一种与花椰菜坐球高度性状紧密连锁的KASP标记引物组及其应用

技术领域

本发明涉及一种与花椰菜坐球高度性状紧密连锁的KASP标记，具体涉及一种与花椰菜坐球高度性状紧密连锁的KASP标记引物组及其应用。

背景技术

花椰菜(Brassica.oleracea var.botrytis，2n＝2x＝18)作物起源于欧洲地中海沿岸，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，以花序分生组织异常增殖形成的特异花球为产品器官，因其富含维生素C、矿物质以及抗癌活性物质萝卜硫素而深受人们的青睐。

花椰菜产业是劳动密集型产业，从播种、移栽、施肥、采收等全生育期农事操作中，大部分环节依赖人工。近年来，随着蔬菜机械化研究的深入和发展，花椰菜的播种、移栽和施肥等生产环节部分实现了机械化，但是用工量较大的花球采收环节依旧需要依赖人工采收，效率低、成本高，已经成为限制花椰菜产业健康发展的瓶颈。“坐球高度”是限制花椰菜机械化采收的因素之一，由于地面至花球底部的距离太短，导致机械化采收困难。

因此，通过正向遗传学手段获得与花椰菜“坐球高度”性状紧密连锁的位点，并根据位点相关的序列开发相应的分子标记及实用性强的检测方法，为通过标记辅助选择、选育出适宜“坐球高度”的花椰菜优良新品种提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种与花椰菜坐球高度性状紧密连锁的KASP标记引物组及其应用，与花椰菜“坐球高度”紧密相关的KASP标记CSHK283作为连锁分子标记，用于快速、准确地筛选植株“坐球高度”表型。

为了达到上述目的，本发明提供了一种与花椰菜坐球高度性状连锁的KASP标记的引物组，该引物组包含：正向引物FAM、正向引物HEX和反向引物；其中，所述正向引物FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述正向引物HEX的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述正向引物FAM的核苷酸序列的5'端增加核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的通用接头序列。

优选地，所述正向引物HEX的核苷酸序列的5'端增加核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的通用接头序列。

本发明的另一目的是提供与花椰菜坐球高度性状连锁的KASP标记试剂盒，该试剂盒中的引物采用所述的引物组。

优选地，该试剂盒中的PCR预混液的组分包含：通用的FRET cassette荧光引物、ROX内参染料、KlearTaq DNA聚合酶、dNTP和MgCl

本发明的另一目的是提供所述的引物组或所述的试剂盒的应用，该应用选自以下任意一种：

(1)在辅助不同坐球高度的花椰菜育种中的应用；

(2)在检测花椰菜坐球高度性状主效QTL位点和基因定位中的应用。

优选地，采用所述的引物组或所述的试剂盒进行PCR，根据PCR产物的基因分型判断花椰菜的单球重量；若PCR产物的基因分型为AA，则花椰菜为主茎高度低或者坐球高度低的花椰菜；若PCR产物的基因分型为CC，则花椰菜为主茎高度高或者坐球高度高的花椰菜。

优选地，所述PCR的反应体系为：PCR预混液、所述的引物组和模板DNA。

优选地，所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。

本发明的与花椰菜坐球高度性状紧密连锁的KASP标记引物组及其应用，具有以下优点：

本发明构建了两张高密度遗传连锁图谱，结合群体单株的表型和基因型数据，两个群体中均在C1染色体上定位到了主效QTL，比对到HDEM参考基因组上，结果显示这两个QTL的物理位置有重叠，表明该共定位的QTL在不同遗传背景下，对花椰菜“坐球高度”性状起到稳定的调控作用。

本发明基于获得的主效QTL位点对应的HDEM参考基因组的物理区间内，根据亲本的重测序结果，选择基因型有差异的SNP位点并提取其侧翼序列，开发成KASP标记，通过进一步对遗传群体的筛选验证，选择基因分型结果良好，且与花椰菜“坐球高度”紧密相关的KASP标记CSHK283作为连锁分子标记，用于快速、准确地筛选植株“坐球高度”表型。该SNP位于青花菜HDEM(verson 1.0)参考基因组C1染色体第40400283位置的碱基A或C。当碱基序列由A突变为C时，对应花椰菜“坐球高度”显著提升。

本发明提供的与花椰菜“坐球高度”紧密连锁的SNP位点的检测方法，可应用于花椰菜“坐球高度”性状的辅助选择，“坐球高度”是典型的数量遗传性状，受到外部环境、自身发育状态等多种因素的影响，传统育种方法完全依赖于对“坐球高度”性状的表型调查进行选择，准确度较低，利用本方法可针对相应位点的基因型进行鉴定，确定样品中是否含有“坐球高度”高的基因，不仅检测方便，高效，而且准确，利用本方法在苗期即可对育种材料进行检测，可在早期淘汰大量非目标基因型的材料，大幅减少后期工作。

附图说明

图1为本发明以ZAASC4101为共有母本，建立了2个遗传分离群体CJ-F

图2为本发明利用主茎高度和叶恒间距来标定花椰菜“坐球高度”性状的示意图。

图3为本发明花椰菜“坐球高度”性状在双群体中的定位结果；a和b，CJ-F

图4为本发明KASP标记KCSH289鉴定F

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1与花椰菜“坐球高度”性状连锁的KASP分子标记的开发

1、花椰菜“坐球高度”性状的遗传定位

本发明利用主茎短的花椰菜亲本ZAASC4101为共有母本，分别与青花菜地方种来源的亲本ZAASR06和芥蓝亲本ZAASJ1401杂交，构建了两个F

2、开发与花椰菜“坐球高度”性状连锁的分子标记

本发明在上述获得的主效QTL位点对应的HDEM参考基因组的物理区间内，根据亲本的重测序结果，选择基因型有差异的SNP位点并提取其侧翼序列，开发成KASP标记，设计了5对KASP标记。通过进一步对遗传群体的筛选验证，选择基因分型结果良好，且与花椰菜“坐球高度”紧密相关的KASP标记CSHK283作为连锁分子标记，KASP标记CSHK283基因分型结果最好，和坐球高度表型相关性最高，用于快速、准确地筛选植株“坐球高度”表型。该SNP位于青花菜HDEM(verson 1.0)参考基因组C1染色体第40400283位置的碱基A或C。当碱基序列由A突变为C时，对应花椰菜“坐球高度”显著提升。

KASP标记CSHK283的引物，具体如下：

正向引物FAM的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

GACCATGACTTGTTCGAGT；

正向引物HEX的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)为：

GACCATGACTTGTTCGAGG；

反向引物(SEQ ID NO.3)：

TTGCAACCTGCTCGTCCTCGTT。

2条上游引物的5'端分别增加通用接头序列，具体如下：

正向引物FAM增加的通用接头序列(SEQ ID NO.4)为：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

正向引物HEX增加的通用接头序列(SEQ ID NO.5)为：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

上述引物对中两条正向引物在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。

实验例2KASP标记KCSH289在分离群体中的验证

1、待测分离群体DNA的提取与纯化

在CJ-F

2、利用KCSH289对次级分离群体单株的基因型鉴定

向上述提取的DNA模板中加入特异的KASP Primermix(KASP引物混合液)和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增。

其中，KASP Mastermix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物、ROX内参染料、KlearTaq DNA聚合酶、dNTP和MgCl

KASP检测的PCR反应体系为：PCR预混液5μL、KASP引物混合液0.14μL(其中各引物的终浓度均为5nM)和20ng/μL模板DNA 5μL。

KASP检测的PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。

结果显示，在92个单株中，有21株的基因型为AA，有24株的基因型为CC，有47株的基因型为AC(表1，图4)。

表1CJ-F

3、利用KCSH289对核心种质材料的基因型鉴定

为了进一步验证KCSH289标记对鉴定“坐球高度”性状的通用性，选取本组拥有的花椰菜等共计38份核心种质材料，通过播种、育苗、编号，于1～2片真叶时取单株叶片，按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA，并利用Nano-400A超微量核酸分析仪检测DNA的质量和浓度，-20℃保存，备用。利用KCSH289引物及上述同样的KASP标记PCR扩增及检测体系，对38份核心种质材料进行基因型鉴定。结果表明，27份材料该位点的基因型为AA，11份材料为CC(表2，图4)。

表2 38份核心种质材料的基因型和主茎高度数据

4、测定次级分离群体和核心种质材料的“坐球高度”表型

测定92个单株的主茎高度和叶痕间距，结合各单株KCSH289基因型数据，AA基因型单株的主茎高度和叶痕间距分别在11cm至23cm和2.4cm至3.8cm之间，两者平均值分别为17.38cm和3.08cm；CC基因型单株主茎高度和叶痕间距分别在20cm至42cm和2.9cm至6.6cm之间，两者平均值分别为28.12cm和4.36cm。t-检测显示两种不同基因型的表型之间有极显著的差异(P<0.001)，表明该标记可以高效、精准地用于区分花椰菜“坐球高度”。

同时，测定了38份核心种质材料的主茎高度表型，结合每份材料KCSH289基因型数据，AA基因型材料的主茎高度平均值为21.51cm，CC基因型材料的主茎高度平均值为33.25cm，t-检测显示两种不同基因型的表型之间有极显著的差异(P<0.001)，表明该标记在区分花椰菜等甘蓝类作物主茎高度性状上的通用性。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。