一种RT-qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法

技术领域

本发明涉及定量扩增领域，特别是涉及一种RT-qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法。

背景技术

骨关节炎OA是一种以关节软骨进行性退化、骨赘形成、骨再生重建及滑膜增生为特征，能影响绝大多数承重关节的疾病。目前针对骨关节炎的治疗手段主要药物治疗，如非甾体抗炎药、糖皮质激素等，病情严重的患者则需要手术治疗，如关节置换术和关节镜下清理术。

关节软骨的愈合能力十分有限，通过软骨组织工程在体外扩增自体软骨细胞，构建软骨组织工程支架是软骨损伤修复的方案之一。但是，软骨细胞体外培养容易发生去分化现象，从而不能维持其分化表型，移植后合成细胞外基质的功能发生改变，进而不能使关节软骨以透明软骨的形式愈合，而是纤维化软骨，其力学性能并不足以支撑患者进行高强度活动。

II型胶原是软骨基质的主要胶原成分，在保持软骨结构紧密型和生物力学特性方面起重要作用。II型胶原的合成与分泌是软骨细胞维持其分化表型的特征性标志。软骨细胞在体外单层培养过程中合成的II型、IX型胶原和聚合素迅速下降，而通常在软骨中并不表达的I型胶原和其他类型的间质胶原如III型、IV型胶原合成增加。II型胶原向I型胶原的转换被公认为是软骨细胞去分化的标志。

实时荧光定量的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RT-qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法，克服了常规PCR定性检测的不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，通过结果分析筛选，避免了细胞分泌能力不足导致后期培养试剂耗材的浪费。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种RT-qPCR表征猪关节软骨细胞胞外基质分泌能力的方法，以实时荧光定量PCR方法检测猪后腿膝关节总RNA中软骨细胞特异性蛋白基因序列，获得mRNA的相对表达值，根据相对表达值的大小定量检测细胞外基质的水平，本检测方法按照以下步骤进行：

步骤1：设计下列引物：

猪关节软骨细胞II型胶原蛋白基因COL2A1特异性上、下游引物：

COL2A1 F：5'-GCTATGGAGATGACAACCTGGCTC-3'；

COL2A1 R：5'-CACTTACCGGTGTGTTTCGTGCAG-3'；

猪关节软骨细胞I型胶原蛋白基因COL1A2特异性上、下游引物：

COL1A2 F：5'-ATACGCGGACTTTGTTGCTGCTTG-3'；

COL1A2 R：5'-TGTCCCTTCAATCCATCCAGACCA-3'；

作为内参基因的猪TBP1基因的特异性上、下游引物：

TBP1 F：5'-AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA-3'；

TBP1 R：5'-AGATGTTCTCAAACGCTTCG-3'；

其中，F代表上游引物，R代表下游引物；

步骤2：合成猪软骨细胞cDNA第一链：

2.1软骨细胞的提取：取新鲜猪软骨，置于PBS缓冲液中清洗剪碎，在浓度为0.01％的II型胶原酶中37℃消化14小时，离心后弃上清液，加入II型胶原酶继续37℃消化5小时，第一次收集细胞，再次加入II型胶原酶37℃消化3小时，再次收集细胞，将两次收集的细胞接种进行二维培养；

2.2软骨细胞总RNA提取：细胞培养3天后，弃去原有培养基，PBS清洗一次后，用含有0.02％ EDTA的胰蛋白酶37℃消化，在显微镜下观察细胞变化情况，待贴壁细胞变圆并脱落即可终止消化，收集细胞，取50万个细胞用动物RNA抽提试剂盒提取总RNA；

2.3cDNA合成：按照反转录试剂盒说明书依次操作：在Microtube中依次加入1μg浓度为1μg/μL的总RNA，1μL浓度为10mM的dNTP，12.5μL DEPC水，得混合试剂；

将混合试剂置于65℃水浴中保持10分钟，然后置于冰浴中保持3分钟，加入OligodT Primer 1μL，5×PrimeScript II Buffer 4μL，RNase inhibitor 0.5μL，RTase 1μL，混匀后置于PCR仪中，条件依次为42℃保持60分钟，95℃保持5分钟，4℃保持10分钟，得猪软骨细胞cDNA第一链；

步骤3：配置PCR反应体系：

取2×SYBR Green qPCR Mix 10μL，依次加入稀释10倍的cDNA第一链2μL、上游引物0.6μL、下游引物0.6μL，加ddH

步骤4：进行实时荧光定量PCR扩增：

以步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA第一链为cDNA模板，以步骤1中的COL2A1上、下游引物、COL1A2上、下游引物以及TBP1上、下游引物为特异性引物，在步骤3中的PCR反应体系中进行荧光定量PCR扩增，根据荧光信号的数据，获得COL2A1、COL1A2及内参基因TBP1片段的Ct值及溶解峰；

步骤5：将步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA稀释为10

所述相关系数用R

步骤6：将步骤5获得的PCR扩增产物COL2A1、COL1A2和TBP1基因片段测序，将测序所得核苷酸序列进行同源性比对。

作为本方案的进一步改进，步骤5获得的PCR扩增产物COL2A1、COL1A2基因片段和内参基因TBP1基因片段分别经过以下验证：

①通过测序分别得到：

COL2A1基因片段扩增核苷酸序列为：TTTGCTATGGAGATGACAACCTGGCTCCTAACACTGCCAACGTCCAGATGACCTTCCTGCGCCTGCTGTCCACCGAGGGCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCATTGCCTACCTGGACGAAGCTGCTGGCAACCTCAAGAAAGCCCTGCTCATCCAGGGCTCCAACGACGTGGAGATCCGGGCTGAGGGCAACAGCAGGTTCACGTATACTGTTCTGAAGGATGGCTGCACGAAACACACCGGTAAGTGAACAAC

COL1A2基因片段扩增核苷酸序列为：TTTTAATACGCGGGATTTGTTGCTGCTTGCAGTAACTTCGTGCCTAGCAACATGCCAATCTTTACAAGAGGCAACTGCAAGAAAGGGCCCAACTGGAGATAGAGGACCACGCGGAGAAAGGGGTCCACCAGGCCCACCAGGCAGAGATGGTGATGATGGTATCCCAGGCCCTCCTGGTCCACCTGGTCCTCCTGGCCCCCCTGGTCTTGGCGGGAACTTTGCTGCTCAGTATGATGGAAAAGGAGTTGGAGCTGGCCCTGGACCAATGGGTTTGATGGGACCTAGGG

GCCCTCCTGGGGCAGTTGGAGCCCCTGGCCCTC

AAGGTTTCCAAGGACCTGCTGGTGAGCCTGGCGAACCTGGTCAGACTGGTCCTGCTGGTGCTCGTGGTCCACCTGGCCCTCCTGGCAAGGCTGGTGAGGATGGTCACCCTGGAAAACCCGGACGACCTGGTGAGAGAGGAGTTGTTGGACCACAGGGTGCTCGTGGTTTCCCTGGAACTCCTGGACTTCCTGGCTTTCCAGGGCATTAGGGGTCACAACGGTCTGGATGGTGAAAAAGGGACAA

内参基因TBP1片段扩增核苷酸序列为：TTCGAACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGAGTTGTTTCCTGGTTTAATCTACAGAATGATCAAACCGCAGGGGTTACTCCTTATTTTTGTCTCTGGAAAAGTTGTATTAACAGGTGCTAAAGTCAGAGCAGAAATTTACGAAGCGTTTGAGAACAACTAGAA

作为本方案的进一步改进，步骤4和步骤5中PCR扩增的反应条件为：依次95℃预变性2分钟，95℃变性15s，60℃退火30s，重复循环，在60℃收集荧光信号。

作为本方案的进一步改进，所述重复循环为40次；

使用本发明的引物以及方法进行转录水平定量样品主要为软骨组织，也适用于其他组织使用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明中，采用上述方案，可较为容易地对猪关节软骨细胞II型胶原蛋白和I型胶原蛋白进行定量检测，能够很好地表征软骨细胞细胞外基质的分泌能力，具有快速、准确的优势，同时能够对多样本快速筛选，为后期构建组织工程支架提供筛选标准。

2、本发明所公开的引物是通过本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成后得到的，用该引物序列可实现猪II型胶原蛋白、I型胶原蛋白及内参基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，特异性强。

附图说明

图1为猪COL2A1基因溶解峰图；

图2为猪COL1A2基因溶解峰图；

图3为内参基因TBP1溶解峰图；

图4为猪COL2A1基因的扩增曲线图；

图5为猪COL2A1基因的标准曲线图；

图6为猪COL1A2基因的扩增曲线图；

图7为猪COL1A2基因的标准曲线图；

图8为猪TBP1基因的扩增曲线图；

图9为猪TBP1基因的标准曲线图；

图10不同传代次数猪软骨细胞Ⅱ型及Ⅰ型胶原蛋白含量对比；

图11不同月龄猪软骨细胞Ⅱ型及Ⅰ型胶原蛋白含量对比；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

所述实施例中的主要仪器设备与试剂：ABI实时荧光定量PCR仪7500型；Thermo超微量分光光度计Nano Drop；ABI的veriti PCR扩增仪；BeyoFast SYBR Green qPCR Mix；碧云天公司RNAeasy动物RNA抽提试剂盒；Takara公司PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit。

实施例1：RT-qPCR表征猪关节软骨组织细胞外基质分泌能力的方法

步骤1：设计下列引物：

猪关节软骨细胞II型胶原蛋白基因COL2A1特异性上、下游引物：

COL2A1 F：5'-GCTATGGAGATGACAACCTGGCTC-3'；

COL2A1 R：5'-CACTTACCGGTGTGTTTCGTGCAG-3'；

猪关节软骨细胞I型胶原蛋白基因COL1A2特异性上、下游引物：

COL1A2 F：5'-ATACGCGGACTTTGTTGCTGCTTG-3'；

COL1A2 R：5'-TGTCCCTTCAATCCATCCAGACCA-3'；

作为内参基因的猪TBP1基因的特异性上、下游引物：

TBP1 F：5'-AACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGA-3'；

TBP1 R：5'-AGATGTTCTCAAACGCTTCG-3'；

其中，F代表上游引物，R代表下游引物；

猪的COL2A1、COL1A2和TBP1引物由上海生物工程有限公司合成。

步骤2：合成猪软骨细胞cDNA第一链：

2.1软骨细胞的提取：取新鲜猪软骨，置于PBS缓冲液中清洗剪碎，在浓度为0.01％的II型胶原酶中37℃消化14小时，离心后弃上清液，加入II型胶原酶继续37℃消化5小时，第一次收集细胞，再次加入II型胶原酶37℃消化3小时，再次收集细胞，将两次收集的细胞接种进行二维培养；

2.2软骨细胞总RNA提取：细胞培养3天后，吸弃原有培养基，PBS清洗一次后，用含有0.02％ EDTA的胰蛋白酶进行消化收集细胞，取50W细胞用RNAeasy动物RNA抽提试剂盒提取总RNA。

2.3cDNA合成：按照反转录试剂盒PrimeScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit说明书依次操作：PCR管中加入1μL浓度稀释为1μg/μL的总RNA，1μL dNTP，12.5μL DEPC水，65℃水浴10分钟，冰浴3分钟，然后加入Oligo dT Primer 1μL，5×PrimeScript IIBuffer4μL，RNase inhibitor 0.5μL，Prime Script II RTase 1μL，混匀后置于PCR仪中，条件依次为42℃60分钟，95℃5分钟，4℃10分钟，得猪软骨细胞cDNA第一链。

步骤3：配置PCR反应体系：

取2×SYBR Green qPCR Mix 10μL，依次加入稀释10倍的cDNA第一链2μL、上游引物0.6μL、下游引物0.6μL，加ddH

步骤4：进行实时荧光定量PCR扩增：

以步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA第一链为cDNA模板，以步骤1中的COL2A1上、下游引物、COL1A2上、下游引物以及TBP1上、下游引物为特异性引物，在上述PCR反应体系中进行荧光定量PCR检测，根据荧光信号的数据，获得COL2A1、COL1A2及内参基因TBP1片段的Ct值及溶解峰；

步骤5：将步骤2中的猪关节软骨细胞cDNA稀释成10

步骤4和步骤5中PCR扩增的反应条件为：依次95℃预变性2分钟，95℃变性15s，60℃退火30s，重复循环40次，在60℃收集荧光信号。

步骤5获得的PCR扩增产物COL2A1、COL1A2基因片段和内参基因TBP1基因片段分别经过以下验证：

①通过商业生物公司测序分别得到：

COL2A1基因片段扩增核苷酸序列为：TTTGCTATGGAGATGACAACCTGGCTCCTAACACTGCCAACGTCCAGATGACCTTCCTGCGCCTGCTGTCCACCGAGGGCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCATTGCCTACCTGGACGAAGCTGCTGGCAACCTCAAGAAAGCCCTGCTCATCCAGGGCTCCAACGACGTGGAGATCCGGGCTGAGGGCAACAGCAGGTTCACGTATACTGTTCTGAAGGATGGCTGCACGAAACACACCGGTAAGTGAACAAC

COL1A2基因片段扩增核苷酸序列为：TTTTAATACGCGGGATTTGTTGCTGCTTGCAGTAACTTCGTGCCTAGCAACATGCCAATCTTTACAAGAGGCAACTGCAAGAAAGGGCCCAACTGGAGATAGAGGACCACGCGGAGAAAGGGGTCCACCAGGCCCACCAGGCAGAGATGGTGATGATGGTATCCCAGGCCCTCCTGGTCCACCTGGTCCTCCTGGCCCCCCTGGTCTTGGCGGGAACTTTGCTGCTCAGTATGATGGAAAAGGAGTTGGAGCTGGCCCTGGACCAATGGGTTTGATGGGACCTAGGG

GCCCTCCTGGGGCAGTTGGAGCCCCTGGCCCTC

AAGGTTTCCAAGGACCTGCTGGTGAGCCTGGCGAACCTGGTCAGACTGGTCCTGCTGGTGCTCGTGGTCCACCTGGCCCTCCTGGCAAGGCTGGTGAGGATGGTCACCCTGGAAAACCCGGACGACCTGGTGAGAGAGGAGTTGTTGGACCACAGGGTGCTCGTGGTTTCCCTGGAACTCCTGGACTTCCTGGCTTTCCAGGGCATTAGGGGTCACAACGGTCTGGATGGTGAAAAAGGGACAA

内参基因TBP1片段扩增核苷酸序列为：TTCGAACAGTTCAGTAGTTATGAGCCAGAGTTGTTTCCTGGTTTAATCTACAGAATGATCAAACCGCAGGGGTTACTCCTTATTTTTGTCTCTGGAAAAGTTGTATTAACAGGTGCTAAAGTCAGAGCAGAAATTTACGAAGCGTTTGAGAACAACTAGAA

步骤6：将步骤5中测序所得核苷酸序列通过SNAPGENE软件与NCBI所报道的猪COL2A1、COL1A2基因和内参基因TBP1的核苷酸序列进行同源性比对。结果显示：用本发明所提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的II型胶原蛋白基因COL2A1与NCBI上XM_021092611.1的同源性为96％；I型胶原蛋白基因COL1A2与NCBI上NM_001243655.1的同源性为99.27％；TBP1基因与NCBI上XM_047769671.1的同源性为95.48％，证明本发明所扩增出的目的片段分别为猪的COL2A1、COL1A2和TBP1基因片段。

实施例2：RT-qPCR表征猪关节软骨组织细胞不同传代次数外基质分泌能力的方法

步骤1：设计引物

方法同实施例1.

步骤2：合成猪软骨细胞cDNA第一链

2.1软骨细胞的提取：取新鲜的猪后腿骨，用手术刀去掉股骨上多余的肉。把膝关节边上的韧带、半月板剪断，多余的肉质剪掉，露出洁净的关节软骨，用手术刀片撬下2cm*2cm*2mm大小的软骨，置于PBS中清洗剪碎，用0.01％II型胶原酶消化，收集消化液离心后用培养液重悬，接种细胞进行二维培养，该细胞视为P0代，待细胞融合度达70％左右时，进行传代，连续传代至第2代。

2.2软骨细胞总RNA提取：分别将P0、P1、P2代细胞培养3天后，吸弃原有培养基，PBS清洗一次后，用含有0.02％ EDTA的胰蛋白酶进行消化收集细胞，取50W细胞用RNAeasy动物RNA抽提试剂盒提取总RNA。

2.3cDNA合成：方法同实施例1。

步骤3：方法同实施例1。

步骤4：方法同实施例1。

步骤5：方法同实施例1。

步骤6：方法同实施例1。

实施例3：RT-qPCR表征不同月龄猪关节软骨组织细胞外基质分泌能力的方法

步骤1：设计引物

方法同实施例1

步骤2：合成猪软骨细胞cDNA第一链

2.1软骨细胞的提取：分别取5、6、7月龄新鲜的猪后腿骨，用手术刀去掉股骨上多余的肉，把膝关节边上的韧带、半月板剪断，多余的肉质剪掉，露出洁净的关节软骨，用手术刀片撬下2cm*2cm*2mm大小的软骨，置于PBS中清洗剪碎，用0.01％II型胶原酶消化，收集消化液离心后用培养液重悬，接种细胞进行二维培养。

2.2软骨细胞总RNA提取：

细胞培养3天后，吸弃原有培养基，PBS清洗一次后，用含有0.02％ EDTA的胰蛋白酶进行消化收集细胞，取50W细胞用RNAeasy

2.3cDNA合成：方法同实施例1

步骤3：方法同实施例1。

步骤4：方法同实施例1。

步骤5：方法同实施例1。

步骤6：方法同实施例1。

结果

1、步骤3中测序所得核苷酸序列分别通过SNAPGENE软件与NCBI所报道的猪COL2A1、COL1A2基因和内参基因TBP1的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明所提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的II型胶原蛋白基因COL2A1与NCBI上XM_021092611.1的同源性为96％；I型胶原蛋白基因COL1A2与NCBI上NM_001243655.1的同源性为99.27％；TBP1基因与NCBI上XM_047769671.1的同源性为95.48％，证明本发明所扩增出的目的片段分别为猪的COL2A1、COL1A2和TBP1基因片段。

通过real-time RT-PCR实时荧光定量PCR反应，绘制出的COL2A1、COL1A2溶解峰如图1、2，TBP1溶解峰如图3，显示COL2A1、COL1A2基因及内参基因TBP1扩增特异性好，溶解峰单一，引物设计特异性符合实验要求。这三对引物的溶解温度为：COL2A1：87.2℃，COL1A2：82.6℃，TBP1：84.3℃，符合SYBR Green法的溶解曲线判断指标。

反应结束后根据各稀释浓度的Ct值，绘制出扩增曲线及标准曲线，见图4-9，结果显示COL2A1基因扩增效率为扩增效率为114.167％，斜率-3.023，R

2、实施例2中所获得的猪关节软骨组织cDNA，经荧光定量检测后，软件分析模式测定均一化后的基因表达如图10可见，体外培养的猪软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强，功能性蛋白表达整体下降，主要表现为细胞合成Ⅱ型胶原的能力逐渐下降，Ⅱ型胶原含量逐渐降低，Ⅰ型胶原含量逐渐升高，提示猪关节软骨细胞细胞外基质分泌能力随传代次数增加而降低。

该方法能够直观的反映出软骨细胞体外培养去分化程度，为原代细胞体外培养、传代提供数据支持。

3、实施例3中所获得的猪关节软骨组织cDNA，经荧光定量检测后，软件分析模式测定均一化后的基因表达如11可见，随着猪月龄逐渐增加，Ⅱ型胶原含量逐渐降低，Ⅰ型胶原含量逐渐升高，提示猪关节软骨细胞细胞外基质分泌能力随月龄增大而降低。

该方法能够较明显的表征不同月龄的猪软骨细胞其II型胶原分泌能力的高低，为软骨细胞体外培养及其在组织工程领域和再生医疗领域上的应用提供帮助。