一种抑制IL-12与其受体结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抑制IL-12与其受体结合的多肽及其应用。

背景技术

IL-12主要来源于单核/巨噬细胞、抗原递呈细胞和B细胞，是由二硫键联接的异源双体，两个亚单位的分子量分别为35kDa和40kDa，等电点在pH4.5～5.5。从高产IL-12的人B淋巴样母细胞亚克隆NC37.98基因文库中克隆了IL-12cDNA，转染COS细胞获得高表达。人IL-12P35亚单位有197个氨基酸残基，含7个半胱氨酸和3个N糖基化位点，P40亚单位306个氨基酸残基，有10个半胱氨酸，4个N-糖基化位点。小鼠IL-12P35有193个氨基酸残基，与人IL-12P35有66％同源性，P40有313个氨基酸残基与人P40有70％同源性。在生理情况下，亚单位中的半胱氨酸残基之间可能形成复杂的分子间二硫键结构。两个亚单位是由不同的基因所编码，基因转染试验结果表明，只有将编码两个亚单位cDNA同时转染才能获得有生物学活性的IL-12。P35与IL-6和G-CSF有同源性，P40与IL-6受体、睫状神经营养因子(CNTF)受体、G-CSF受体有同源性，具有细胞因子受体家族的特征。提示IL-12分子可能是一种细胞因子/可溶性细胞因子受体复合物。在RPMI8866细胞系中纯化到的自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulating factor,NKSF)的结构和功能与IL-12相同。

IL－12R为一种细胞外516个氨基酸和细胞浆91个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，是造血生长因子受体超家族成员。IL-12R由β1链和β2链构成，有多种存在形式，与IL-12有很高的亲和力。p40与IL-12β2链结合，介导p35与β1链结合，后者发挥生物活性。IL-12R存在于激活的T细胞以及静息或激活的NK细胞上，B细胞和静息的T细胞则没有IL-12R表达。

IL-12是先天抵抗和适应性免疫的重要调节因子。IL-12参与了naive T细胞向Th1细胞的分化，被认为是T细胞刺激因子，可诱导T细胞增殖。同时可以增强对细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)的激活以及增加干扰素(IFN)-γ的产生。由于其促炎和免疫调节的能力，它可以使肿瘤由“冷”变成“热”。IL-12是一种前景广阔的抗肿瘤药物。然而，未经修饰的IL-12可能无法特异的在肿瘤微环境中累积，使其药效受到限制，并可能导致免疫相关副作用。除此之外，阻断IL-12信号通路也是银屑病、肠炎等自身免疫疾病的一个潜在治疗方向。

自身免疫性疾病(Autoimmune Disease，AID)一般被认为是人体自身免疫系统攻击正常细胞引起免疫能力下降、异常免疫能力突显，最终导致组织损伤或器官功能障碍的一类炎症性疾病。炎症反应是身体对抗外来病原体入侵的正常反应，然而当体内促炎症细胞因子和抑制炎症细胞因子的水平失衡时，会导致炎症持续发生，导致风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD，通常包括克罗恩病和溃疡性肠炎)、脊柱关节炎(SpA)和银屑病等慢性炎症性疾病。有研究指出，细胞免疫反应被认为是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)发病的关键因素。早期的证据表明，RA患者病情静止期的外周血单个核细胞上清液中IL-12水平高于健康对照人群，但在病情活动期又会明显高于病情静止期，这就提示了IL-12不仅参与RA的发病过程，还与其疾病活动度密切相关；尽管银屑病致病机制尚不清楚，但是T淋巴细胞和角质形成细胞的相互作用似乎是其免疫学发病机制的关键，而IL-12是参与T淋巴细胞免疫活动的重要细胞因子，并与其病情严重程度相关等。因此基于IL-12信号通路在释放促炎症细胞因子方面的关键性作用，这一信号通路也成为医药公司治疗慢性炎症疾病的热门靶标，催生了多款重磅疗法和在研疗法。杨森公司的Stelara(ustekinumab)是一款同时抑制IL-12和IL-23的单克隆抗体，它通过与IL-12和IL-23共同使用的IL12p40亚基结合来同时抑制这两种细胞因子的作用，已经获得批准治疗银屑病、银屑病关节炎和中重度克罗恩病。

尽管靶向IL-12抗体疗法已在临床上使用，本领域仍然存在着尚未得到满足的临床需求，非常需要治疗和/或预防IL-12相关和/或IL-12R相关疾病和病症的有效小分子和/或多肽治疗剂，相关疾病包括但不限于银屑病(PsO)、银屑病关节炎(PsA)，炎症性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提供了一种抑制IL-12与其受体结合的多肽及其应用。

一方面，本发明提供一种多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽选自如(1)～(3)任一项所述活性多肽：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽；

(2)项(1)中所述多肽中的10～50个连续氨基酸组成的多肽片段或反向多肽片段；优选的为30-35个连续氨基酸组成的多肽片段或反向多肽片段，更优选的为30、31、32或33个连续氨基酸组成的多肽片段或反向多肽片段；

(3)项(1)和/或项(2)中所述多肽经乙酰化、磷酸化、糖基化、琥珀酰化、泛素化修饰中一种或多种的氨基酸序列的多肽。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的80环肽为从多肽库中，通过高通量筛选技术，检测多肽对IL-12与IL-12R结合的抑制率得到的80环肽。具体序列如表1所示。该环肽的发现包括多肽库溶解及稀释，利用TR-FRET筛选方法根据多肽对IL-12与IL-12R结合的抑制率结果从多肽库中筛选。

筛选得到80环肽SEQ ID NO.1后，对该序列进行氨基酸的序列进行分析和拆解工作，能够设计出不同氨基酸序列的环肽。利用上述筛选80环肽同样的筛选方法，进一步筛选得到抑制IL-12与IL-12R结合的环肽。

表1本发明氨基酸序列

在一些实施方案中，所述多肽为首尾相连的环肽。

在一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的20～50连续氨基酸组成的多肽片段。

在一些实施方案中，所述多肽分子是对SEQ ID NO.1进行分析和拆解得到的环状肽，具有25～45个氨基酸；优选的具有30-35个氨基酸。

在一些实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:8中任一序列所示的氨基酸序列构成的肽段组成，具体序列如表1所示。SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:8所示的多肽能够抑制IL-12与IL-12R结合。

另一方面，本发明提供一种多肽或其药学上可接受的盐，所述多肽是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8多肽上经过取代、缺失、添加一个或数个氨基酸，且具有与氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8有相同或类似功能的多肽。

在一些实施方案中，所述多肽是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8多肽上经过取代、缺失、添加一个、两个、三个氨基酸，且具有与氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQID NO:8有相同或类似功能的多肽。

在一些实施方案中，所述多肽是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8多肽上经过取代、缺失、添加一个氨基酸，且具有与氨基酸序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8有相同或类似功能的多肽。

另一方面，本发明提供一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含能够编码上述的多肽分子的一个或两个的多核苷酸。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含安全有效量范围内的上述的多肽分子或其药学上可接受的盐及和一种或多种药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂和/或稀释剂。

另一方面，本发明提供上述的的多肽分子、多核苷酸分子或药物组合物在制备治疗与IL-12通路相关的疾病的药物上的应用。

在一些实施方案中，与IL-23通路相关的疾病可以选自克罗恩病、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、关节炎、溃疡性结肠炎、化脓性汗腺炎、特应性皮炎、强直性脊柱炎、哮喘等自身免疫性疾病。

除非本文中另外定义，否则本专利申请中所用的科学及技术术语应具有一般本领域技术人员通常所理解的含义。

本文所用“多肽库”是湖南中晟全肽生化有限公司利用PICT(PeptideInformation Compression Technology)专利技术，该技术利用生物学手段对多肽信息进行压缩，可将多个多肽的信息集成进一个多肽，从而实现以相对较小的库容包含较大的多肽信息量；通过PICT技术构建含有近73000条80个氨基酸的环肽库。其具体构建方法可以参见专利CN201580081102.3和专利CN201780089941.9。本发明所用多肽库比传统化学合成多肽库信息量大得多的多肽化合物氨基酸序列，库内各化合物均为独立生产，均经过质谱鉴定和精确称量，保证了筛检的准确和稳定，避免了传统的噬菌体库等混合化合物库的失真(实际库容远低于理论值)问题。

附图说明

图1为实施例2SEQ ID NO.1对抑制IL-12与IL-12R结合的浓度响应曲线；

图2为实施例3SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.8对抑制IL-12与IL-12R结合的浓度响应曲线；

具体实施例

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

实施例1多肽固相合成

本发明提供的多肽化合物及其衍生物可采用固相合成的方法合成。合成载体为2-Chlotrityl Resin树脂，合成过程中，首先将2-Chlotrityl Resin树脂在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中充分溶胀，然后该固相载体与活化后氨基酸衍生物重复缩合→洗涤→去保护Fmoc→洗涤→下一轮氨基酸缩合的操作以达到所要合成的多肽链长度，最后用三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5，v：v：v：v)的混合溶液与树脂反应将多肽从固相载体上裂解下来，再由冷冻甲基叔丁基醚沉降后得到直链前体的固体粗品。固体粗品或者氧化后多肽粗品在0.1％三氟乙酸的乙腈/水的体系由C18反相制备色谱柱纯化分离后得到多肽及其衍生物的纯品。

实验试剂

SEQ ID NO：2所示多肽固相合成

SEQ ID NO:2的肽链为CFHHHHHHLLPAIIDRIPPPTGRPDKPFRAWRS。

步骤1：偶联第一位氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH

将168mg(0.2mmol)2-Chlorotrityl chloride树脂在DCM中充分溶胀1h。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.16mmol)和二异丙基乙胺(DIEA,0.64mmol)溶于8mL DCM中并加入树脂中，在室温反应2h。反应完成后加入封闭液(10mL)DCM：甲醇：DIEA(85:10:5，v:v:v)室温10min进行封闭。封闭后的树脂用DCM洗5次，DMF洗5次。

步骤2：直链肽链合成

将步骤1中得到的树脂在DMF中充分溶胀1h。之后将依照的直链前体序列从羧基端第二位氨基酸到氨基端的顺序合成。每一个偶联周期进行如下：

·20％哌啶/DMF(20％v/v，10mL)进行Fmoc-去保护两次，每次8min。

·DMF冲洗树脂6-8次直到中性pH。

·用DMF溶解0.5mmol Fmoc-AA,0.5mmol 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)和1mmol 4-甲基吗啉(NMM),加入树脂室温反应1h。

·下一个氨基酸偶联之前用DMF冲洗树脂4-6次。

直链多肽合成后用DMF冲洗树脂5次，DCM冲洗树脂5次。树脂在真空中抽干。

步骤3：直链前体肽链切割

将新鲜配制的切割鸡尾酒(10mL)三氟乙酸：水：三异丙基硅烷：苯甲硫醚(90：2.5：2.5：5：，v：v：v：v)加入到步骤1所得树脂中，在室温下振荡反应2小时。反应结束后将反应溶液过滤，并用三氟乙酸洗涤树脂，与反应溶液合并，用4倍体积冷MTBE沉淀得到粗品。用MTBE洗涤粗品3次，放入真空中抽干。

步骤4：C端硫脂功能基团的形成

将步骤3得到的粗品溶解到0.1％三氟乙酸水溶液中，浓度为3～4mg/mL。将溶液放置40°C水浴中24小时进行C端S-to-N酰基转移从而形成硫脂基团。

步骤5：线性前体骨链环化

将步骤4反应溶液1:1(v：v)逐滴稀释到2mM还原型谷胱甘肽，50mM碳酸氢铵水溶液中。室温震荡24h。反应结束后加入2.5％(v：v)乙酸。

步骤6：多肽的纯化制备

经过0.45um膜过滤后用反相高效液相色谱系统进行分离，缓冲液为A(0.1％三氟乙酸，水溶液)和B(0.1％三氟乙酸，乙腈)。其中，色谱柱为BR-C18(赛分)反相色谱柱，纯化过程中色谱仪检测波长设定为230nm，流速为15mL/min，梯度为20-50％乙腈in 40min。收集产物相关馏分，HPLC鉴定纯度后将>95％的馏分合并，冻干，获得多肽纯品。

本发明其余多肽均可参照上述的Fmoc固相合成方法制备。

实施例2

多肽库的溶解：将多肽库96孔深孔板放于离心机4000rpm离心2～3分钟。用自动分液仪向96孔深孔板中加入200μL/孔超纯水中。用硅胶盖密封，放置95℃水浴5分钟。注：此时多肽浓度约为：50μM。溶解后的96深孔板多肽放于离心机4000rpm离心2～3分钟。

多肽库稀释：将溶解后的多肽用工作站转移至384孔板中，用loading buffer(Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4)稀释至10μM。

其中，多肽库是湖南中晟全肽生化有限公司自制。

应用TR-FRET筛选方法对大型实体多肽库进行验证。在384孔板中依次加入不同浓度测多肽、5nM IL-12B&IL-12A和10nM IL-12R beta 1,以及荧光供体Streptavidin-Eu和荧光受体Goat Anti-Human IgG Fc-Alexa Fluor647，室温孵育2小时后，检测TR-FRET信号。阳性对照：不含多肽，只含5nM IL-12B&IL-12A和10nM IL-12R beta 1,以及荧光供体Streptavidin-Eu和荧光受体Goat Anti-Human IgG Fc-Alexa Fluor647；阴性对照为：不含多肽，只含5nM IL-12B&IL-12A和10nM IL-12R beta 1其中一个组分或者2者都不含，以及荧光供体Streptavidin-Eu和荧光受体Goat Anti-Human IgG Fc-Alexa Fluor647。计算抑制率，作图。

通过对初筛到的多肽进行重复实验确认，最终确定从自制的80环肽库中筛选到的SEQ ID NO.1样品抑制率较高，后进行浓度依赖性验证。计算抑制率，作图。实验结果如表3所示，浓度响应曲线如图1所示。

表3 80环肽SEQ ID NO.1的筛选结果

从实验结果可以看出，本发明的80环肽对IL-12与IL-12R结合有抑制作用，且抑制作用随着80环肽的浓度增大而增强。

实施例3

应用内部环肽解压缩技术，对实施例1中筛选出的80环肽SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行分析和拆解工作，设计出10-80条不同氨基酸序列的线性肽或者环肽。按照实施例2筛选过程对设计出的10-80条不同氨基酸序列的线性肽或者环肽进行筛选，并对设计出的10-80条不同氨基酸序列中具有活性的线性肽或者环肽进行IC

对设计出的10-80条不同氨基酸序列IC

表4活性多肽的筛选结果

从实验结果可以看出，本发明的80环肽拆解之后得到的环状肽或者线性肽对IL-12与IL-12R结合有抑制作用。

应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。