活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用。

背景技术

IFN-γ主要有T细胞和NK细胞产生。IFN-γ可以增强巨噬细胞和树突状细胞的抗微生物活性，增加MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子的表达，促进抗原提呈和T细胞的激活分化。IFN-γ还能抑制病毒复制，促进感染细胞中抗病毒蛋白的表达，有利于对病毒的清除，此外，IFN-γ还促进B细胞的分化和类别转换。因此，增加NK细胞的IFN-γ分泌是增强其功能的一个重要保证。

现有通过体外添加细胞因子(IL-21、IL-15等)的方法进行NK细胞培养的方法，NK细胞扩增能力大多在200～500倍，并且分泌IFN-γ的能力相对较弱，另外，现有技术针对靶向肺部的NK细胞的培养方案并不多，并且现有技术培养的NK细胞的靶向肺部能力也普遍较弱，难以适用于肺部相关疾病的治疗。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明提供了一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用，本发明的主要目的旨在解决现有技术NK细胞体外扩增中存在的NK细胞组织靶向性弱、杀伤活性较差的问题。

本发明的内容如下：

本发明第一方面提供了一种活化培养基，包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。

在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述活化培养基中，IL-2的浓度为10～1000U/mL、IL-15的浓度为5～50ng/mL、IL-18的浓度为5～50ng/mL、IL-21的浓度为5～50ng/mL、L-抗坏血酸的浓度为5～50μg/mL、氢化可的松的浓度为0.1～10μM、SCF的浓度为5～50U/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5～50ng/mL、5-氨基乙酰丙酸的浓度为50～500μM、白藜芦醇的浓度为0.1～10μM、TLR-7激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-8激动剂的浓度为0.5～50μM、TLR-9激动剂的浓度为0.5～50μM，灭活自体血浆的浓度为5～10％。

本发明第二方面提供了一种高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，包括：

使用刺激因子包被初始培养瓶，所述刺激因子包括纤连蛋白、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体中至少一种；

从人外周血中分离得到外周血单个核细胞；

将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，所述活化培养基包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆；

基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间；

收集得到培养好的NK细胞，进行所述NK细胞的相关测试，所述相关测试包括纯度、扩增倍数、杀伤活性和分泌的IFN-γ检测。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述初始培养瓶为T25培养瓶，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间包括：

在所述T25培养瓶中培养3天之后，将所述外周血单个核细胞转移到T175培养瓶中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；

在所述T175培养瓶中继续培养4天之后，将所述外周血单个核细胞转移到1L的培养袋中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；

在所述培养袋中继续培养9天之后，获得培养好的NK细胞。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述从人外周血中分离得到外周血单个核细胞采用密度梯度离心法。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中的接种密度为3×10

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，以及所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间均在30～40℃的培养温度以及3～5％的二氧化碳浓度下进行。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养的准则为使所述培养容器中的NK细胞浓度维持在2×10

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述收集得到培养好的NK细胞中NK细胞的含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。

本发明第三方面提供了一种上述任一项所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法培养得到的NK细胞在治疗肺癌药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种活化培养基、高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法及应用，本发明的活化培养基包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。基于本发明的活化培养基培养出来的NK细胞在体外培养16-18天，能使NK细胞扩增500-1000倍，NK细胞含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性NK细胞比例均＞90％，且较市售NK细胞培养基培养得到的NK细胞分泌更高水平的IFN-γ，此外，加入的5-氨基乙酰丙酸及中药单体白藜芦醇使NK细胞对A549肺癌细胞的体外杀伤率达95％以上。

附图说明

图1为各实施例和对比例外周血单个核细胞各培养时间点的存活曲线图；

图2为各实施例和对比例外周血单个核细胞的扩增曲线图；

图3为各实施例和对比例获得的NK细胞对A549肺癌细胞杀伤活性结果图；

图4：a为ELISA检测个实施例和对比例细胞上清液中细胞因子INF-γ浓度结果；b为流式检测实施例1细胞上清液中细胞因子INF-γ浓度结果图。

图5为实施例1外周血单个核细胞(PBMC)培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天的细胞形态图；

图6为实施例1培养第16天时NK细胞的流式检测纯度结果图；

图7为实施例1流式检测NK细胞表达肺部靶向标志性受体CCR5(a)和CXCR3(b)结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明第一方面提供了一种活化培养基，包括：IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆。

在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述活化培养基中，IL-2的浓度为10～1000U/mL(例如10U/mL、20U/mL、35U/mL、50U/mL、75U/mL、500U/mL、1000U/mL)、IL-15的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、IL-18的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、IL-21的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、L-抗坏血酸的浓度为5～50μg/mL(例如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)、氢化可的松的浓度为0.1～10μM(例如0.1μM、0.5μM、1μM、3μM、7μM、10μM)、SCF的浓度为5～50U/mL(例如5U/mL、7U/mL、10U/mL、30U/mL、45U/mL、50U/mL)、FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为5～50ng/mL(例如5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、50ng/mL)、5-氨基乙酰丙酸的浓度为50～500μM(例如50μM、55μM、100μM、150μM、300μM、400μM、500μM)、白藜芦醇的浓度为0.1～10μM(例如0.1μM、0.5μM、3μM、5μM、8μM、10μM)、TLR-7激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)、TLR-8激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)、TLR-9激动剂的浓度为0.5～50μM(例如0.5μM、1.5μM、3μM、10μM、35μM、45μM、50μM)，灭活自体血浆的浓度为5～10％(例如5％、6％、7.5％、10％)，需要说明的是灭活自体血浆的浓度为5～10％的意思是灭活自体血浆占活化培养基总体积的5～10％。

本发明第二方面提供了一种高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法，包括：

使用刺激因子包被初始培养瓶，所述刺激因子包括纤连蛋白(FN)、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体中至少一种；

从人外周血中分离得到外周血单个核细胞；

将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，所述活化培养基包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂以及灭活自体血浆；

基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间；

收集得到培养好的NK细胞，进行所述NK细胞的相关测试，所述相关测试包括纯度、扩增倍数、杀伤活性和分泌的IFN-γ检测。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述初始培养瓶为T25培养瓶，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间包括：

在所述T25培养瓶中培养3天之后，将所述外周血单个核细胞转移到T175培养瓶中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；

在所述T175培养瓶中继续培养4天之后，将所述外周血单个核细胞转移到1L的培养袋中并适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养；

在所述培养袋中继续培养9天之后，获得培养好的NK细胞。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述从人外周血中分离得到外周血单个核细胞采用密度梯度离心法。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中的接种密度为3×10

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述将所述外周血单个核细胞接种于包被好的所述初始培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，以及所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养，直至到达预定的培养时间均在30～40℃的培养温度以及3～5％的二氧化碳浓度下进行。

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述基于培养进度适时更换培养容器，并在更换后的所述培养容器中适时适量的补充所述活化培养基继续进行培养的准则为使所述培养容器中的NK细胞浓度维持在2×10

在本发明第二方面一种可选的实施方式中，所述收集得到培养好的NK细胞中NK细胞的含量＞90％，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。

本发明第三方面提供了一种上述任一项所述的高分泌IFN-γ的NK细胞的培养方法培养得到的NK细胞在治疗肺癌药物中的应用。

为了更好的说明本发明技术方案的技术效果，本发明构造了如下实施例和对比例进行测试。

实施例1：活化培养基包括TLR-7、8、9激动剂，相关细胞因子IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸(LAA)、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、白藜芦醇和灭活自体血浆的培养基，其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、IL-18的浓度为20ng/mL、IL-21的浓度为20ng/mL、LAA的浓度为20μg/mL、氢化可的松的浓度为5μM、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、5-ALA的浓度为100μM、白藜芦醇的浓度为10μM、TLR-7激动剂的浓度为10μM、TLR-8激动剂的浓度为10μM、TLR-9激动剂的浓度为10μM、灭活自体血浆的浓度为5％。

NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×10

对比例1：活化培养基包括TLR-7、8、9激动剂，相关细胞因子IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、L-抗坏血酸(LAA)、氢化可的松、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)和灭活自体血浆的培养基，其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、IL-18的浓度为20ng/mL、IL-21的浓度为20ng/mL、LAA的浓度为20μg/mL、氢化可的松的浓度为5μM、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、5-ALA的浓度为100μM、白藜芦醇的浓度为10μM、TLR-7激动剂的浓度为10μM、TLR-8激动剂的浓度为10μM、TLR-9激动剂的浓度为10μM、灭活自体血浆的浓度为5％，即活化培养基不包括5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)和白藜芦醇。

NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×10

对比例2：活化培养基只包括IL-2、IL-15、SCF、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)和灭活自体血浆。其中，IL-2的浓度为700U/mL、IL-15的浓度为20ng/mL、SCF的浓度为10U/mL、Flt3L的浓度为20ng/mL、灭活自体血浆的浓度为5％，

NK细胞的培养采用如下方法：使用刺激因子包被T25培养瓶，刺激因子包括FN、NKp44抗体、NKp46抗体、NKp30抗体和CD52抗体；分离人外周血单个核细胞(PBMC)；将外周血单个核细胞(PBMC)接种于包被好的T25培养瓶中，并加入适量活化培养基进行培养，其中PBMC接种浓度为4.0×10

对比例3：市售的一种NK细胞专用培养基试剂盒，包括NK-A液(包被用)、NK-B液(诱导用)、NK-C液(活化用)、NK-D液(扩增用)及基础培养基，具体试剂配方不详。NK细胞的培养方法依据试剂盒的提供的指导方法进行培养。

测试结果：采用全自动计数仪分别在培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天检测细胞数量，并绘制各实施例和对比例的NK细胞存活曲线(如图1和下表1)及细胞扩增曲线(如图2和下表2)，其中，实施例1扩增了约830倍。

表1各实施例和对比例的NK细胞存活率表

表2各实施例和对比例的NK细胞扩增倍数表

采用LDH释放实验检测收集的NK免疫细胞对A549肺癌细胞的杀伤活力，方法具体如下：以A549肺癌细胞(购自中国科学院细胞库)为靶细胞，以NK细胞为效应细胞，将处于对数期生长的A549肺癌细胞用0.25％的胰酶消化，制备成单个细胞悬液，台盼蓝染色计数，后调整细胞的密度为1×10

表3不同效靶比下各实施例和对比例的NK细胞扩增倍数表

采用ELISA试剂盒和流式细胞检测方法对收集的NK细胞上清液进行INF-γ浓度检测，检测结果如图4和表4所示。

表4各实施例和对比例的NK细胞分泌IFN-γ含量数据表

采用倒置显微镜分别在培养第0天、3天、5天、7天、9天、11天和16天拍照保存细胞形态，如图5所示。采用流式细胞检测方法对收集的细胞中NK细胞(CD3

基于本发明活化培养基和培养方法将人外周血单个核细胞在体外共培养2周后，能使NK细胞扩增500-1000倍，且NK细胞比例＞90％，并能够增强NK细胞的杀伤活性，对A549肺癌细胞的杀伤率＞95％(效靶比为10:1)，通过该培养方法获得的NK细胞具有靶向肺部的特性，表达靶向肺部标志性趋化因子CCR5和CXCR3的阳性细胞比例均＞90％。此外，通过该培养方法获得的NK细胞可分泌较高水平的IFN-γ(与市售NK细胞培养基相比)。实施例1获得的NK细胞上清液中IFN-γ浓度为17.12ng/mL，而对比例1(市售NK细胞培养基)获得的NK细胞上清液中IFN-γ浓度为8.28ng/mL，此外，在效靶比为10:1的条件下，加入的5-ALA及中药单体白藜芦醇使NK细胞对A549肺癌细胞的体外杀伤率达95％以上。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。