一种呕吐毒素解毒酶基因的克隆、表达与应用

一、技术领域

本发明涉及一种呕吐毒素解毒酶基因的克隆、表达与应用，属于生物技术领域。

二、背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素(Vomitoxin，VT)，是禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌侵染谷物后所产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于小麦、玉米等粮谷类原料及其制品中，给粮食和畜牧业造成巨大的经济损失，以及对人和动物的健康造成严重危害，因此，如何有效地控制和解决粮食和饲料中DON污染的方法，已成为国内外食品加工和食品安全领域中的研究热点。

近年来，霉菌毒素生物降解方法倍受关注。霉菌毒素的生物降解指通过微生物及其代谢产生的酶与毒素反应，破坏毒素分子结构中的毒性基团，使之成为无毒或低毒代谢产物的过程。相比传统的物理、化学解毒的方法存在效果不稳定、饲料营养成分损失大、影响饲料适口性且难以规模化生产等缺点，酶降解法具有解毒效率高、特异性强、对粮食、饲料和环境无污染等优势，因而在食品加工领域中显示了巨大的应用价值。目前对DON生物降解的研究主要包括微生物降解法和酶解毒法。已有的研究表明，DON分子中C12,13位的环氧基团和C3位上的羟基是DON的主要毒性基团，也是生物降解主要研究位点。微生物能够将环氧基团还原成C9,12二烯结构，形成毒性极低的脱环氧产物DOM-1(Zhai et al.,Frontmicrobial.,2019,10,1-12)。但DON的微生物脱环氧化途径的降解机制还未完全被阐明，且未见任何DON解毒酶的报道。除环氧基团外，C3位上的羟基生物转化包括：氧化、乙酰化、糖苷化、异构化(Michlmayr et al.,Toxins.,2015,7,2685-2700；Tian et al.,Toxins.,2016,8,1-15；Zhai et al.,Frontmicrobial.,2019,10,1-12)。其中，德沃斯氏菌(Devosiasp.)来源的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖性的醇脱氢酶DepA/QDDH能氧化DON的C3位羟基生成低毒的3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-keto-DON)，再经过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性醛酮还原酶DepB/AKR13B2/AKR6D1将3-keto-DON还原，生成无毒的3-异构-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)，即C3位的异构化(Carere et al.,Microbbiotechnol.,2018,11,1106-1111；Carere et al.,Front microbial.,2018,9,1-9；He et al.,Food chem.,2020,321,126703)，这是目前阐述的最为详细的DON降解机制，解毒专一，且单向不可逆。

目前DON生物降解的研究刚刚起步，有关DON解毒酶及重组酶研究甚少。因此，挖掘新型、高性能的DON解毒酶具有重要现实意义。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于运用基因工程技术手段，挖掘一种新型、高性能的DON解毒酶基因及DON解毒酶，可以在降解呕吐毒素方面得到应用。

技术方案

一种呕吐毒素DON解毒酶基因，其特征在于，包括呕吐毒素解毒酶基因dadh和akr13b3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。

所述的呕吐毒素解毒酶基因编码的呕吐毒素解毒酶，其特征在于，呕吐毒素解毒酶基因dadh和akr13b3编码的呕吐毒素解毒酶DADH和AKR13B3，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4所示。

所述的呕吐毒素解毒酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对权利要求1所述的呕吐毒素解毒酶基因dadh和akr13b3进行PCR扩增；

(2)构建呕吐毒素解毒酶基因dadh和akr13b3原核表达载体；

(3)呕吐毒素解毒酶DADH和AKR13B3在原核宿主细胞中进行表达。

其中，步骤(2)中所用原核表达载体是指大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、地衣芽孢杆菌表达载体、巨大芽孢杆菌表达载体、短芽孢杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、酵母表达载体、链霉菌表达载体和丝状真菌表达载体中的一种或几种。

步骤(3)中所用原核宿主细胞，是指大肠杆菌宿主细胞、枯草芽孢杆菌宿主细胞、地衣芽孢杆菌宿主细胞、巨大芽孢杆菌宿主细胞、短芽孢杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、酵母宿主细胞、链霉菌宿主细胞或丝状真菌宿主细胞。

所述呕吐毒素解毒酶可以在生物降解呕吐毒素方面得到应用。

有益效果

本发明从山西太原土壤中分离得到一株德沃斯氏菌A6-243，分类命名为德沃斯氏菌(Devosia strain)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO:21800。

1.本发明挖掘了德沃斯氏菌(Devosia strain)A6-243来源的新型DON解毒酶基因dadh和akr13b3，并实现了其在原核细胞中的异源表达，构建了高效表达DADH、AKR13B3的基因工程菌株。

2.本发明从土壤中筛选出的具有DON降解活性的德沃斯氏菌A6-243全基因组中鉴定出了具有DON降解活性的纯的新型解毒酶DADH和AKR13B3，10～20μg DADH和AKR13B3可以在2～18h内，将45～150μg/mL的DON完全降解为无毒产物3-epi-DON。通过序列比对发现，DADH与此前NCBI数据库报道的脱氢酶的序列相似性为55.94％，AKR13B3与已报道的醛酮还原酶的序列一致性仅为36.47％，为新型的DON解毒酶。

3.本发明的DADH与AKR13B3具有非常好的热稳定性，在50℃处理3h，DADH和AKR13B3均可以保留55％以上的活性；DADH在pH 6-10的条件下处理12h可以保留60％以上的活力，AKR13B3在pH 6-7.5的条件下处理12h可以保留80％以上的活力。因此，DADH和AKR13B3具有潜在的工业应用前景。

4.本发明的DADH能将DON氧化生成为低毒的3-keto-DON，AKR13B3能将3-keto-DON还原生成为无毒产物3-epi-DON。同时，DADH与AKR13B3组合反应，可以将45～150μg/mL的DON降解为无毒产物3-epi-DON，降解率为100％，有效解决谷物原料及饲料中呕吐毒素污染问题，减少粮食损失，保障食品、饲料安全。并具有潜在的工业应用前景。

四、附图说明

图1为德沃斯氏菌A6-243来源的DON解毒酶基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱。

(A)M：DNAMarker DL2000；1：德沃斯氏菌A6-243来源的DON解毒酶基因片段dadh。(B)M：DNAMarker DL2000；1：德沃斯氏菌A6-243来源的DON解毒酶基因片段akr13b3

图2为DADH和AKR13B3纯化蛋白电泳示意图。

(A)M：蛋白marker 26610；1：含空质粒pET28a的大肠杆菌破碎液；2：DADH粗酶样品；3：DADH纯化后的样品。(B)M：蛋白marker 26610；1：含空质粒pET28a的大肠杆菌破碎液；2：AKR13B3粗酶样品；3：AKR13B3纯化后的样品

图3为DADH的酶学性质研究。

(A)DADH的最适反应温度；(B)DADH的温度稳定性；(C)DADH的最适反应pH；(D)DADH的pH稳定性

图4为AKR13B3的酶学性质研究。

(A)AKR13B3的最适反应温度；(B)AKR13B3的温度稳定性；(C)AKR13B3的最适反应pH；(D)AKR13B3的pH稳定性

图5为DADH和AKR13B3对DON的解毒能力。

(A)DADH对DON的解毒能力；(B)AKR13B3对3-keto-DON的解毒能力

图6为DADH和AKR13B3组合对DON的解毒效果。

五、具体实施方式：

本发明从山西太原土壤中分离得到一株德沃斯氏菌A6-243，分类命名为德沃斯氏菌(Devosia strain)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO:21800。保藏日期：2021年2月1日。

实施例1：德沃斯氏菌(Devosia strain)A6-243 DON解毒酶基因的克隆

(1)德沃斯氏菌(Devosia strain)A6-243全基因组的提取：离心收集德沃斯氏菌A6-243菌体，采用OMGA公司的Bacterial DNAkit试剂盒提取细菌全基因组。

(2)引物设计：根据德沃斯氏菌A6-243的全基因组测序结果，通过比较基因组学和转录组学，确定DON解毒酶基因，设计DON解毒酶基因的PCR上下游引物DADH-F、DADH-R、AKR13B3-F、AKR13B3-R，以及载体线性化引物V-F和V-R：

V-F:GATCCGAATTCGAGCTCCG；

V-R:CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA；

DADH-F:TAAGAAGGAGATATACCATGCAGGTCGATATCAGTGCGTTGC；

DADH-R:ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTGGCAGCGGCCTCAGG；

AKR13B3-F:GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCATGACCAAGCTCGACGCATC；

AKR13B3-R:ACGGAGCTCGAATTCGGATCGGCGCGACCAATGGCATC。

(3)目的酶基因的克隆：以德沃斯氏菌A6-243全基因组为模板，采用以上设计的引物进行目的片段的PCR扩增，PCR扩增体系：2×Taq Master Mix 25μL，DNA模板1μL，ddH

步骤(1)中载体线性化PCR扩增体系为：2×Taq Master Mix 25μL，DNA模板1μL，ddH

采用凝胶回收试剂盒进行胶回收纯化，纯化产物与线性化的pET28a载体连接，热激法转化入感受态细胞E.coli BL21，涂布于卡那霉素(Kana)抗性平板，挑取阳性转化子增菌验证(如图1所示)，送至金唯智公司测序验证。

通过测序结果，DON解毒酶dadh全长1764bp(如SEQ ID NO.1所示)，akr13b3全长987bp(如SEQ ID NO.3所示)，即德沃斯氏菌A6-243 DON解毒酶DADH，编码一个由587个氨基酸组成的蛋白质(如SEQ ID NO.2所示)，德沃斯氏菌A6-243 DON解毒酶AKR13B3，编码一个由328个氨基酸组成的蛋白质(如SEQ ID NO.4所示)。

实施例2：DON解毒酶的在大肠杆菌中的表达及纯化

(1)表达载体构建：将通过PCR扩增的dadh和akr13b3目的片段和线性化的载体pET28a通过同源的方法连接起来，然后转化入感受态细胞E.coli BL21，涂布于卡那霉素(Kana)抗性平板，挑取阳性转化子增菌，挑取阳性转化子测序，将测序正确的质粒分别命名为pET28a-DADH和pET28a-AKR13B3。

(2)重组酶的表达：重组菌pET28a-DADH和pET28a-AKR13B3分别接种于含有50μg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜，制成种子液。然后以1％的接种量转接到相应含抗生素的100mL LB液体培养基中，37℃至OD值0.6-0.8之间，加入100μl的IPTG(100mg/mL)，16℃过夜诱导表达。

(3)重组酶的纯化：低温离心收集菌体，缓冲液悬浮菌体超声破碎，再次离心取上清得粗酶液。由于在质粒构建时目标蛋白的融合了组氨酸标签，可以采用Ni

上样：样品终浓度调节至5mM咪唑以增强特异性吸附，过膜处理；上样之前Ni

洗脱：杂蛋白洗脱后，用10倍介质体积200mM咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，收集流出液即得到纯化样品，透析除去咪唑，即得到纯化后蛋白。将纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳验证。如图2A所示，在66kDa附近有特异性条带，与DADH的理论分子量63.4kDa一致；如图2B所示，在36kDa附近有特异性条带，与AKR13B3的理论分子量35.9kDa一致。

实施例3：DADH和AKR13B3的酶学性质研究

(1)DADH和AKR13B3的最适反应温度和温度稳定性

分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50、55和60℃)下对DADH和AKR13B3进行酶活测定，确定DADH和AKR13B3的最适反应温度。结果表明DADH和AKR13B3的最适反应温度分别为40和45℃(如图3A、4A所示)。

分别将DADH和AKR13B3在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃的条件下处理0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h，然后进行酶活测定，以未处理的为100％。结果表明DADH和AKR13B3具有非常好的热稳定性，在50℃处理3h，DADH和AKR13B3均可以保留55％以上的活性(如图3B、4B所示)。

(2)DADH和AKR13B3的最适反应pH和pH稳定性

分别在不同pH(4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和10)下对DADH和AKR13B3进行酶活测定，确定DADH和AKR13B3的最适反应pH，结果表明，DADH和AKR13B3的最适pH均为6.5(如图3C、4C所示)。

分别将DADH和AKR13B3在4、5、6、7、8、9和10的条件下处理12h，然后进行酶活测定，以未处理的为100％。结果表明DADH和AKR13B3具有非常好的pH稳定性，DADH在pH 6-10的条件下处理12h可以保留60％以上的活力，AKR13B3在pH 6-7.5的条件下处理12h可以保留80％以上的活力(如图3D、4D所示)。

实施例4：DADH和AKR13B3对DON的解毒能力

(1)以DON为底物(终浓度150μg/mL)，加DADH 10μg，0.1M CaCl

(2)以3-keto-DON为底物(终浓度300μM)，加入AKR13B310μg，10mM NADPH 1μL，pH＝7.5的Tris-HCl补足至100μL，于37℃条件下反应12h，采用高效液相色谱(HPLC)检测反应前后3-keto-DON浓度的变化，结果表明AKR13B3可以完全将3-keto-DON转化为无毒的3-epi-DON(如图3所示)。

实施例5：DADH和AKR13B3的组合反应

以DON为底物(终浓度150μg/mL)，加入10μg DADH，0.1M CaCl

本发明从土壤中筛选出的具有DON降解活性的德沃斯氏菌A6-243全基因组中鉴定出了具有DON降解活性的新型解毒酶DADH和AKR13B3，可以在18h内，将45-150μg/mL的DON完全降解为无毒产物3-epi-DON。通过序列比对发现，DADH与此前NCBI数据库报道的脱氢酶的序列相似性为55.94％，AKR13B3与已报道的醛酮还原酶的序列一致性仅为36.47％，为新型的DON解毒酶。

另外，酶学性质研究表明，DADH的最适反应温度和最适反应pH分别为40℃和6.5，与已报道的QDDH一致，AKR13B3最适反应温度和最适反应pH分别为45℃和6.5，与已报道的AKR13B2一致；且DADH和AKR13B3具有非常好的热稳定性和pH稳定性，在50℃处理3h，DADH和AKR13B3均可以保留55％以上的活性；DADH在pH 6-10的条件下处理12h可以保留60％以上的活力，AKR13B3在pH 6-7.5的条件下处理12h可以保留80％以上的活力，说明DADH和AKR13B3具有潜在的工业应用前景。

SEQ ID NO.1:

atgaaatccaaaatctccgtgttgctggcatctgctgcgatgctcagcgtgagctctgtcgcctatgcacaggtcgatatcagtgcgttgccgatggtaacggacgagatcctggctaatccggatgccggcgactggccgtcatacggtcgcgatgtgatgaactatcgctacagcccgctcgaccagatcaacaaagacaatgtcggcaacctgaccatggtctggggccgcgccctggagccgggcaatctgcagtccgctccgctggagttcggcggcgtaatgttcatcgccgctcctggcgacgtggtgcaggctatcgatgcagccaccggccagctggtgtgggaatatcgtcgcacgctgcccgaccgcgagacactgaactcgctgggtgagaacaagcgcggcatcgcgctctatgaagacaagatctacatggtctcctgggacaacttcatcgttgccctcgacgccaagaccggccaggtggcctgggaaagcgatcgtggcggtggcgccgacatgatctccaacaccaccggtccgatcgtggccgatggcgttgtcgttgccggctcgacctgccagttctcggaattcggctgctatgtgaccggtcacgacgctgctaccggtgaagagctctggcgcaataccttcattccgaaggccggcgaagagggtgacgacacctggggcgactccaccgaagaccagcgttggatgaccggcgcctggggccagatgacctatgacccggtaactggcctcgtcttctacggttccaccggtgccggcccggctgccgaattccagcgcaataccgttggcggcacgctctatggttcgaacactcgcttcgcagtgaagccgaagaccggcgagatcgtatggcgccaccaggttctgccgcgcgacaactgggaccaggaatgtacctatgaaatgatcccggtcgacatcaactccaacccgtctgcggacatggaaggcctgctggccctcggcaccgcaaccccgggcgagaagcgcgtgctgactggcgtgccgtgcaagaccggcgtgatgtggcagttcgacgcccagaccggcgagttcatctacgctcgtgataccgtccaggaaaacctgatcgagaaggtcgacgagaccggcctcgtgaccgtcaacgaagcggccatcccgaccgaagtcgacacccccaccttcatgtgcccgacctatctcggtggccgcgattggccgccgactgccttcaatcccgaaaccaaggtgatgttcgtcccgctcacgaacatgtgcgccaacgcgactgttcttgaccaggagcccacgggcctcgacgtctacaacaccgagcttgagtacatcctgcctgaaggtgtgacccatgctggtcgcatcgatgccatcaatgtggaaaccggcaagaccgtgtggagctggactgaccagaccccgctttatgcgccgatcgtttcgaccgccggcggcctgatcttcgttggtggcaccgatcgcaagttcaaggcaatcgaccaggagacgggcgaagtcgtttggtccaccaccctgccgtcgcgcgctaccggtcacccgatttcctatgaagtcgatggtcgccagtatatcgcgatcccggctggcggccctggctatgcgtcgctgttccttgaagcttcgggcaccactgccgacaccgtttcgggcagcaacgcagtctatgtgttcgccctgcctgaggccgctgccaagtaa

SEQ ID NO.2:

MKSKISVLLASAAMLSVSSVAYAQVDISALPMVTDEILANPDAGDWPSYGRDVMNYRYSPLDQINKDNVGNLTMVWGRALEPGNLQSAPLEFGGVMFIAAPGDVVQAIDAATGQLVWEYRRTLPDRETLNSLGENKRGIALYEDKIYMVSWDNFIVALDAKTGQVAWESDRGGGADMISNTTGPIVADGVVVAGSTCQFSEFGCYVTGHDAATGEELWRNTFIPKAGEEGDDTWGDSTEDQRWMTGAWGQMTYDPVTGLVFYGSTGAGPAAEFQRNTVGGTLYGSNTRFAVKPKTGEIVWRHQVLPRDNWDQECTYEMIPVDINSNPSADMEGLLALGTATPGEKRVLTGVPCKTGVMWQFDAQTGEFIYARDTVQENLIEKVDETGLVTVNEAAIPTEVDTPTFMCPTYLGGRDWPPTAFNPETKVMFVPLTNMCANATVLDQEPTGLDVYNTELEYILPEGVTHAGRIDAINVETGKTVWSWTDQTPLYAPIVSTAGGLIFVGGTDRKFKAIDQETGEVVWSTTLPSRATGHPISYEVDGRQYIAIPAGGPGYASLFLEASGTTADTVSGSNAVYVFALPEAAAK

SEQ ID NO.3:

atgaccaagctcgacgcatccctgtcggggaggttttccattggcggtgatctcaaggtcaaccgcctcggcttcggcgccatgcgcctcaccggtgatggcatctggggtccgcccaaggatcgtgacgaagccattcgcgtgctcaagcgcctgcccgagatcggggtcgacttcatcgacaccgccgagagctatggcccctatgtcagcgaagagctgatcggggaggcgctggcgccctatgacaagggcaccatcattgccaccaagagcgggctgacccgcagcggtcccaatcaatggccgccgctggggcgtccggaattcctgcgccagggcgtcatgaccagcctgcgccggctcaagctcgagcgcctcgatctctggcaattgcaccgcatcgacgccaagacgccgcgcgccgagcagttcgaggtgattgccgcgatgcagaaagaaggcctgattcgccatgccggcctttccgaggtcagcgtcgccgacatcgaggaggccagcaaatatttcaaggtcacaacggtgcagaacctttacaacttcgccaatcgcaagagcgaagcggtgctcgactattgcgaaaagcacggcatcggtttcatcccctggttcccgctggccggcggtgatctggtggagggtcatgaaaaggcccgcgccgtcatggacaagcatggcgccagcggcagccagatcgccctggcgtggctgctcaagcgctcccccgtcatgctgcccattcccggcaccagcaaggtcaagcatctcgaggacaatgtggccgctgccgccatcgatctcagcgacgaggatttcgccgcgctcgatgccattggtcgcgcctga

SEQ ID NO.4:

MTKLDASLSGRFSIGGDLKVNRLGFGAMRLTGDGIWGPPKDRDEAIRVLKRLPEIGVDFIDTAESYGPYVSEELIGEALAPYDKGTIIATKSGLTRSGPNQWPPLGRPEFLRQGVMTSLRRLKLERLDLWQLHRIDAKTPRAEQFEVIAAMQKEGLIRHAGLSEVSVADIEEASKYFKVTTVQNLYNFANRKSEAVLDYCEKHGIGFIPWFPLAGGDLVEGHEKARAVMDKHGASGSQIALAWLLKRSPVMLPIPGTSKVKHLEDNVAAAAIDLSDEDFAALDAIGRA。