一种富硒油菜中提高雄性生殖能力活性成分的提取方法及应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，尤其涉及一种富硒油菜中提高雄性生殖能力活性成分的提取方法及应用。

背景技术

油菜属十字花科芸薹属，有白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜三种，其中以甘蓝型油菜的种植最为广泛，具有产油量高，抗病毒能力强，抗寒且稳定性好等优点，同时作为药食同源植物，油菜的营养价值高、保健功能强。有研究表明，油菜对硒有特殊的富集功能，能够迅速吸收无机硒并将其转化为有机硒。目前，研究者们已培育出多个富硒油菜新品种。

不孕不育是21世纪影响人类健康的主要问题之一。在影响不孕不育的因素中，男性方面约占50％，而精液质量降低是造成男性不育的重要因素之一。据统计，导致男性精液质量下降的原因主要分为内在因素(遗传因素)和外在因素(环境因素)，尤其是环境污染的加剧使得男性生精细胞严重损伤。因此，生殖健康和生殖安全的提升应致力于提高男性生殖能力的研究。研究发现，补硒可以增强精子活力和精液质量。

近年来，人们对富硒油菜抗炎和增精方面的研究越来越多，但是对于富硒油菜的研究仍然停留在富硒油菜冻干样品水平，富硒油菜冻干样品中含有很多非活性成分，影响了富硒油菜中活性成分的精准研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种富硒油菜中提高雄性生殖能力活性成分的提取方法；所述方法获得的富硒油菜提取物提高雄性生殖能力的活性高，有利于后续富硒油菜提高雄性生殖能力活性成分的研究。

本发明提供了一种提取富硒油菜中提高雄性生殖能力活性成分的方法，包括以下步骤：

将富硒油菜薹与乙醇水溶液混合，进行超声提取获得富硒油菜提取物；

所述富硒油菜薹与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(10～25)ml；

所述乙醇水溶液的体积浓度为30～70％；

所述超声提取的功率为350～370W；所述超声提取的时间为3～18min。

优选的，所述提高雄性生殖能力包括提高睾丸间质细胞的存活率。

优选的，所述睾丸间质细胞包括小鼠睾丸间质细胞。

优选的，所述富硒油菜薹与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(15～22)ml；

所述乙醇水溶液的体积浓度为25～50％；

所述超声提取的功率为355～365W；所述超声提取的时间为8～12min。

优选的，所述富硒油菜薹为富硒油菜薹粉末。

本发明提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物。

本发明提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物在制备提高雄性生殖能力的药物中的应用。

本发明提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物在制备食品或保健品中的应用。

本发明提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物在制备提高睾丸间质细胞的存活率的药物或试剂中的应用。

优选的，所述富硒油菜提取物在药物或试剂中的浓度为1～4mg/ml。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用CCK-8实验测定小鼠睾丸细胞存活率的水平来考察富硒油菜提取物的促进小鼠睾丸间质细胞活性，确定了超声时间、料液比和乙醇浓度对富硒油菜提取物促进小鼠睾丸间质细胞活性能力的影响，获得了高活性的富硒油菜提取物的制备方法，能够使小鼠睾丸细胞存活率显著增加。

进一步的，本发明选取超声时间、料液比和乙醇浓度作为考察因素，对富硒油菜促进小鼠睾丸间质细胞活性成分的超声提取方法进行进一步的优化，得到富硒油菜促进小鼠睾丸间质细胞活性成分的最佳提取方法，得到细胞存活率最高为162.99％，能够用于指导富硒油菜提高雄性生殖能力活性成分的提取，有利于后续富硒油菜提高雄性生殖能力活性成分的研究。

附图说明

图1为不同超声时间对富硒油菜促进小鼠睾丸间质细胞活性成分提取的影响；

图2为不同料液比对富硒油菜促进小鼠睾丸间质细胞活性成分提取的影响；

图3为不同乙醇浓度对富硒油菜促进小鼠睾丸间质细胞活性成分提取的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种提取富硒油菜中提高雄性生殖能力活性成分的方法，包括以下步骤：将富硒油菜薹与乙醇水溶液混合，进行超声提取获得富硒油菜提取物。

在本发明中，所述富硒油菜薹优选的来源于中国农业科学院油料作物研究所，所述富硒油菜薹优选的为粉末，具体的将所述富硒油菜薹粉碎后，装袋密封保存。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度为30～70％，优选为35～50％，进一步优选为38～42％；所述富硒油菜薹与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(10～25)ml，优选为1g：(15～22)ml，进一步优选为1g：(19～21)ml；

在本发明中，所述超声提取的功率为350～370W，优选为355～365W，更优选为360W；所述超声提取的时间为3～18min，优选为8～12min，进一步优选为9～10min。本发明在所述超声提取后，优选的对提取料液进行过滤，收集滤液备用。所述过滤优选的采用无菌滤膜进行，所述无菌滤膜的孔径优选为0.22微米。

在本发明中，所述提高雄性生殖能力包括提高睾丸间质细胞的存活率，在本发明具体实施过程中，所述睾丸间质细胞为小鼠睾丸间质细胞。

本发明还提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物。

本发明还提供了所述的方法制备获得的富硒油菜提取物在制备提高雄性生殖能力的药物中的应用，尤其是在制备提高睾丸间质细胞的存活率的药物或试剂中的应用。

在本发明中，所述富硒油菜提取物在药物或试剂中的浓度优选为1～4mg/ml，进一步优选为2～3mg/ml。本发明对所述药物或试剂的剂型没有特殊限定，采用本领域常规的剂型即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.富硒油菜薹粉末的制备

所述富硒油菜薹优选的来源于中国农业科学院油料作物研究所，用粉碎机将富硒油菜薹进行粉碎，制成粉末，置于袋子中密封保存，备用。

将富硒油菜薹粉末与31.86％(v/v)乙醇水溶液按照1g:18.69ml的比例混合，进行超声提取9.34min获得富硒油菜提取物。

2.小鼠睾丸细胞培养和分析

小鼠睾丸间质细胞TM 4采用市售的小鼠睾丸间质细胞。用T25培养瓶培养小鼠睾丸间质细胞，观察T25培养瓶中的小鼠睾丸间质细胞铺满至80％以上后，取对数生长期的细胞，弃掉T25培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞，然后迅速用1mL 0.25％的胰蛋白酶消化细胞。消化完成后，加入2mL细胞培养基终止消化。将细胞悬液于离心机中1000rpm离心3min，弃上清，加入2mL细胞培养基，将细胞混匀。利用细胞计数仪计算活细胞个数，配置成1×10

添加富硒油菜提取物，每孔100μL，每一个浓度都设立6个平行孔，继续培养24h，吸出每孔中的培养基，将CCK-8与培养基按照1:9的体积比混匀，每孔加入100μL，37℃孵育40min。将96孔板在酶标仪内设定程序首先振荡15s，之后于450nm的波长下测定板中各孔的OD值。空白组采用培养基代替细胞样品，其他步骤操作一致。对照组中细胞样品采用不加富硒油菜提取物的培养基培养，其他处理步骤同上。

以如下公式计算小鼠睾丸间质细胞的存活率：

细胞存活率(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白自OD值)×100％。

在此条件下进行三次平行实验，得到细胞存活率为159.72％。

实验例1

(1)提取时间的影响

固定乙醇水溶液的体积浓度为70％，富硒油菜薹与乙醇水溶液料液比为1g:20ml，提取时间分别为3，6，9，12，18min，细胞存活率结果如图1，当超声时间为12min时小鼠睾丸细胞存活率显著增加，单因素实验说明12min提取效果最好。

(2)料液比的影响

固定乙醇水溶液的体积浓度为70％，提取时间为12min，富硒油菜薹与乙醇水溶液的料液比为1g:10ml，1g:15ml，1g:20ml，1g:25ml，结果如图2，当料液比为1g:15ml时小鼠睾丸细胞存活率显著增加，单因素实验说明料液比为1g:15ml时效果最好。

(3)乙醇浓度的影响

固定提取时间为12min，富硒油菜薹与乙醇水溶液料液比为1g:15ml，改变乙醇水溶液的体积浓度为30％，40％，50％，60％，70％，结果如图3，当乙醇浓度为30％时小鼠睾丸细胞存活率显著增加，单因素实验说明30％的乙醇浓度提取效果最好。

实验例2

为了更清楚分析多种因素交互作用，共设计进行17组实验，试验方法参照实施例1进行；结果如表1所示。

表1乙醇浓度、料液比、提取时间对TM4细胞存活率的影响

多种因素交互作用实验确定的最优选的乙醇浓度、料液比、提取时间分别为40％，20g/ml，9min。由上述实施例和实验例可知，本发明提供的提取方法获得的富硒油菜提取物，能够显著的提高小鼠睾丸间质细胞的成活率，有利于后续富硒油菜提高雄性生殖能力活性成分的研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。