异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法及其应用

技术领域

本发明属于化合物增溶技术领域，具体涉及异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法及其应用。

背景技术

近年来，农业有害真菌引起广泛感染，造成减产威胁农业生产安全。如链格孢菌(Alternaria.spp.)是一种我们熟知的农业有害真菌，可造成400多种作物感染，目标宿主在自然界中广泛分布，包括苹果、花椰菜、茎杆菜、胡萝卜、柑橘、梨、水稻、草莓、番茄、马铃薯和烟草等。为了应对真菌感染，需要开发新型化学抗真菌剂，这些抗真菌剂的有效成分往往是小分子化合物。异香豆素结构是一个具有潜在抗真菌活性的骨架，通过在不同位点引入不同取代基，可以形成一系列异香豆素类化合物。但由于它们结构不同，会展现出不同的抗真菌活性。异香豆素类化合物普遍不溶于水，在以水为溶剂的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)中溶解性差，导致生物利用度低。

采用菌丝生长速率法评价有机化合物(药物)对于真菌的抑菌活性，是一种普遍应用的方法。如文件《GB/T 38480-2020微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定菌丝生长速率法》所述，此方法是通过比较，真菌接种在未加药物的PDA培养基中的生长直径与添加药物后的PDA培养基中的生长直径，由于药物的作用会使真菌的生长受到抑制，所以在加药PDA培养基中，菌体生长直径较小。该方法需要趁热在PDA未凝固前，加入一定量的化合物，并在培养基中分散均匀，以形成浓度恒定、药物分散均匀的培养基。

异香豆素类化合物是疏水固体，现有技术通常采用DMSO溶液溶解异香豆素类化合物后，通过在PDA培养基中加入一定量的含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液的方法，来实现在PDA中引入化合物。此方法适用于药物浓度较低的情况，但为了计算化合物的IC

发明内容

本发明公开了异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法及其应用，解决了现有技术在实现向PDA中引入异香豆素类化合物时，在较高浓度下，此类化合物相互聚集形成颗粒沉淀，从培养基中析出，无法被真菌吸收以发挥药效的问题。

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

优选的，具体包括以下步骤：

S1.向PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精；

S2.向S1制备的含增溶剂的PDA培养基中加入异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得到分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

优选的，S1中所述β-环糊精的加入量为150～300μg/mL。

优选的，S2中所述异香豆素类化合物为化合物1或化合物2；

优选的，S2中所述PDA培养基与含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液的体积比为：10mL:200μL。

优选的，S2中所述异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液的制备方法为：将异香豆素类化合物溶于二甲基亚砜，在室温下超声3～4min，得含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液。

优选的，所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。

优选的，S2中加入所述异香豆素类化合物时，需要在PDA未凝固前加入。

本发明的第二个目的在于保护所述异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法在菌丝生长速率法测定异香豆素类化合物抑制真菌能力的检测中的应用。

优选的，所述真菌为链格孢菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明使用的增溶方法通过添加150～300μg/mL的β-环糊精，大大提高了异香豆素类化合物在PDA培养基中的溶解性，提高了异香豆素类化合物在菌丝生长抑制法中的抑真菌率。

2、本发明发现向PDA培养基中添加250μg/mL的β-环糊精时，可以实现在PDA中最大添加200μg/mL浓度的异香豆素类化合物，并且药物在PDA培养基中充分溶解。

附图说明

图1为实施例3(b)和对比例1(a)对于化合物1的溶解性图。

图2为实施例3(d)和对比例1(c)对于化合物2的溶解性图。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例和对比例中的所述异香豆素类化合物为化合物1和化合物2，结构式如下：

实施例1

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为150μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)，在室温下超声3min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例2

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为200μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声3min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例3

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为250μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例4

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为300μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1和化合物2。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。化合物1的溶解性图见图1。

实施例5

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为150μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)，在室温下超声3min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物2。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例6

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为200μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声3min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物2。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例7

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为250μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物2。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

实施例8

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，所述方法为：向PDA培养基中加入β-环糊精，然后再加入异香豆素类化合物。

具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.向S1制备的PDA培养基中加入增溶剂，混合均匀，得含增溶剂的PDA培养基；所述增溶剂为β-环糊精，所述β-环糊精的加入量为300μg/mL。

S3.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，配置成含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1和化合物2。

S4.在PDA未凝固前向S2制备的含增溶剂的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混合均匀，得分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。化合物2的溶解性图见图2。

对比例1(化合物1不加β-环糊精)

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，得到含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物1。

S3.在PDA未凝固前向S1制备的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混匀，得到分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。

化合物1在不加β-环糊精时的溶解性见图1。

对比例2(化合物2不加β-环糊精)

一种异香豆素类化合物在PDA培养基中增溶的方法，具体包括以下步骤：

S1.称量马铃薯葡萄糖固体培养基(每46.0g含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g)粉末13.8g于500mL锥形瓶中，添加300mL蒸馏水，搅拌均匀配成PDA培养基。

S2.将异香豆素类化合物溶于DMSO，在室温下超声4min，超声功率为11W/L，得到含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液；所述异香豆素类化合物:二甲基亚砜＝10mg:1mL。所述异香豆素类化合物为化合物2。

S3.在PDA未凝固前向S1制备的PDA培养基中加入200μL含异香豆素类化合物的二甲基亚砜溶液，混匀，得到分散有异香豆素类化合物的PDA培养基。化合物2在不加β-环糊精时的溶解性见图2。

1、性能检测

1.1溶解力检测

由图1、图2可知，与对比例1相比，添加增溶剂β-环糊精后，化合物1、化合物2的溶解力大大提高。

1.2抑菌率检测

在无菌操作台中，趁热将PDA培养基倒成10mL平板，用移液枪吸取50.0-200.0μL的药液趁热加入未凝固平板中，迅速平面摇动培养皿直至药物在培养基中分散均匀，形成含药浓度为50.0-200.0μg/mL的含药培养基，在空白平板中加入等体积的DMSO作为对照。以生长直径法评价化合物的抑菌活性，用5mm打孔器在菌落边缘生长一致的部分打制菌饼，用接种针将链格孢菌饼(有菌丝的面朝下)接种于PDA平板中央，轻轻按压菌饼，防止滑落。将接菌平板用封口膜封好，倒置置于28℃恒温培养箱中。培养48h、72h和96h后，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，以如下公式计算抑菌率。

表1β-CD不同添加量在不同时间对抑菌率的影响

由表1可知，在未添加β-环糊精(β-CD)时，化合物1与化合物2对链格孢菌的抑菌率比较低，随着β-CD添加量的增加，化合物1与化合物2在200μg/mL浓度下，对于链格孢的抑菌率均出现先上升后下降的趋势，在添加量为250μg/mL时到达最大值，由此可见在β-CD添加量为250μg/mL时，可以发挥药物的最佳性能。如图1和图2所示，在未添加β-CD的PDA培养基中，药物分布不均匀，出现聚集沉淀，使菌种无法吸收，从而导致抑菌性能受到影响。在添加250μg/mL的β-CD后，对化合物1与化合物2增溶作用明显，抑菌效果得到明显提升。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。