q ADH3R：5′-AATCAGATGATCCAG-3′。

实时定量PCR的内参基因采用已筛选出的APRT基因：

APRT-F：5′-TCCACAGGTTCTTGAATCGCT-3′，

APRT-R：5′-AGTCTATGGGAATGTCTGT-3′。

利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)系统进行qRT-PCR。按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作，扩增程序为：55℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，进行40个循环。随后设置60℃至95℃，生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复，20μL的反应体系中包含：2μL稀释后的cDNA(稀释比例为1∶3，稀释后的cDNA浓度大约是350ng/μL)，10μLFastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，6pmoL上游引物，6pmoL下游引物以及6.8μL ddH

实施例3：TdADH3基因植物表达载体构建

TdADH3基因过量表达载体的构建采用Invitrogen公司的Gateway技术，首先将目的片段通过BP反应克隆入门载体(PCRTM8/GW/TOPOTM)上，然后再通过LR反应将目的基因转移到过量表达载体pBWA(V)KS中(如图2所示)。

(1)目的片段的获得

在已经获得TdADH3基因的全长的基础上，将ORF框测序正确的大肠杆菌扩大培养后，用AXYGEN质粒小提纯化试剂盒提取带有全长基因的pMD19-T载体质粒，以该质粒模板，用ORF框引物(下游引物含有终止密码子)扩增目的片段，电泳后切胶回收。

(2)BP反应

1)反应体系为：10-20ng Fresh PCR product(purified)；1μL Salt solution；1μL pCRTM8/GW/TOPOTM vector；加Nuclease-free Water补足至6μL；

2)轻轻混匀，22℃反应60min后转移至冰上；

3)将前步6μL反应产物加入冰上融化的TOP10感受态细胞中，轻轻混匀，不要吹打；

4)冰浴15min；

5)42℃热击60sec，迅速置于冰上3-5min；

6)加入800μL SOC培养基，37℃150rmp，摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层约700μL SOC，混匀剩余菌液，涂于LB筛选培养平板；

7)37℃倒置培养过夜，挑取克隆进行菌液PCR检测，所用引物为基因特异性上游引物ORF-F和载体上的M13F，序列如下所示：

ORF-F：5’-ATGCTACACAGTCCACAATTACATACAGCCATGGA-3’，

M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

8)检测后的阳性克隆进一步测序验证；

9)用AXYGEN质粒小提纯化试剂盒提取测序正确的入门载体的质粒。

(3)LR反应

选用AseI(TaKaRa)限制性内切酶对pBWA(V)KS载体进行酶切反应，使其线性化，反应体系为10×H Buffer(5μL)，纯化的pBWA(V)KS载体4μg，AseI(2μL)，用不含核酸酶的水将反应液补充到50μL，45反应1h，然后85℃灭活15s；酶切反应结束后，取4μL反应液进行电泳检测，然后用AXYGEN PCR Purification Kit回收纯化。LR反应体系：线性化的pBWA(V)KS载体(100ng)，入门载体(150ng)用1×TE(pH8.0)补充至8μL，充分混匀后加入2μL的LRClonase II enzyme mix，PCR 25℃反应1h后加入1μL Proteinase K solution 37℃反应10min终止反应；然后用Top 10感受态细胞进行转化，挑取阳性单克隆，用载体上的M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’引物和目的基因特异性的下游引物ORF-R：5’-CTGCAATGTCCTGTTCATCCACAT-3’进行菌液PCR检测，测序验证后，回收纯化LR反应后的目的载体，即得目的基因的过量表达载体pBWA(V)KS::TdADH3。

实施例4：TdADH3转基因植株的获得及盐胁迫处理

(1)液氮冻融发转化农杆菌

1)在EHA105感受态细胞中加入至少100ng回收纯化的表达载体pBWA(V)KS::TdADH3，轻轻混匀，冰浴30min；

2)液氮速冻1min；

3)37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min；

4)加入800μL LB培养基，28℃，100rmp复苏3h；

5)4000rmp离心3min，吸掉800μL LB培养基；

6)混匀剩余菌液，涂抹于加有相应的抗生素LB平板(spc+str)；

7)在培养箱中28℃倒置培养30-48h；

8)挑取单克隆，用载体上的M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’上游引物和目的基因特异性的下游引物5’-CTGCAATGTCCTGTTCATCCACAT-3’进行菌液PCR检测。

(2)叶盘法转化山新杨

1)从活化的LB培养平板上挑取单菌落，经PCR检测阳性菌株接种于2mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃摇菌(250rmp)培养12h左右，再取0.8mL种于50mL含相应抗生素的LB液体培养基中，至OD

2)将菌液分装于50mL的离心管中，5000rpm离心10min，收集菌体；

3)用一定体积的不加蔗糖MS溶液重悬菌体至OD

4)生长势基本一致，4-6周的山新杨组培苗，取顶芽下的2-3片舒展的叶片，延叶的边缘剪出伤口；

5)将剪好的叶盘转入制备好的浸染液中，25℃温，90rmp振荡30min；

6)取出叶盘，用滤纸吸干残余菌液，转入MS

7)洗菌后转入MS

8)再将叶盘转入分化筛选培养基MS

9)当叶盘边缘长出抗性不定芽时，将其转到芽伸长筛选培养基MS

10)当抗性不定芽在茎伸长培养基中生长至1cm左右时，将其剪下转入生根筛选培养基MS0平板上进行抗性植株生根筛选，从而获得完整植株；

11)生根筛选培养基MS

转基因杨树生长到30天后，较未转基因杨树表型没有发现明显的差异，进一步通过盐胁迫手段来进行处理。选取长势一致的pBWA(V)KS::TdADH3转基因杨树及对照杨树的进行盐胁迫处理胁迫实验，温度控制25℃，光强4000lux，每天10小时光照，100moL/L NaCl溶液进行水培，30天后发现对照杨树生长受到明显抑制，叶片发黄，枯萎，大量叶片脱落，出现死亡现象，而转基因杨树则长势良好，生长未受明显影响(图3)，说明落羽杉TdADH3基因和植物耐盐性是紧密相关的，可应用于耐盐植物培育。