一种培养基、干细胞分泌物及其在治疗心肌纤维化应用

技术领域

本发明涉及干细胞和心血管疾病领域，特别是一种培养基、干细胞分泌物及其在治疗心肌纤维化应用。

背景技术

心肌纤维化以心肌成纤维细胞的异常增殖、胶原纤维的过量聚集，胶原含量过度升高或胶原成分发生改变为特征，是高血压、冠心病、心肌梗死等多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理表现，可致充血性心力衰竭、恶性心律失常，甚至心源性猝死。间充质干细胞不仅具有自我复制能力而且具有多向分泌的潜能，目前研究结果显示，间充质干细胞可通过旁分泌和自分泌作用减轻心脏功能受损。

基于干细胞的潜力，本申请开发了一种培养基，该培养基所含的中药发酵物是以黄芪、香橼、佛手为基质，益生菌为发酵菌株进行发酵所得，然后我们继续研究该培养基对干细胞作用，发现其能促进干细胞分泌某种某种活性细胞因子，该活性细胞因子对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞过度增殖的具有显著的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种培养基、干细胞分泌物及其在治疗心肌纤维化应用，以解决上述技术背景中提出的问题。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

第一方面的，本发明提供了一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物为中药组合物经益生菌剂发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含10～15份黄芪、6～10份香橼、6～10份佛手。

进一步的，所述中药组合物按重量份数计包含12份黄芪、8份香橼、8份佛手。

进一步的，所述益生菌剂为嗜酸乳杆菌发酵液，其中，所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

进一步的，所述嗜酸乳杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

(1)在无菌条件下，将保存好的嗜酸乳杆菌接种于MRS培养基中活化培养后作为发酵培养的种子液；

(2)将步骤(1)所得嗜酸乳杆菌种子液以接种量2～3v/v％接种在MRS培养基中，36～38℃下培养20～24h，得到浓度为10

进一步的，所述中药发酵物的制备方法为：

(1)将中药组合物所含成分按比例混合后，加入8～10倍量的蒸馏水进行提取，3次提取后将滤液合并，浓缩至生药浓度为0.5～1.0g/ml的浓缩液；

(2)向浓缩液中以0.5～2v/v％的添加量加入益生菌剂，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间为2.5h～4h，得中药发酵物。

进一步的，所述中药发酵物的添加量为0.1～2.0v/v％。

进一步的，所述基础培养基为DMEM/F12、DMEM或α-MEM。

第二方面的，本发明提供了干细胞分泌物，其为干细胞在上述所述培养基培养后的上清液。

进一步的，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。

第三方面的，本发明提供了上述所述干细胞分泌物在制备预防或治疗心肌纤维化的药物中的应用。

本发明创新在于，中药组合物(黄芪、香橼、佛手)经益生菌剂发酵得到的发酵物能促进了干细胞中某些活性细胞因子的产生或分泌，这些活性细胞因子能够能显著抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖，预示有可能开发成防治心肌纤维化的创新药物。且黄芪、香橼、佛手与嗜酸乳杆菌协同作用，缺一不可，只有黄芪、香橼、佛手经嗜酸乳杆菌发酵所得发酵物才能促进活性细胞因子的产生，从而抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本申请提供了一种培养基，该培养基所含的中药发酵物是以黄芪、香橼、佛手为基质，益生菌为发酵菌株进行发酵所得，该培养基能促进了干细胞中某些活性细胞因子的产生或分泌(干细胞分泌物)，这些活性细胞因子能够能显著抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖，预示有可能开发成防治心肌纤维化的创新药物。

附图说明

图1为本发明干细胞分泌物对AngⅡ刺激的HCFB增殖的影响；

图2为本发明干细胞分泌物对HCFB分泌ColⅠ、ColⅢ情况影响；

图3为本发明干细胞分泌物对HCFB分泌TGF-β1和CTGF分泌情况影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

培养基

实施例1

一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的2.0v/v％。所述基础培养基为DMEM/F12(Gibco公司)。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含10份黄芪、10份香橼、6份佛手；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

本实施例中，所述嗜酸乳杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

(1)在无菌条件下，将保存好的嗜酸乳杆菌(货号GIM1.731，购于上海沪峥生物科技有限公司)接种于MRS培养基中活化培养后作为发酵培养的种子液；

(2)将步骤(1)所得嗜酸乳杆菌种子液以接种量3v/v％接种在MRS培养基中，37℃下培养24h，得到浓度为10

本实施例中，所述中药发酵物的制备方法为：

(1)将中药组合物所含成分按比例混合后，加入10倍量的蒸馏水进行提取，3次提取后将滤液合并，浓缩至生药浓度为1.0g/ml的浓缩液；

(2)向浓缩液中以0.5v/v％的添加量加入嗜酸乳杆菌发酵液，发酵温度为35℃，发酵时间为3.5h，得中药发酵物。

实施例2

一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的1.0v/v％。所述基础培养基为DMEM(Gibco公司)。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含12份黄芪、8份香橼、8份佛手；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

本实施例中，所述嗜酸乳杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

(1)在无菌条件下，将保存好的嗜酸乳杆菌接种于MRS培养基中活化培养后作为发酵培养的种子液；

(2)将步骤(1)所得嗜酸乳杆菌种子液以接种量3v/v％接种在MRS培养基中，37℃下培养24h，得到浓度为10

本实施例中，所述中药发酵物的制备方法为：

(1)将中药组合物所含成分按比例混合后，加入8倍量的蒸馏水进行提取，3次提取后将滤液合并，浓缩至生药浓度为0.8g/ml的浓缩液；

(2)向浓缩液中以1.0v/v％的添加量加入益生菌剂，发酵温度为38℃，发酵时间为4h，得中药发酵物。

实施例3

一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的0.2v/v％。所述基础培养基为α-MEM(Gibco公司)。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含15份黄芪、6份香橼、10份佛手；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

本实施例中，所述嗜酸乳杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

(1)在无菌条件下，将保存好的嗜酸乳杆菌接种于MRS培养基中活化培养后作为发酵培养的种子液；

(2)将步骤(1)所得嗜酸乳杆菌种子液以接种量2v/v％接种在MRS培养基中，37℃下培养20h，得到浓度为10

本实施例中，所述中药发酵物的制备方法为：

(1)将中药组合物所含成分按比例混合后，加入8倍量的蒸馏水进行提取，3次提取后将滤液合并，浓缩至生药浓度为0.5g/ml的浓缩液；

(2)向浓缩液中以2.0v/v％的添加量加入益生菌剂，发酵温度为40℃，发酵时间为2.5h，得中药发酵物。

对比例1

本实施例与实施例2相似，区别在于：中药组合物中不含有黄芪。具体为：一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的1.0v/v％。所述基础培养基为DMEM。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含8份香橼和8份佛手；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

对比例2

本实施例与实施例2相似，区别在于：中药组合物中不含有香橼。一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的1.0v/v％。所述基础培养基为DMEM。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含12份黄芪和8份佛手；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

对比例3

本实施例与实施例2相似，区别在于：中药组合物中不含有佛手。一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的1.0v/v％。所述基础培养基为DMEM。所述中药发酵物为中药组合物经嗜酸乳杆菌发酵液发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含12份黄芪和8份香橼；所述嗜酸乳杆菌发酵液中嗜酸乳杆菌的浓度为10

对比例4

本实施例与实施例2相似，区别在于：中药发酵物不经过嗜酸乳杆菌发酵液发酵。一种培养基，包含中药发酵物和基础培养基，所述中药发酵物的添加量为基础培养基的1.0v/v％。所述基础培养基为DMEM。所述中药发酵物为中药组合物直接进行发酵得到的发酵物，所述中药组合物按重量份数计包含12份黄芪、8份香橼、8份佛手；

本实施例中，所述中药发酵物的制备方法为：

(1)将中药组合物所含成分按比例混合后，加入8倍量的蒸馏水进行提取，3次提取后将滤液合并，浓缩至生药浓度为0.8g/ml的浓缩液；

(2)将浓缩液在38℃的发酵温度进行发酵4h，得中药发酵物。

干细胞分泌物

本申请实施例4提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在实施例1所提供的培养基培养后的上清液。

干细胞分泌物的获取方法为：取脂肪间充质干细胞(货号LM-H202，购于上海联迈生物工程有限公司)，并将其按1×10

本申请实施例5提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在实施例2所提供的培养基培养后的上清液。

本申请实施例6提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在实施例3所提供的培养基培养后的上清液。

本申请对比例5提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在对比例1所提供的培养基培养后的上清液。

本申请对比例6提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在对比例2所提供的培养基培养后的上清液。

本申请对比例7提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在对比例3所提供的培养基培养后的上清液。

本申请对比例8提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在对比例4所提供的培养基培养后的上清液。

本申请对比例9提供了一种干细胞分泌物，其为脂肪间充质干细胞在DMEM培养基培养后的上清液。

干细胞分泌物的功效研究

干细胞分泌物抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞过度增殖作用

1、细胞培养：人心肌成纤维细胞HCFB(货号AC339420，购于上海泽叶生物科技有限公司)；将HCFB细胞培养在含H-DMEM培养液的培养瓶中，培养液中含体积分数10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100IU/mL青霉素，置于细胞培养箱培养。

2、MTT法测定心肌成纤维细胞存活率(细胞毒性)

2.1给药分组：设置5个分组，其中1个为对照组，4个为试验组，具体为：

对照组：DMEM培养液；

试验1组：DMEM培养液+0.5v/v％实施例5的干细胞分泌物；

试验2组：DMEM培养液+1.0v/v％实施例5的干细胞分泌物；

试验3组：DMEM培养液+3.0v/v％实施例5的干细胞分泌物；

试验4组：DMEM培养液+5.0v/v％实施例5的干细胞分泌物；

2.2试验方法

将生长对数期的人心肌成纤维细胞HCFB细胞用含体积分数10％胎牛血清的H-DMEM培养基重悬，将细胞按5000个/每孔铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h弃去原培养基，用PBS清洗两遍，更换成无血清DMEM培养液培养过夜，吸弃无血清DMEM培养液，然后加入200ul给药分组的培养液(对照组、试验1-4组的培养液)进行给药培养，每组5个重复；继续培养48h，各加入5mg/ml MTT溶液20ul，培养4h，弃去各孔培养液，都加入150ul DMSO溶液，振荡10min后，用酶标仪测定570nm处吸光度A值，按下面公式求得心肌成纤维细胞存活率，见表1所示：

存活率＝(试验组细胞A值/对照组细胞A值)×100％

表1不同浓度的干细胞分泌物对HCFB存活率的影响

由表1可知，本发明干细胞分泌物在0.5～5v/v％浓度下，对人心肌成纤维细胞HCFB细胞增殖未表现出明显的抑制作用。

3、MTT法检测干细胞分泌物对AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞HCFB增殖能力的抑制作用

3.1给药分组：设置10个分组，其中1个为空白对照组，1个为模型组(AngⅡ组)，8个为试验组，具体为：

空白对照组：DMEM培养液；

AngⅡ组：含0.1uM的AngⅡ的DMEM培养液；

试验组：含0.1uM的AngⅡ的DMEM培养液+1v/v％实施例4-6、对比例5-9相对应的干细胞分泌物；

3.2试验方法

将生长对数期的人心肌成纤维细胞HCFB细胞用含体积分数10％胎牛血清的H-DMEM培养基重悬，将细胞按5000个/每孔铺于96孔板内，每孔200μL。培养24h弃去原培养基，用PBS清洗两遍，更换成无血清DMEM培养液培养过夜，吸弃无血清DMEM培养液，然后加入200ul给药分组的培养液(空白对照组、AngⅡ组和试验组的培养液)进行给药培养，每组5个重复；继续培养48h，各加入5mg/ml MTT溶液20ul，培养4h，弃去各孔培养液，都加入150ulDMSO溶液，振荡10min后，用酶标仪测定570nm处吸光度A值，见表2和图1所示：

表2各组对HCFB增殖的影响

由表2和图1可知，与AngⅡ组相比，实施例4-6组心肌成纤维细胞增殖的OD殖明显降低，说明本发明的干细胞分泌物可显著抑制AngII对HCFB细胞的增殖作用。

4、Elisa检测心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、TGF-β1和CTGF的分泌情况

4.1给药分组：设置10个分组，其中1个为空白对照组，1个为模型组(AngⅡ组)，8个为试验组，具体为：

空白对照组：DMEM培养液；

AngⅡ组：含0.1uM的AngⅡ的DMEM培养液；

试验组：含0.1uM的AngⅡ的DMEM培养液+1v/v％实施例4-6、对比例5-9相对应的干细胞分泌物；

3.2试验方法

将生长对数期的人心肌成纤维细胞HCFB细胞用含体积分数10％胎牛血清的H-DMEM培养基重悬，将细胞按1×10

Elisa方法具体操作如下：

(1)包被：用0.05M pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将一抗ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和CTGF适当稀释(例如，稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，优选2ug/ml)。在96孔酶标板的反应孔中每孔加100ul相应一抗稀释液，每种一抗稀释液每个组别设5个复孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗3次，每次3min。

(2)封闭：1％BSA 37℃封闭1小时，弃去孔内溶液，用PBST洗3次，每次3min。

(3)加样：加相应组别的细胞培养上清液100ul于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，弃去孔内溶液，用PBST洗3次，每次3min。

(4)二抗孵育：每孔中加100ul 4000稀释的二抗，37℃孵育1h，用PBST洗5次，每次3min。

(5)显色：每孔中加100ul TMB显色液，避光显色3～5min。

(6)终止：当孔中液体泛黄时，加50ul 2M H

(7)波长450nm测定吸光度值，吸光度值见表3、图2和图3所示。

表3各组对HCFB分泌ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和CTGF情况的影响

由表3、图2和图3可知，与空白对照组相比，AngⅡ组心肌成纤维细胞上清液中ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和CTGF的含量明显增加，差异有统计学意义；与AngⅡ组和对比例5-9相比，实施例4-6组心肌成纤维细胞上清液中ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1和CTGF的含量均明显减少，差异有统计学意义。说明中药组合物(黄芪、香橼、佛手)经益生菌剂发酵得到的发酵物能促进了干细胞中某些活性细胞因子的产生或分泌，这些活性细胞因子能够能显著抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖，预示有可能开发成防治心肌纤维化的创新药物。且黄芪、香橼、佛手与嗜酸乳杆菌协同作用，缺一不可，只有黄芪、香橼、佛手经嗜酸乳杆菌发酵所得发酵物才能促进活性细胞因子的产生，从而抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖。

综上，本申请干细胞分泌物减少心肌成纤维细胞上清液中Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的含量，减少心肌成纤维细胞上清中CTGF和TGF-β1的含量，说明干细胞分泌物能抑制由AngⅡ诱导心肌成纤维细胞过度增殖，预示有可能开发成防治心肌纤维化的创新药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。