抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用

本申请是申请日为2022年5月11日，申请号为202210506098.2，发明名称为“抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，涉及抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其应用，更具体地，涉及抗人GAS6抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸，表达该抗体的载体和细胞，制备该抗体的方法，含有该抗体的药物组合物、以及该抗体在制备药物中的用途。

背景技术

生长停滞特异性蛋白6(Growth arrest-specific gene 6，GAS6)是一个75kDa的可溶性糖蛋白，该蛋白由3个结构域组成，包括一个γ-羧基化的N端Gla结构域(γ-carboxylated glutamic acid domain)，一个类生长因子结构域(EGF-like domain)——含4个EGF重复基序和C端一个类性激素结合球蛋白结构域(SHBG-like domain)，后者包括两个层粘连蛋白(Laminin G，LG domain)。其中GAS6 N端GLA结构域的γ-羧基化对于受体的完全激活是必需的。GAS6广泛表达于各种组织，主要表达在肺，小肠，骨髓和内皮。

GAS6下游受体被称为TAM受体(TYRO3、AXL和MERTK)，属于受体酪氨酸激酶家族，GAS6通过其C端SHBG结构域的LG domain结合受体。GAS6与TAM受体作用参与多种生物过程，其与受体结合后，激活受体酪氨酸激酶活性，通过下游信号转导途径，包括PI3K、ERK及NF-kB等信号通路，在细胞增殖、存活、黏附、迁移、自噬、侵袭、血管生成、血小板聚集和NK细胞分化等方面发挥重要作用。在许多恶性肿瘤中，AXL与其配体GAS6都有高表达和活化，如急性髓系白血病、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等。并且，GAS6-AXL信号通路在促进肿瘤生长及转移、肿瘤免疫逃逸与药物耐受中起关键作用，二者的表达水平及相互作用与患者的临床不良预后紧密相关。

癌症是目前造成人类死亡率最高的疾病之一。抗癌抗体的最新临床和商业成功引起了对基于抗体的疗法的极大兴趣。由此，治疗癌症的抗癌抗体有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出抗人GAS6抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。

研究发现，GAS6-AXL信号通路在促进肿瘤生长及转移、肿瘤免疫逃逸与药物耐受中起关键作用，二者的表达水平及相互作用与患者的临床不良预后紧密相关。同时在GAS6异位和原位同源小鼠肿瘤模型研究中，与野生型小鼠相比，GAS6缺陷小鼠的肿瘤生长及转移扩散均受到阻碍。因此阻断该通路已被认为是治疗癌症的有效策略。

目前有多家制药公司及科研机构在进行针对GAS6-AXL通路的研究，主要包括小分子抑制剂、拮抗性治疗抗体的开发和AXL可溶性胞外受体(AXL decoy receptor，诱饵受体)的开发，通过阻断GAS6-AXL信号抑制肿瘤的生长、增殖等。如Amgen公司开发了针对GAS6的中和抗体，GMAB1和GMAB2，抗体通过阻断GAS6-AXL信号通路来抑制胰腺导管癌(pancreaticductal adenocarcinoma，PDAC)肿瘤的生长。Kyowa Kirin公司同样也开发了抗GAS6的单克隆抗体。经Aravive Biologics工程改造的Batiraxcept(AVB-500)(AXL诱饵受体)通过高亲和力的结合GAS6,螯合胞质中GAS6，特异性的阻断肿瘤细胞AXL的信号，从而有效的抑制肿瘤的转移和疾病的进展。该药目前主要用于铂类耐药的复发上皮卵巢癌、透明细胞肾癌等适应症，该诱饵受体可以改善化疗药物在卵巢癌和子宫浆液性癌中的敏感性，并且目前已启动铂类耐药的复发上皮卵巢癌的3期招募(NCT04729608)。以上均表明抑制GAS6对肿瘤治疗发挥积极的疗效。抗GAS6抗体在肿瘤治疗领域具有广泛的临床应用价值。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。据本发明的实施例，该抗人GAS6抗体或其抗原结合片段包括：

重链可变区，所述重链可变区(VH)包含抗原决定区(CDRs)1、2和3，且VH CDRs1、2和3分别包括所选VH CDRs1、2和3所示的氨基酸序列；

轻链可变区，所述轻链可变区(VL)包含抗原VL CDRs1、2和3，且VL CDRs 1、2和3分别包括所选VH CDRs1、2和3所示的氨基酸序列；

其中，所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列以及所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列选自下列之一：

(1)所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5、6和7所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、9和10所示；

(2)所述所选VH CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11、12和13所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：14、15和16所示；

(3)所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：49、50和51所示，所述所选VL CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：52、53和54所示；

(4)所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：57、58和59所示，所述所选VL CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如60、61和62所示；

(5)所述所选VH CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：63、64和65所示，所述所选VL CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如66、67和68所示。

根据本发明实施例的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段能特异性结合人GAS6和鼠GAS6蛋白，进而可以抑制GAS6-AXL信号传导途径，并能抑制细胞增殖，从而抑制肿瘤的进展、转移和耐药性。

根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人GAS6的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括前述的核酸。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的细胞。根据本发明的实施例，该细胞包括前述的载体。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)在合适的条件下，培养前述的细胞；以及

(2)分离回收前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段；以及药学上可接受的载体。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物。根据本发明的实施例，该抗体-药物缀合物包含与治疗剂共价结合的、前述的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的实施例，所述治疗剂为一甲基澳瑞他汀E(MMAE)或一甲基澳瑞他汀F(MMAF)。

根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。

根据本发明的实施例，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、头颈部癌及慢性和急性髓系白血病。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的免疫鼠血清与GAS6蛋白的结合结果示意图，其中，A为免疫鼠血清与人GAS6蛋白的ELISA结合结果；B为免疫鼠血清与鼠GAS6蛋白的ELISA结合结果；

图2显示了根据本发明一个实施例的鼠血清对GAS6-AXL结合的阻断结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与人GAS6 his蛋白的结合的结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与鼠GAS6 His蛋白的结合结果；

图5显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与人Protein S His蛋白的结合结果；

图6显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体对Ba/F3-AXL细胞增殖抑制的评估结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

抗人GAS6抗体和其抗原结合片段

本发明提供了特异性结合GAS6的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段能特异性结合人GAS6和鼠GAS6蛋白，进而可以抑制GAS6-AXL信号传导途径，并能抑制细胞增殖，从而抑制肿瘤的进展、转移和耐药性。

本发明实施例提供了几种抗GAS6抗体，例如ch2D3C6和ch2O18G6，包括例如小鼠抗体、及其嵌合抗体。一些公开的抗体的CDR序列(Kabat定义)和重链可变区和轻链可变区的序列在下表中所示。

表1

本发明实施例还提供了嵌合抗体。这些嵌合抗体具有来自小鼠抗体的VH和VL。然而，这些嵌合抗体的恒定结构域来自人抗体(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4)。这些嵌合抗体被标记为chHvLv-IgG。本公开描述的一些嵌合抗体在下表中所示。

表2

在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；所述轻链可变区包含CDR 1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VLCDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变区，所述轻链可变区含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:5-7、SEQ ID NO:8-10、SEQID NO:11-13或SEQ ID NO:14-16、SEQ ID NO:49-51、SEQ ID NO:52-54、SEQ ID NO:57-59、SEQ ID NO:60-62、SEQ ID NO:63-65或SEQ ID NO:66-68。例如，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有轻链可变结构域，所述轻链可变区含有以下的CDR中的一个、两个或三个：具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:5；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:6；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQID NO:7。

本发明实施例还提供了结合GAS6的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，基于本领域已知的各种CDR定义，例如Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来确定VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列由表1和表2所示。

核酸、载体和细胞

本发明实施例还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如在表1和表2中所示的CDR，或具有如表1和表2中所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所述配对的多肽结合GAS6(例如，人GAS6)。

本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。

如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。

可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。

本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。

制备抗GAS6抗体的方法

可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人GAS6的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。

免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽(例如人GAS6的片段)。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。

药物组合物和用途及治疗方法

本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。

药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。

在一个方面，本发明提供了前述的抗人GAS6抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、头颈部癌及慢性和急性髓系白血病。

本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。

在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段，所述癌症是例如乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、神经内分泌肿瘤、胰腺癌、膀胱癌和头颈部癌。

在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1动物免疫

用重组人GAS6 hFc蛋白免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，5只一组，具体的，每只老鼠用20ug重组GAS6蛋白(Human GAS6 C-Fc，Novoprotein，Cat#C12W)与弗氏完全佐剂(CFA)混合物通过皮下注射进行初次免疫，共进行5次免疫，其中接下来的四次免疫方法均是用20ug重组GAS6蛋白与弗氏不完全佐剂(IFA)混合物进行免疫，后面的4次免疫每次免疫间隔3周；而且最后两次免疫是用重组鼠GAS his蛋白(Sino Biological，Cat#58026-M08H)20ug进行。从第二次免疫开始，免疫后1周进行眼眶取血，获得的血清进行抗原特异性滴度检测和GAS6-AXL结合阻断检测。

(1)血清滴度抗原结合检测

用重组人GAS6 his蛋白(Novoprotein，Cat#C01W)和鼠GAS6 his蛋白(SinoBiological，Cat#58026-M08H)进行血清的ELISA结合试验。具体地，将1ug/ml人GAS6 his蛋白和1ug/ml鼠GAS6 his蛋白分别包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1％BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的血清并在37度孵育1小时；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗鼠IgG Fcγ片段特异性HRP抗体(Jackson ImmunoResearch，115-005-008)，37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1NHCl终止反应，用Spectra M5e仪器检测OD450nm读值。

结果如图1所述，经过5次人GAS6蛋白和鼠GAS6蛋白免疫后，小鼠血清对两种抗原均有不同程度的特异性结合，其中编号为#4的小鼠血清对两种抗原的应答均较强。

(2)血清滴度配体受体结合阻断检测

用ELISA方法评估鼠血清对人GAS6蛋白和人AXL蛋白结合的阻断作用。具体地，将重组人AXL his蛋白(AcroBiosystems，Cat#AXL-H5226)包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1％BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，每孔加入50ul梯度稀释的血清和50ul终浓度为150ng/ml重组人GAS6 hFc蛋白(Novoprotein，Cat#C12W)混合物并在37度孵育1小时；使用终浓度为20ug/ml的商业化GAS6中和抗体(R&D Systems，AB885)作为阳性对照(PC)和终浓度20ug/ml的Goat IgG(R&D Systems，AB-108-C)作为阴性对照(NC)。孵育并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098)，37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm读值。在该系统中，只加GAS6hFc蛋白并与HRP抗体孵育后的孔吸光值最大(Max)，只加1％BSA的孔吸光值最小(Mini)。比Max低的孔对应血清稀释度含有抑制人GAS6和人AXL结合的抗体，抑制率(％)＝(OD450

ELISA结果如图2显示，在低稀释梯度下(第三个稀释度，1:360)，小鼠血清对人GAS6hFc和人AXL his蛋白的结合有60％以上的抑制率，其中编号为#4的小鼠血清的抑制效果较好。

实施例2杂交瘤细胞的筛选和鉴定

(一)杂交瘤上清的初步筛选

1)杂交瘤上清的初步结合筛选

根据实施例1的血清滴度的检测结果，选择编号为#4和#5的两只小鼠进行加强免疫后取脾脏和淋巴结，研磨后将获得的细胞与鼠骨髓瘤细胞进行电融合，经HAT培养基和HT培养基培养10-14天后进行杂交瘤上清的筛选。首先用ELISA方法进行人GAS6 his蛋白和鼠GAS6 his蛋白的结合筛选，试验方法与血清滴度ELISA检测方法类似，将人GAS6 his蛋白和鼠GAS6 his蛋进行384孔板包被，1ug/ml，40ul/孔，进行过夜孵育，洗涤并封闭后加入杂交瘤上清30ul孵育后进行结合检测。最终筛选到372个克隆进行下一步阻断试验的筛选，其中有239个克隆与人鼠GAS6蛋白均有较强的结合；79个克隆与人GAS6结合较强，与鼠GAS6蛋白结合较弱；54个克隆与人GAS6有强结合，与鼠GAS6没有结合。

2)杂交瘤上清的初步阻断筛选

将ELISA结合试验选出来的372个克隆进行阻断试验的评估。具体方法与血清滴度阻断检测方法类似，将重组人AXL his蛋白包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。洗涤封闭后，每孔加入50ul杂交瘤上清和50ul终浓度为150ng/ml的重组人GAS6 hFc蛋白混合物并在37度孵育1小时。其中50ul杂交瘤培养基与50ul终浓度为150ng/ml的重组人GAS6hFc蛋白混合物作为信号最大值(Max)，只加杂交瘤培养基的孔吸光值为最小值(Mini)。洗涤后加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098)，孵育后洗涤，每孔加入100ul TMB底物显色，并用等体积的1NHCl终止反应，读取OD450nm吸光值。在该系统中，吸光值比Max低的孔对应的杂交瘤上清含有抑制人GAS6和人AXL结合的抗体，抑制率(％)＝(OD450

(二)杂交瘤上清的亚克隆筛选

根据杂交瘤上清的初步ELISA结合和阻断试验筛选，选择了53个克隆进行亚克隆，其中36个克隆与人GAS6和鼠GAS6结合均较强，配体受体结合抑制率大于50％；8个克隆与人GAS6结合较强，与鼠GAS6结合较弱，配体受体结合抑制率大于60％；9个克隆与人GAS6和鼠GAS6结合均较强，配体受体结合抑制率大于45％小于50％。亚克隆的上清经过人GAS6和鼠GAS6蛋白ELISA结合试验及配体受体结合阻断试验(方法同初步筛选使用方法)，最终挑选到11个与人GAS6和鼠GAS6蛋白均有较强结合，配体受体结合抑制率大于40％的候选克隆。

实施例3人鼠嵌合抗体的生产和鉴定

(一)候选克隆基因的提取

1)杂交瘤细胞中总RNA的提取和cDNA合成

将单克隆杂交瘤细胞培养至对数生长期后，收集细胞(约1E6个细胞/克隆)，利用

2)抗体VH和VL序列的基因扩增和T载体克隆

以合成的cDNA为模板，利用引物Primer A+S mix(含重轻链通用引物primer A和人hIgG1，2a，2b，3恒定区引物及人kappa特异性引物)和Ex Taq酶(TaKaRa，Cat#RR902A)对cDNA进行特异性扩增，PCR反应体系及循环如下。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒

然后利用Solution I(TaKaRa，Cat#6022Q)将回收片段克隆到pMD19-T(TaKaRa，Cat#3271)载体上，将克隆好的质粒通过热刺激的方法转化进感受态细胞DH5α(Yestern，Cat#FYE607-80VL)并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为通用引物PMAL-C2X-R(SEQ ID NO：70)。

(二)候选克隆人鼠嵌合表达载体的构建、表达和纯化

1)表达载体的构建

分析抗体VH和VL测序序列，选择抗体测序正确的TA克隆质粒，使用抗体VH/VL通用引物mix(含表达载体信号肽)，在高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa，Cat#R045)和引物作用下扩增目的片段(PCR程序如下)，电泳后利用胶回收试剂盒(MN，Cat#740609.250)回收目的片段。

回收片段在重组酶(Vazyme，Cat#C112-02)作用下插入到相应线性化载体(pTT5_hIgG1.G1m3/pTT5_hKappa.Km3)，其中，pTT5_hIgG1.G1m3载体含有hIgG1 Fc序列(SEQ IDNO:69)，pTT5_hKappa.Km3载体含有hKappa序列(SEQ ID NO:74)；将重组后的载体转化进感受态细胞DH5α中(Yestern，Cat#FYE607-80VL)并将其均匀涂布在含氨苄的2YT固体平板上，将平板送至测序公司Genewiz进行测序，测序引物为pTT5-F(SEQ ID NO:71)和pTT5-R(SEQID NO:72)。

2)嵌合抗体的表达和纯化

分析测序序列，扩增以上测序正确的质粒并将重轻链质粒以2:3的比例用PEI试剂(Polysciences，Cat#24885)(1ug质粒：4ug PEI)转染至密度为2E6/ml的HEK293细胞中，将转染的细胞放置37度，5％CO2轨道培养箱中培养5-7天。将培养上清离心并用0.22um滤器过滤，用Protein G琼脂糖填料的纯化柱(GE Healthcare Bio-sciences，17-0618-05)进行纯化。首先用1xPBS(pH7.4)平衡纯化柱，将过滤的培养上清上样到纯化柱，再用1xPBS(pH7.4)洗涤纯化柱后，用洗脱溶液(50nM柠檬酸钠，pH2.5)将样品洗脱下来，并用1MTris-HCl，pH9.0溶液中和洗脱样品。将中和后的样品用1xPBS(pH7.4)置换，用0.22um滤器过滤除菌，并用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific Inc)测定纯化抗体的浓度，备用。

(三)人鼠嵌合抗体的特异性结合鉴定

1)抗人GAS6嵌合抗体与人GAS6特异性结合及与鼠GAS6交叉结合活性的评估

用重组人GAS6 his蛋白(Novoprotein，Cat#C01W)和鼠GAS6 his蛋白(SinoBiological，Cat#58026-M08H)进行抗体的ELISA结合试验。具体地，将0.5ug/ml人GAS6 his蛋白和0.5ug/ml鼠GAS6 his蛋白分别包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1％BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的纯化抗体并在37度孵育1小时，其中anti-huGas6antibody(Santa cruz,sc-376087)和anti-mGas6 Ab(R&D systems,AF986)分别为结合人GAS6his蛋白和鼠GAS6 his蛋白的阳性对照抗体；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098)，37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm。

表3嵌合抗体与人和鼠GAS6 his蛋白ELISA结合结果的总结

ELISA结合结果如图3、图4和表1显示，有9个嵌合抗体可以特异性结合人GAS6 his和鼠GAS6 his蛋白。其中ch3K16C8、ch5I23B12、ch2O18G6、ch3F23G12、ch11B11D12、ch12H19D4和ch18I16C6与人鼠GAS6 his蛋白结合活性相当(表3)。

2)人鼠嵌合抗体与人Protein S交叉结合的评估

用重组人Protein his蛋白(R&D，Cat#9489-PS)进行抗体的ELISA结合试验。具体地，将1ug/ml人Protein S his蛋白包被在96孔板中，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1％BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，加入梯度稀释的纯化抗体并在37度孵育1小时；孵育后并洗涤后，加入1:5000稀释的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性HRP抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-098)，37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用Spectra M5e仪器检测OD450nm。

表4嵌合抗体与人Protein S his蛋白ELISA结合结果

ELISA结合结果如图5和表4所示，嵌合抗体ch2O18G6,ch15G5E5和ch18I16C6与人Protein S his蛋白均有交叉结合活性。

以上结果表明，抗体ch2O18G6,ch15G5E5和ch18I16C6与人GAS6 his蛋白、鼠GAS6his蛋白及人Protein S his蛋白均有特异性结合活性。

(四)人鼠嵌合抗体的阻断鉴定

用ELISA方法评估嵌合抗体对人GAS6蛋白和人AXL蛋白结合的阻断作用。具体地，将重组人AXL hFc蛋白(内部合成，序列如SEQ ID NO：73所示包被在96孔板中，1ug/ml，100ul/孔，孵育过夜。第二天将包被的96孔板用1xPBST洗三次，然后用1％BSA(1xPBST配制)封闭包被板，并在37度孵育1小时；孵育后用1xPBST洗三次，每孔加入50ul梯度稀释的抗体和50ul终浓度4ng/ml重组人GAS6 his蛋白(Novoprotein，Cat#C01W)混合物并在37度孵育1小时；终浓度10ug/ml的Kyowa Kirin GAS6中和抗体hzKM5321 LV7bHV0作为阳性对照和终浓度10ug/ml的human IgG作为阴性对照。50ul 1％BSA与50ul终浓度为4ng/ml的重组人GAS6 his蛋白混合物作为信号最大值(Max)，只加1％BSA的孔吸光值最小(Mini)。孵育并洗涤后，加入1:10000稀释兔抗6xhis HRP抗体(abcam,ab1187)，37度孵育1小时；PBST洗涤后每孔加入100ul TMB底物检测抗体结合，并用等体积的1N HCl终止反应，结果用SpectraM5e仪器检测OD450nm吸光值。结果显示，纯化的人鼠嵌合抗体对该系统中GAS6-AXL的结合显示出一定的阻断活性。

(五)人鼠嵌合抗体的增殖抑制活性鉴定

为了评估抗GAS6抗体对GAS6依赖性的细胞生长的影响，用Ba/F3-AXL细胞(南京科佰，Cat#CBP73249)进行了细胞增殖抑制试验。取对数生长的Ba/F3-AXL细胞，离心并丢弃培养上清，将离心下来的细胞用1xDPBS洗三次，重悬于新鲜RPMI1640+10％FBS+100ng/ml重组人GAS6 his(R&D，Cat#885-GSB)培养基中，细胞密度为5*10e4/ml；然后将重悬的细胞接种到96孔白色细胞培养板中，100ul/孔细胞悬液，设置3个重复孔，放置37度细胞培养箱4小时。孵育后，加入梯度稀释的10x抗体梯度溶液，11.1ul/孔，继续在37度细胞培养箱培养72小时。孵育72小时后每孔加入100ul Cell Titer Glo检测试剂(Promega，Cat#G7572)放置30分钟，读取RLU数值。未加抗体只含100ng/ml GAS6孔的RLU读数为最大值，只加培养基孔的RLU读数为最小值，hIgG1作为阴性对照。抗体增殖抑制活性(％)＝100-(样品孔RLU-最小值RLU)/(最大值RLU-最小值RLU)x100。

结果如图6显示，嵌合抗体ch2D3C6与ch2O18G6以浓度梯度依赖性的抑制Ba/F3-AXL的生长，在浓度200nM时对细胞的增殖分别有约30％和20％的抑制率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。