一种止血材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用材料及其制备方法，特别涉及一种医用止血材料及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

出血是交通事故、外科手术、战争和自然灾害等常见的典型事件。大量出血很容易导致失血过多和死亡，据统计，全世界超过30％的外伤性死亡可归因于大出血。传统上，纱布和绷带是快速控制出血的主要止血材料，为了提高传统纱布的的止血效果，许多具有凝血功能的物质如凝血酶、鱼精蛋白、酚磺乙胺、氨基己酸、氨甲环酸、氨甲苯酸等被用于提高传统纱布的止血效果。目前，市面上已经有Combat纱布、HemCon绷带、Surgicel等产品，尽管这些产品对浅表损伤具有显著的止血能力，但实验结果表明，大多数产品无法处理严重出血病例，特别是不规则、不可控、不可压缩的外伤性出血。因此，研发适用于大出血的止血材料是至关重要的。

止血材料是通过化学修饰活性成分或将其加工成某种形式而获得的。然而，开发使活性成分具有更有用的伤口愈合特性而不影响其止血行为的方法仍然是一个挑战。迄今为止，通过化学修饰活性成分或将其加工成某种形式而开发出了许多新型的止血材料，从简单到复杂，从2D到3D，从亲水性到疏水性，从宏观到纳米尺寸。止血材料的形态影响其功能和应用，最广泛使用的止血材料形式是海绵、水凝胶、纳米纤维和颗粒或粉末。相比之下，海绵材料因其形状恢复性能和吸液能力而更具吸引力，这可能为应对一些异常伤口提供优势。它们可以在压缩状态下以海绵形式注射，使其迅速膨胀并完全接触不规则出血伤口。例如，Zhang等人开发了一种基于纳米纤维素的可注射止血海绵，具有吸水率高、形状恢复快、抗菌能力强等特点。Guo等人采用聚乙烯醇、羧甲基壳聚糖和多巴胺制备了一种具有高力学性能和优异形状记忆能力的混合型止血海绵，以应对致死性不可压缩出血。目前，吸收性明胶海绵是临床上使用最普遍的止血材料，属于无毒无抗原性蛋白胶类物质，具有多孔结构，可以吸收本身体体积30倍以上的液体和血液。同时，由于明胶海绵内含正电子附着物，有利于吸附血小板在局部形成小血栓，从而起到止血作用。然而，临床使用吸收性明胶海绵还存在止血效率低、生物相容性差或力学性能弱等问题。

紫胶是紫胶虫分泌的天然树脂，其分子结构中含有长链的羟基脂肪酸和倍半萜烯酸，因而具有良好的成膜、组织粘附、生物相容性等。

本发明以漂白紫胶紫胶和明胶为原料，制备具有海绵状多功能止血材料；还与多酚化合物没食子酸丙酯复合，可进一步提高材料的血液吸附、止血和抗菌性能。

发明内容

本发明的目的是针对现有临床使用的止血海绵存在吸收性不高，止血效率低，生物相容性差、力学性能弱等技术问题，提供一种止血材料及其制备方法，本发明的止血材料对流体吸收率高，止血时间短，失血量显著降低；吸水率和吸水速率高，且吸水后可快速膨胀，迅速堵住伤口；在创口处快速吸液，加速血小板和红细胞的聚集，快速止血；本发明的止血材料的生物相容性、抗菌性能和凝血性能好，在伤口凝血止血、组织修复等生物医学应用方面具有应用前景。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种止血材料，包括明胶和紫胶。

其中，所述明胶与紫胶的重量份配比为(0.05-1)：1)，优选为(0.2-0.3):1，进一步优选为0.2:1。

特别是，还包括止血增强剂，所述止血增强剂选择没食子酸或没食子酸衍生物。

特别是，所述没食子酸衍生物选择没食子酸丙酯、没食子酸、五倍子单宁酸、没食子酸甲酯、没食子酸月桂酯、没食子酸十六烷基酯、没食子酸十八烷基酯、没食子酸二十八烷基酯，优选为没食子酸丙酯、五倍子丹宁酸。

特别是，所述止血增强剂与紫胶的重量份配比为(0.02-0.1):1，优选为0.04:1。

特别是，止血增强剂没食子酸丙酯与紫胶的重量份配比为(0.02-0.1):1，优选为0.04:1。

本发明另一方面提供一种止血材料的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)向紫胶溶液中加入明胶，加热，搅拌溶解，配制成紫胶-明胶溶液；

2)将紫胶-明胶溶液进行冷冻干燥处理，制得止血材料。

特别是，步骤1)中所述紫胶溶液的体积与明胶的质量之比为10：(0.05-1)，优选为10:(0.2-0.3)，进一步优选为10:0.2。

特别是，步骤1)中的紫胶-明胶溶液中明胶与紫胶的重量份配比为(0.05-1)：1，优选为(0.2-0.3):1，进一步优选为0.2:1。

特别是，所述紫胶溶液为紫胶氨水溶液，按照如下方法配制而成：将漂白紫胶加入到氨水溶液中，加热，搅拌溶解而成。

特别是，所述氨水溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5％，优选为0.2％。

特别是，所述紫胶溶液的质量体积浓度为0.05-0.2g/mL，即每1mL氨水溶于中溶解紫胶0.05-0.2g，优选为0.1g/mL。

特别是，加热温度为40-60℃，优选为50℃。

其中，步骤2)中冷冻干燥处理过程中，控制温度为-50～-10℃，优选为-40℃；相对压力为20～70Pa，优选为40Pa；冷冻干燥时间60～80h，优选为72h。

本发明又一方面提供一种止血材料的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)向紫胶溶液中加入明胶，加热，搅拌溶解，配制成紫胶-明胶溶液；

2)向紫胶-明胶溶液中加入止血增强剂，搅拌、混合均匀，配制成紫胶-明胶-增强剂混合体系，其中所述止血增强剂选择没食子酸或没食子酸衍生物；

3)将紫胶-明胶-增强剂混合体系进行冷冻干燥处理，制得止血材料。

其中，步骤2)中所述的止血增强剂的添加量为每10mL紫胶-明胶溶液中加入20-100mg的止血增强剂，优选为每10mL紫胶-明胶溶液中加入40mg止血增强剂。

特别是，特别是，所述止血增强剂选择没食子酸丙酯、没食子酸、五倍子单宁酸、没食子酸甲酯、没食子酸月桂酯、没食子酸十六烷基酯、没食子酸十八烷基酯、没食子酸二十八烷基酯，优选为没食子酸丙酯、五倍子单宁酸。

特别是，所述止血增强剂没食子酸丙酯的添加量为每10mL紫胶-明胶溶液中加入20-100mg的没食子酸丙酯，优选为每10mL紫胶-明胶溶液中加入40mg没食子酸丙酯。

特别是，步骤2)中加入的止血增强剂与紫胶的重量份配比为(0.02-0.1):1，优选为0.04:1。

特别是，止血增强剂没食子酸丙酯与紫胶的重量份配比为(0.02-0.1):1，优选为0.04:1。

特别是，步骤3)中冷冻干燥处理过程中，控制温度为-50～-10℃，优选为-40℃；相对压力为20～70Pa，优选为40Pa；冷冻干燥时间60～80h，优选为72h。

本发明以漂白紫胶紫胶和明胶为原料，通过二者的交联反应制备具有海绵状多功能止血材料，再与多酚化合物没食子酸丙酯复合，以提高材料的血液吸附、止血和抗菌性能。

本发明创制的止血海绵的具有较高的流体吸收率、优异的形状记忆性能和较强的机械弹性；在生物学性能方面，该海绵的全血凝血指数更低，血细胞和血小板的聚集能力更强；大鼠股动脉损伤模型和肝容量缺损损伤模型实验表明，海绵的止血时间显著少于已有商品明胶海绵；此外，该海绵对金色葡萄球菌和大肠杆菌表现出较好的抑菌效果，其生物相容性和血液相容性良好。综合评价，紫胶-明胶复合海绵状多功能止血材料在大出血病例中有巨大应用潜力，可满足日常生活及医疗中的出血应急处理。

与现有技术相比，本发明具有如下有点和好处：

1、本发明的止血材料止血海棉具有较丰富的孔洞结构，有利于流体的快速进入和吸收，从而促使血液浓缩和快速形成血栓。

2、本发明止血海绵可以很容易地定制成各种形状，以适应不同的伤口；在较大压力下反复压缩20次，仍表现出优异的形状记忆功能和机械性能，因而在狭窄、不规则和不可压缩的伤口应用方面具有极大潜力。

3、本发明止血海绵具有极好的亲疏水性协同作用，可以在极短的时间内吸收自身重量10倍左右的液体。

4、本发明止血海绵具有较好的凝血能力，可很好地粘附红细胞和血小板；溶血率低于3.5％，符合止血海绵的应用安全标准；体内和体外测试表明，该海绵生物相容性良好。

5、本发明止血海绵对股动脉损伤大出血模型具有良好的止血效果，止血速率好于现有商品明胶海绵，且该海绵也可用于体内脏器如肝脏等止血方面。

附图说明

图1为止血海绵的为红外光谱图；

图2为止血海绵的XRD图；

图3为止血海绵的SEM图；

图4A为止血海绵样品的密度测试结果图；

图4B为海绵样品的孔隙率统计图；

图5为SNPG海绵、明胶的压缩性形变测试结果图；

图6A为海绵吸收液体后的体积膨胀率测试图；

图6B为实施例3制备的SNPG0.2海绵制成不同形状的海绵照片；

图7A为海绵吸收液体再挤压后的体积恢复率测试图；

图7B为实施例3制备的SNPG0.2海绵的压缩循环图；

图7C为实施例7制备的SNPG0.6海绵的压缩循环图；

图8A为海绵样品的吸水率测试结果；

图8B为海绵样品吸收血液的吸收率测试结果；

图9为止血海绵表面上液滴完全吸收所需时间测试图；

图10A为止血海绵的BCI统计图；

图10B为止血海绵的凝血时间统计图(其中：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)；

图11为止血海绵对红细胞粘附率统计图；

图12为海绵样品的红细胞的粘附情况，其中A为纱布样品；B为SN样品；C为PG样品；B为SNPG0.2样品；D为商品明胶海绵；

图13为止血海绵样品的血小板粘附率统计图；

图14A为止血海绵样品溶血率统计结果图；

图14B为止血海绵样品溶血照片；其中a为阳性对照、b为SNG、c为SNPG0.1、d为SNPG0.2、e为SNPG0.3、f为SNPG0.4、g为SNPG0.5、h为PG、i为纱布、j为商品明胶海绵、k为阴性对照；

图15为不同海绵样品作用于NIH-3T3细胞的存活率；

图16为海绵样品植入7天后伤口组织的染色切片图；

图16A为海绵样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用照片图；

图16B为海绵样品的抑菌率统计图；

图17A为止血海绵治疗股骨穿刺伤出血过程中出血量的统计图(n≥3)(其中：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)；

图17B为止血海绵治疗股骨穿刺伤出血过程中止血时间(n≥3)的统计图(其中：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、配制紫胶溶液

将漂白紫胶加入到氨水溶液中，水浴加热，搅拌溶解，配制成紫胶氨水溶液(简称SN溶液)，其中，氨水溶液的质量百分比浓度为0.2％(通常为0.1-0.5％)；紫胶氨水溶液的质量体积浓度为0.1g/mL(通常为0.05-0.2g/ml)，即每1mL氨水溶液中漂白紫胶0.1g；水浴加热温度为50℃(通常为45-60℃)；

取50.0g漂白紫胶加入至500mL质量分数为0.2％的氨水溶液中在50℃水浴条件下溶解1.5h制得浓度为0.1g.mL

2、配制紫胶-明胶混合液

向配制的紫胶氨水溶液(SN溶液)中加入明胶，加热、搅拌处理，溶解，配制成紫胶-明胶混合液；其中，明胶的质量与紫胶氨水溶液的体积之比为0.05：10(通常为((0.05-1)：10)，紫胶氨水溶液体积与明胶的质量之比为10：0.05，即每10mL紫胶氨水溶液中加入0.05g明胶；紫胶-明胶混合液中明胶与紫胶的重量之比为0.05:1(通常为(0.05-1)：1)，优选为(0.2-0.3)：1，进一步优选为0.2：1；

分别量取10mL的SN溶液，向其中加入不同质量的明胶，在50℃的条件下搅拌反应2h，每10mL的SN溶液中分别加入0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g的明胶。

3、配制紫胶-明胶-增强剂混合体系

向紫胶-明胶混合液中加入止血增强剂没食子酸丙酯(简称PG)，搅拌、混合均匀，配制成紫胶-明胶-增强剂混合体系(简称SNPG混合体系)，其中，止血增强剂没食子酸丙酯的添加量为每10mL紫胶-明胶混合液中加入40mg没食子酸丙酯(通常为每10mL紫胶-明胶混合液中加入40-100mg没食子酸丙酯，优选为40mg)；紫胶-明胶-没食子酸混合体系中紫胶与没食子酸丙酯的重量之比为1:0.04(通常为1:(0.02-0.1，优选为1：0.04)。

本发明中加入没食子酸丙酯化的目的是增强紫胶-明胶海绵的止血、凝血能力，同时增强海绵的抗菌能力并促进伤口愈合。没食子酸丙酯加入后通过氢键作用连接在紫胶-明胶网络中，形成网格、孔洞结构。

止血增强剂除了没食子酸丙酯之外，其他没食子酸、五倍子单宁酸、没食子酸甲酯、没食子酸月桂酯、没食子酸十六烷基酯、没食子酸十八烷基酯、没食子酸二十八烷基酯均适用于本发明。本发明的具体实施方式部分以没食子酸丙酯为例进行说明。

4、冷冻干燥处理

将配制的紫胶-明胶-没食子酸混合体系进行冷冻干燥处理，制得止血海绵(简称SNPG0.05海绵)，其中，冷冻干燥过程中，控制温度-40℃、压力40Pa、时间72h。

分别取配制成紫胶-明胶-增强剂混合体系3.0mL，分别置于内径20mm,高20mm的圆柱形的磨具中，将模具置于冷冻干燥机内，进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥处理的控制工艺条件如下：冷冻干燥温度为-40℃；相对压力为40Pa；冷冻干燥时间为72h。

本发明制备止血海绵的冷冻干燥处理过程中，控制温度为-50～-10℃，优选为-40℃；相对压力为20～70Pa，优选为40Pa；冷冻干燥时间60～80h，优选为72h。

实施例2-7

除了步骤2)中紫胶-明胶混合液的质量体积之比分别为0.10：10，0.20：10，0.30：10，0.40：10，0.50：10，0.60：10；步骤3)配制的紫胶-明胶-没食子酸混合体系分别简称为SNPG0.1、SNPG0.2、SNPG0.3、SNPG0.5、SNPG0.6；步骤4)制得止血海绵分别简称为简称SNPG0.1、SNPG0.2、SNPG0.3、SNPG0.5、SNPG0.6海绵之外，其余与实施例1相同。

对照例1

除了步骤2)中紫胶-明胶混合液的质量体积之比为0.2：10；不向紫胶-明胶混合液中加入没食子酸丙酯，即不进行步骤3)之外，其余与实施例1相同，没有添加PG的样品组记为SNG海绵。

对照例1A-1E

除了步骤2)中紫胶-明胶混合液的质量体积之比分别为0.10：10，0.30：10，0.40：10，0.50：10，0.60：10；不向紫胶-明胶混合液中加入没食子酸丙酯，即不进行步骤3)之外，其余与实施例1相同，没有添加PG的样品组记为SNG海绵。

对照例2

将实施例1的步骤1)配制的紫胶氨水溶液(SN溶液)，采用如实施例1步骤4)中相同的冷冻干燥工艺进行冷冻干燥处理，制得海绵(简称SN海绵样品)。

试验例1止血海绵样品的结构表征

1、红外光谱图

将实施例3制备的SNPG0.2海绵、对照例1制备的SNG海绵、对照例2制备的SN固体样品、明胶、没食子酸丙酯、紫胶进行红外光谱检测，红外光谱图如图1所示。

与紫胶相比，SN固体样品在1558cm

明胶分子中含有大量的羧基和氨基，当其和少量没食子酸丙酯加入至紫胶氨水溶液中加热反应2h，生成的SNPG海绵样品中在1654cm

2、X射线衍射

对实施例2-4制备的止血海绵、SN固体样品、实施例1-7中使用的明胶采用X射线衍射仪进行X射线衍射，测试样品的晶体信息，测定结果如图2。

如图2，测试的三个海绵样品(即SNPG0.1、0.2、0.3海绵样品)的衍射峰基本重叠，均在19.8°左右出现一个宽的无晶峰。与SN相比，SNPG的峰宽变窄，说明它们的聚集形态更趋向于有规则的排序结构。

3、电镜扫描

将SN固体样品、实施例2-7制备的止血海绵、明胶采用电子显微镜(SEM)观察其形貌，观察结果如图3所示。从表观上看，SN样品疏松，轻轻触碰就会散落；扫描图显示：

SN样品呈鳞片堆积成一条条连续的沟脊，没有明显的孔洞结构。当在SN样品中加入明胶后，所有的SNG海绵均具有孔洞结构，其中SNPG0.1中明胶添加量较少，虽然有孔洞结构，但是其孔洞结构分布不均，易在外力的作用下发生塌陷变形；SNPG0.2和SNPG0.3海绵呈现出相互连接的大孔结构，孔的尺寸范围为212.5～425.3μm。随后，随着明胶添加量的增加，SNPG海绵的SNPG0.4和SNPG0.5海绵单位体积内的孔洞数量增多，但是平均孔径逐渐变小；继续增加明胶添加量，海绵变得密实，只见可数的孔洞结构。这可能是由于明胶添加量的增加，紫胶与明胶交联反应的程度更大。作为对照，商品明胶海绵显示出丰富的相互交织的孔洞结构。

试验例2止血海绵样品密度测试

1.2海绵样品的密度测试

在圆筒形模具中分别各自注入3mL实施例1-7步骤3)配制的SNPG样品(即紫胶-明胶-没食子酸丙酯混合体系)，实施例1步骤1)配制的SN溶液；接着经冷冻干燥制得海绵测试样品。分别准确称取和量取海绵测试样品的质量(m

密度测试结果如图4A所示，由图可知：随着SNPG中明胶添加量增加，所制得海绵的密度也逐渐增加。

试验例3止血海绵样品孔隙率测试

将实施例1-7制备的止血海绵预先称重，并分别记录止血海绵浸水之前的重量(W

公式(2)中：W

样品制备过程中，采用了内径20mm，高20mm的圆型磨具，所以制备出的样品为圆柱态，用游标卡尺量取吸水后的直径R和高度H，得到海绵样品吸水后的体积V。

止血海绵孔隙率测定结果如图4B，图4B显示SNPG海绵的孔隙率变化趋势与密度相反，其孔隙率随着明胶添加量的增加而逐渐减小。海绵的多孔结构有利于流体的快速进入和吸收，同时，合适的孔洞结构大小有利于血液中的成分在孔洞结构中堆积产生血栓结构，从而促进血液的凝固。一方面，当止血海绵的表面孔洞结构均为闭合的时候，不利于血液中的血细胞进入。另一方面，当止血海绵的孔洞结构直径过大，需要更多的血细胞才能形成微血栓的结构，不利于整体血栓形成的效率。最终，只有当复合海绵同时拥有互相连通的表面孔洞结构以及合适大小的孔洞的吋候，止血海绵对血液的浓缩和形成血栓结构的效率才能达到最佳的状态，从而达到快速止血的目的。因此，结合SEM的结果以及孔隙率分析，SNPG0.2和SNPG0.3海绵拥有最佳的孔洞结构。

试验例3A止血海绵的机械性能(压缩性形变)测试

使用TMS-Pro物性分析仪(美国FTC有限公司)对实施例1-6制备的止血海绵以及购买的海绵(spirit可吸收性明胶海绵创口护理海绵医用牙科口腔材料手术急救伤口出血凝胶膨胀海绵贴，B型：20mm*20mm)进行压缩测试。

测试前，准确记录每个海绵样品的直径和高度，然后将海绵样品在去离子水中浸泡30min使其充分吸水。测试时，将海绵水平放置在测试台上，设置压缩速率为10.0mm/min，分别记录样品在形变率分别为40％、50％和70％时所需的压力、强度及其样品形态。每组样品重复测试5次。测定结果如图5。

如图5，在三个不同形变率的条件下，SNPG海绵的压缩应力都是随着明胶含量增加而逐渐增加，这是因为明胶越多，紫胶与明胶的交联程度越大，所形成的聚合物分量越大，且密度更大，因此所需应力越大。同时，测试结果显示，在形变率为40％和50％的条件下，所测试的所有SNPG海绵在测试结束都能保持形态完好；但是当形变率为70％的条件下，除了SNPG0.2和SNPG0.3两组样品，其它SNPG海绵的形态都发生了较大改变，其中明胶添加量较少的SNPG0.05样品部分溶解，SNPG0.1的海绵塌陷为无定型状态，而明胶添加量较多的SNPG0.4，SNPG0.5和SNPG0.6在压力之下均出现了开裂的现象，而且明胶含量越多，裂口越多。

试验例3B止血海绵的水触发形状记忆能力测试

具有形状记忆特性的海绵在止血方面具有特殊的优势，比如用于狭窄、不规则和不可压缩的伤口。为了评估SNPG海绵的水触发形状记忆能力，测量海绵的体积膨胀率，方法如下：

体积膨胀率测试方法：用游标卡尺测量海绵样品的原始直径R和原始高度h，按照圆柱体体积公式计算海绵原始体积为V

为了说明该海绵样品可以制备成为各种形态，可以应对身体的不规则创伤。将本发明实施例3的制备的海绵样品剪切成各种形态，并吸水，吸水后的海绵样品的形状如图6B。

由图6A可知：SNPG海绵吸收液体后表现出一定的体积膨胀，其体积膨胀率随着明胶添加量的增加而减小，其中，SNPG0.05至SNPG0.2.海绵的体积膨胀率没有明显差异，而SNPG0.3的体积膨胀率26.1％显著小于SNPG0.2海绵的44.4％，这可能是因为随着明胶量增加海绵的孔洞结构减少。良好的体积膨胀能够使止血海绵充分吸收血液中的液体成分，使得局部血细胞以及血小板的浓度上升，从而有利于血栓结构的形成。另外一方面，止血海绵吸收液体之后的体积膨胀有利于在局部形成压迫的效应，从而达到进一步的止血的目的。此外，SNPG0.2也可以很容易地定制成各种形状，以适应不同的伤口(图6B)，这些海绵吸收液体后的体积膨胀率维持在40.2～56.3％之间。

试验例3C止血海绵的吸液挤压后体积恢复率性能测试

体积恢复率：将将实施例1-7制备的海绵样品分别浸泡于去离子水中30min，用游标卡尺测量海绵样品的吸水后直径R

如图7A所示，除了SNPG0.5因部分溶解而不能恢复到原来状态，其它海绵的体积恢复率均在92％以上。

试验例3D止血海绵的循环压缩性能测试

利用TMS-Pro物性分析仪(美国FTC有限公司)考察海绵的压缩形变-恢复能力，即循环压缩性能。

将实施例3制备的存放6个月后的SNPG0.2海绵、和实施例7制备的SNPG0.6海绵于去离子水中浸泡30min使其充分吸水后，使用物性分析仪进行循环压缩测试。实验过程中，在每一次压缩完成下一次压缩开始之前，使海绵样品充分吸水。每次准确记录样品的直径和高度用于计算。测试时，将样品水平放置在测试台上，设置压缩速率为10.0mm/min，形变率为50％，循环次数20次。测试结果如图7B、7C。

由图7B、7C可知，SNPG0.2海绵储存6个月后，即使反复压缩20次，仍表现出优异的形状记忆功能，而明胶添加量较多的SNPG0.6海绵随着压缩次数增加，其应变不断降低(如图7C)。因此，综合分析，SNPG0.2在所有海绵中机械性能最优。

试验例4止血海绵样品液体吸收性能测试

参照中华人民共和国医药行业标准YY/T 0471.1-2004《接触性创面敷料试验方法第1部分_液体吸收性》进行海绵样品的液体吸收性能测试。

实施例1-6制备的止血海绵、对照例1、2制备的样品分别预先切割一定体积的海绵小试样，并分别称量其重量(记为W

测试结果如图8A、8B。未添加明胶的SN在水和血液中几乎完全溶解，没有吸收液体的能力。如图8A，在SN中添加明胶后所制SNPG海绵均有吸水性，其中SNPG0.05有少许固体溶解，其在室温下的吸水率为961.9％；SNPG0.1的吸水率在所制海绵中最高，为1247.9％；之后，随着SNPG中明胶添加量的增加，海绵的吸水率逐渐减小。与吸水率的变化规律一致，如图8B，SNPG海绵的血液吸收能力也表现出随着明胶添加量的增加，血液吸收率先增加后减小，其中SNPG0.1的血液吸收率为979.4％。同时，温度对吸收性能的测试结果表明，在正常体温37℃的条件下，SNPG海绵样品的吸水率和盐溶液吸收率整体高于室温条件，这可能是因为温度升高使得海绵的孔隙变大因而液体吸收能力增强。

试验例4A止血海绵样品液体吸收的速度性能测试

采用接触角仪的座滴法功能测试记录了去离子水液滴被实施例1-6制备的海绵材料吸收所需的时间。测试结果如图9。

如图9所示，液滴在SNPG0.05,SNPG0.1和SNPG0.2海绵表面的扩散吸收时间均在1秒以内，本发明的止血海绵吸收液体血液迅速，能快速吸收；随着海绵中明胶添加量的增加，液滴完全扩散和被吸收所需的时间逐渐延长，SNPG0.5海绵表面的液滴完全扩散并完全吸收所需时间为27s。

作为对照，商品明胶海绵的水接触角为141.05°，表现出显著的疏水性，在不对商品明胶海绵进行按压的情况下，液滴在其表面完全扩散吸收所需时间大于5min。该实验结果表明，本发明制备的SNPG海绵具有合适的亲疏水性能，可以在极短的时间内吸收大量的血液，加上其优异的液体触发形状记忆能力，在创伤或手术引起的大出血方面具有较大的应用潜力。试验例5止血海绵样品体外凝血试验

采用血凝指数(BCI)评价SNPG海绵的体外凝血性能。

首先分别称量实施例2-6制备的止血海绵样品各50.0mg，分别置于玻璃培养皿中；同时设置同等重量的医用纱布、商品明胶海绵、对照例1制备的SNG海绵作为对照。准确量取9.0mL的柠檬酸大鼠全血，向其中加入1.0mL浓度为0.2mol/L的CaCl

分别取900uL柠檬酸大鼠血液加入100uL的0.2M CaCl

如图10A，所有SNPG海绵均有凝血效果，其中SNPG0.2的凝血指数值最低，为10.5％，该值仅是SNG海绵的一半；如图10B，SNPG0.2海绵也是所有测试样品中凝血速率最快的，其凝血时间仅为45s左右，而SNG海绵的凝血时间为70s。作为对照，纱布和商品明胶海绵组的BCI值均大于85％以上，凝血时间分别为324s和270s，说明它们的凝血效果较差。以上结果表明，适量加入PG有助于提高SNPG海绵的凝血效果

试验例6止血海绵的红细胞体外粘附测试

将新鲜大鼠血在1000rpm下离心10min，移去血浆。将实施例3制备的止血海绵(SNPG0.2)切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm的大小，取50μL红细胞悬浮液滴于海绵表面，在37℃的条件下培养10min后用PBS冲洗去除去非粘附红细胞。然后，将所有粘附红细胞的样品转移至1.0mL去离子水中，在37℃的条件下溶解粘附红细胞1h，测试所得溶液在540nm处的吸光度。

除了使用止血海绵(SNPG0.2)之外，还使用纱布、商品明胶海绵、对照例1制备的SNG样品、对照例2制备的SN样品、没食子酸丙酯(PG)，进行红细胞粘附试验。

空白对照组(又称参照组)为未加海绵样品红细胞悬浮液，测试吸光度，每组样品测试三次。红细胞的粘附率(％)按照公式(5)计算：红细胞粘附率测试结果如图11。

同时，将粘附红细胞的海绵用2.5％戊二醛固定24h，然后用一系列分级乙醇溶液50％，70％，80％，90％，100％脱水20min，用扫描电镜对海绵进行观察，观察结果如图12。

红细胞粘附测试结果如图11。纱布、商品明胶海绵的红细胞粘附率分别为19.1％和7.5％，显著低于SNPG海绵。没有加入明胶和没食子酸丙酯的SN样品也显示出54.9％的红细胞粘附率，这可能是得益于SN带有铵盐形式的正电荷与红细胞之间的静电相互作用。没食子酸丙酯PG的红细胞粘附率为55.2％，与对照例2的SN的粘附率相当，这可能是因为其分子结构中的酚羟基与蛋白质发生了化学反应。但是，SNG和SNPG0.2的红细胞粘附率分别为86.8％和90.9％，显著高于其它组，但是二者之间没有明显的差别，说明紫胶和明胶的交联反应及形成的网络结构极大促进了红细胞的快速粘附和浓缩血细胞。

通过扫描电镜进一步观察止血材料吸附红细胞的情况，结果如图12所示。纱布上只有少许红细胞分布在其长条纤维(图A)；SNPG0.2的吸收血液后依然保留了原有得连续孔洞结构，许多红细胞粘附并不规则地聚集在这些孔洞中，可观察到大多数细胞保持圆球形态(图B)；作为对照，没食子酸丙酯粉末也有较好的红细胞粘附作用，红细胞聚集在其粉末的表面与间隙(图C)，但是商品明胶海绵上吸附的红细胞很少(图D)。

试验例7止血海绵的血小板粘附测试

将新鲜取得的大鼠血在1000rpm下离心10min，采集富血小板血浆(PRP)，进行血小板粘附试验。

将实施例3制备的止血海绵(SNPG0.2)切割成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小；再将50μL的PRP血浆分别滴入每个海绵样品，在37℃条件下孵育30min，然后用PBS冲洗样本以去除非粘附血小板。然后用1.0mL 1.0％ Triton X-100溶液，在37℃下溶解粘附的血小板1h，随后用LDH Kit(试剂盒)检测血小板乳酸脱氢酶活性，按试剂盒说明书进行测定。

除了使用止血海绵(SNPG0.2)之外，还使用纱布、商品明胶海绵、对照例1制备的SNG样品、对照例2制备的SN样品、没食子酸丙酯(PG)，进行血小板粘附试验。

以不接触样品的50μL血浆作为参照组(又称空白对照组)，在450nm处用酶标仪读取吸光度。按照公式(6)计算血小板附着率，测试结果如图13。

血小板粘附测试结果如图13：总体来看，所测试的样品对血小板的粘附能力与红细胞的粘附规律基本一致，其中SNG和SNPG0.2的血小板粘附率高达87.6％和90.8％，显著高于其它组，作为对照的纱布和商品明胶海绵的粘附率仅有18.3％和20.2％。

试验例8止血海绵样品体外溶血测试

采集大鼠血于含有柠檬酸钠抗凝剂的试管中，充分摇匀后取出1.0mL原生血液用5.0mL生理盐水稀释，得到的血液样品，备用。分别称量实施例2-6制备的止血海绵各1.0mg，分别与1.0mL生理盐水于37℃孵育12h，制得海绵样品悬液，过滤，留取滤液。向滤液中分别加入100μL稀释后的血液于37℃孵育1h，然后以3000rpm的转速离心10min，拍摄照片。收集上层清液，测定各液体在波长540nm处的吸光度。

以对照例1制备的SNG样品、没食子酸丙酯粉末、纱布、商品明胶海绵样品作为对照，进行溶血试验。

以不加海绵样品的纯水和生理盐水分别作为阳性和阴性对照，溶血率(％)按公式(7)计算：

测试结果如图14A、14B，按照国标要求，作为一种止血材料的溶血率安全标准应小于5％。通过溶血实验考察了止血海绵的血液相容性。如图14B，血液在纯水中(阳性对照组)几乎所有红细胞都破裂释放血红蛋白，溶液呈鲜红色；而SNPG组海绵及其它对照组显示均有血液凝集，上层清液颜色较浅甚至为无色。通过测定溶血率(图14A)，样品的溶血率均低于3.5％，符合止血海绵的应用安全标准。从图14A可以看出，添加了没食子酸丙酯的SNPG0.1～0.5海绵的溶血率低于未添加没食子酸丙酯的SNG，说明海绵中加入没食子酸丙酯可以降低其溶血率。

试验例9止血海绵的体外细胞相容性测试

细胞扩大培养：将冻存液氮罐的NIH-3T3细胞(购至广州华拓生物)于37℃水浴中快速解冻，完全融化后，及时在细胞中加入含10％FBS+1％Ps的DMEM培养液，重悬细胞。在已消毒的超净台内将融化的细胞液用吸管转移到15mL离心管中，于离心机上1000rpm离心5min，弃去上清，加入1.0mL培养基重悬细胞，并将其移入细胞培养瓶中，补足培养液至6.0mL，在5％CO

CCK8法检测材料对NIH-3T3细胞增殖活性影响

将处于对数生长期的上述各细胞以1×10

其中：As:实验组吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)；Ac:对照组吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；Ab:空白组吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。

为了考察海绵的生物相容性，测试了海绵提取液对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)的毒理性。CCK-8检测结果表明在不同样品浓度孵育24h后，不同浓度下SNG和SNPG0.2细胞的存活率都超过80％，说明海绵样品是非细胞毒性的，如图15。

试验例10止血海绵的体内生物相容性测试

实验前，将实施例3制备的海绵样品、对照例1制备的海绵样品、商品明胶海绵、没食子酸丙酯(PG)粉末制成相同形状和大小(直径10mm，高度5mm)的试样，分别在紫外线照射下消毒3h。

将15只雄性SD大鼠随机分成5组，空白组、PG样品组、商品明胶海绵组、海绵SNG组和海绵SNPG组，每组各3只。所有大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(1.2mL/250g)麻醉。随后，在每只大鼠的背部区域创建一个小切口。将制备好的各样品植入切口，然后闭合皮肤。将无样本切口作为空白组。7d后处死大鼠，并切取测试样本及邻近组织。获得的材料-组织样本石蜡包埋，切片并贴附在载玻片上。采用苏木精-伊红染色检测急性炎症反应和慢性炎症反应。染色切片在显微镜下观察和分析。海绵样品植入7天后伤口组织的染色切片图，如图16。

由图16可知：将制备好的海绵样品植入大鼠背部切口，然后闭合皮肤。样品植入7天后，空白组、SNG、SNPG0.2和PG组的大鼠伤口组织几乎都没有炎症反应，组织中有大量的新生血管，表明SNG、SNPG海绵体内相容性良好，作为生物相容性止血剂有在体内应用的潜力。作为对照，商品明胶海绵植入的大鼠组织中有较多的炎症细胞。

试验例11止血海绵的抑菌性能测试

良好的抑菌性可以预防伤口感染，考察海绵对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用。

分离出金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC-25922)，并分别制成10

试验例12止血海绵的体内止血性能测试

采用大鼠股动脉损伤作为大出血模型来评价纱布、SNG、SNPG0.2和商品明胶海绵在体内的止血性能。

采用SD雄性大鼠建立股动脉损伤模型评价海绵的止血性能。实验前，所有雄性大鼠腹腔均以10％水合氯醛溶液(1.2mL/250g)注射麻醉，固定于手术软木板上。股动脉损伤时，刮去大鼠腿毛，切开腹股沟肌，露出股动脉。用20G针在股动脉上穿刺，伤口暴露5s，以确保正常出血。随后立即将尺寸为直径10mm，高度5mm的止血样品敷在出血部位，并用医用纱布手动按压伤口止血，其中止血样品为(纱布、对照例1、实施例3制备的海绵样品、商品明胶海绵。记录止血时间，直至取出海绵后伤口不再出血，测试结果如图17A、17B。

如图17A，与纱布和商品明胶海绵相比，SNG和SNPG0.2立即控制了强出血，它们治疗的大鼠出血量平均分别为345.7mg和251.6mg；NPG0.2治疗组的出血量明显少于SNG组(p＜0.05)；且SNG和SNPG0.2都显著低于纱布和商品明胶海绵组801.0mg和652.7mg(p＜0.001)。

如图17B，从止血时间来看，SNG和SNPG0.2所需止血时间也都显著少于其他两组。值得注意的是，添加了没食子酸丙酯的SNPG0.2的止血时间为107s，而SNG的止血时间为183s，二者之间存在一定的差异性(p＜0.01)；SNPG0.2治疗组的出血量也显著少于SNG组。

该实验结果表明，SNPG0.2海绵对股动脉损伤大出血模型具有良好的止血效果，甚至比市场上的明胶海绵有明显的优势，因此在日常受伤、外科急救等领域有巨大的应用潜力。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。