野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4及其编码基因和应用。

背景技术

干旱是影响植物生长发育较为重要的非生物环境胁迫因子，随着人类的经济发展，人口增长及全球温室效应加剧，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重。和其它作物相比，大豆蒸腾系数高，需水量大，是缺水较敏感的作物，干旱严重影响其生长发育、产量和品质。因此，耐干旱大豆品种的培育显得尤为重要。近20年来分子生物学发展迅猛，许多与抗旱相关基因克隆，大豆农杆菌介导转化体系的成熟以及人们对转基因作物认同度的增加，为大豆耐旱转基因抗性育种提供了诱人的前景。

植物的水通道蛋白(aquaporin,AQP)属于运输水分的膜蛋白家族，控制着水分子跨膜的快速运动，研究表明水通道蛋白基因的表达水平与植物非生物胁迫密切相关。PIPs是目前在植物体内发现最多的一类定位于原生质膜上的水通道蛋白，PIPs不仅是水和中性小分子选择性通道蛋白，同时还具有许多生理功能，是一类多功能蛋白(李兵等,2006)。至今已有许多报道显示，PIPs基因的表达水平与植物不同阶段的生长发育、不同种类的环境胁迫及激素信号应答过程密切相关(张丽丽等,2017)。PIPs能引起根系水分通透性改变，还参与植物叶片气孔运动及光合作用，大麦HvPIP2；1的过量表达不仅提高植株对水和二氧化碳的通透性，而且还促进植物体内水分及二氧化碳的交换，从而最终增强了光合作用(Hanba et al,2004)。同时PIPs也能运输小分子物质和气体，比如Gao等(2010)发现TaNIP基因促进Na+从细胞质流向细胞外的基质,并提高组织内K+和Ca2+的含量，从而有效提高植物的抗逆性。实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测表明：除ZmPIP2；7以外的玉米ZmPIPs在叶片生长区的表达量要比在生熟叶片中的表达量大得多,说明该蛋白可能参与了叶片尤其是维管束和叶肉组织中水分的径向运输(Hachez et al,2008)。Zhuang et al(2015)研究发现拟南芥过表达FaPIP2；1在干旱条件下转基因植物能保持更高的叶片相对含水量、叶绿素含量、净光合速率和较低的叶片质膜透性，提高拟南芥的抗旱性。

野生大豆(Glycine soja L.)是栽培大豆(Glycine max L.)的祖先，原产于东亚，地理分布广泛，从俄罗斯东部到中国南部都有广泛分布，可在多种生态环境中生长。野生大豆和栽培大豆相比，具有丰富的遗传多样性；另外人类在驯化和利用野生大豆的过程中，丢失了很多野生大豆有利性状如野生大豆的抗旱、耐盐、抗蚜虫和抗胞囊线虫特性等。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4及其编码基因，通过转基因技术将该基因转入栽培大豆品种中，提高大豆植株耐旱性，从而提高大豆产量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4，蛋白GsPIP1-4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还同时提供了上述野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4的编码基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还同时提供了含有上述编码基因的表达载体。

作为本发明的表达载体的改进：为农杆菌重组表达载体pPIP1-4，所述农杆菌重组表达载体pPIP1-4是将SEQ ID NO.2所示的GsPIP1-4基因克隆到表达载体pLM-B001上，转入根癌农杆菌EHA101中而得。

本发明还同时提供了上述编码基因的用途，用于提高植株(大豆)的耐旱性能。

作为本发明的编码基因的用途的改进：培育耐旱大豆。

GsPIP1-4是从野生大豆中克隆出来的水通道蛋白基因，研究表明将相关水通道蛋白基因转入大豆中，表现为抗旱性明显增强。

本发明的编码基因是通过以下思路从野生大豆中克隆的。

(1)野生大豆(Glycine soja L.)是栽培大豆(Glycine max L.)祖先，栽培大豆是从野生大豆人工自然选择进化而来，和栽培大豆(天隆一号)相比，野生大豆(桐庐野生大豆)表现为明显的抗旱性；

(2)在野生大豆中，GsPIP1-4基因随着干旱处理时间的延长，该基因表达增强；

(3)在野生大豆中，GsPIP1-4基因随着ABA处理时间的延长，该基因表达增强；

(4)以野生大豆cDNA为模板，以GsPIP1-4基因CDs全长序列设计引物进行PCR扩增，最终获得GsPIP1-4基因的碱基序列SEQ ID NO.2。

(5)通过生物信息学分析核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示GsPIP1-4基因与栽培大豆、拟南芥、水稻、茶树PIP基因具有高度的相似性。

本发明还提供了克隆的野生大豆核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示GsPIP1-4基因在培育耐旱植物中的应用。

作为优选，所述的植株为一种培育耐旱大豆新种质。

具体包括：

(1)构建含有所述编码基因的植物表达载体；

(2)将所述植物表达载体通过根癌农杆菌介导子叶节方法转入大豆受体材料中，采用草丁膦作为筛选标记，经共培养、芽诱导、芽伸长和芽生根培育获得转基因T0代大豆植株；

(3)T0代转基因大豆植株经鉴定，自花授粉获得T1代种子；

(4)T1代种子经培育、筛选，获得GsPIP1-4转基因耐旱大豆新种质。

(5)T1转GsPIP1-4转基因耐旱大豆在20％PEG模拟干旱条件下，证实GsPIP1-4基因抗旱功能。

步骤(1)中，构建重组表达载体时，采用的原始载体为pLM-B001，编码基因GsPIP1-4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(2)中，所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA105，所述的大豆受体材料为大豆品种天隆一号的子叶节。

步骤(3)和(4)中，所述的鉴定和筛选采用的方法为草丁膦涂抹法、Bar试纸条检测法和PCR鉴定法中的三种。

本发明具有如下技术优势：

本发明从野生大豆中克隆水通道蛋白基因，并采用农杆菌介导法将GsPIP1-4基因导入大豆的实验表明，过表达GsPIP1-4能够增强大豆根部水分的吸收，降低大豆叶片水分的散失，增强大豆净光合速率、蒸腾速率和气孔导度，具有增加产量的潜势；转基因大豆能通过增强抗氧化酶的活性及脯氨酸的含量来提高植株的抗旱能力。因此，GsPIP1-4基因可用于培育耐旱植物新种质。

综上所述，本发明通过农杆菌介导转化技术将该基因转入栽培大豆品种中，明确该基因在栽培大豆中的抗旱功能，增强大豆耐旱性，从而提高大豆产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为2.5M PEG 8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱3天后栽培大豆(A干旱敏感品种汾豆93、B耐干旱品种铁丰31)及桐庐野生大豆(C)生长状况；

A中左图为正常培养3天的汾豆93，右图为模拟干旱3天后的汾豆93；

B中左图为正常培养3天的铁丰31，右图为模拟干旱3天后的铁丰31；

C中左图为正常培养3天的桐庐野生大豆，右图为模拟干旱3天后的桐庐野生大豆。

图2为野生大豆叶片在干旱胁迫(A)和ABA(B)处理下GsPIP1-4基因的表达；

图3为GsPIP1-4蛋白的氨基酸序列比对图；

图4为GsPIP基因多序列比对系统进化树图；

图5为GsPIP-4基因亚细胞定位；

A：空载对照绿色荧光信号；

B：质膜定位Marker融合GFP的在红光下图像；

C：烟草表皮细胞在白光下图像；

D：A,B,C的重合图；

E：35s::GsPIP1-4-mGFP在绿色荧光下定位图像；

F.35s::GsPIP1-4-mGFP在红色荧光下观测图像；

G：白光下35s::GsPIP1-4-mGFP的烟草表皮图像

H：E、G的重合图。

图6为转GsPIP1-4基因重组表达载体pPIP1-4。

图7为T1代转GsPIP1-4基因大豆植株草丁膦涂抹法检测结果，其中1，2，5，6，12，13和15为7个独立的转基因阳性植株叶片。

图8为T1代转GsPIP1-4基因大豆植株Bar试纸条检测结果，其中1，2，5，6，12，13和15为7个独立的转基因阳性植株。

图9为T0代转GsPIP1-4基因大豆植株PCR检测结果，其中1，2，5，6，12，13和15为7个独立的转基因阳性植株。

图7～图9中，植株8、16-18在生长过程中死亡，无法及时取样进行PCR检测，故只有初始的Bar试纸条检测结果和部分草丁膦涂抹法检测结果。

图10天隆一号和转基因植株在20％PEG处理2天复水后5天的长势。

图11沙培转基因和非转基因大豆自然萎蔫和复水后的存活状况。A为对照品种天隆一号；B为转基因株系L12；C为转基因株系L15；D为抗旱品种铁丰31。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所述的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

野生大豆全基因组序列：

Glycine soja cultivar W05 unplaced genomic scaffold scaffold1918,whole genome shotgun sequence；

GenBank:KN651006.1

GenBank Graphics

>KN651006.1:c158272-157948,c156900-156605,c156384-156244,c155623-155531Glycine soja cultivar W05 unplaced genomic scaffold scaffold1918,wholegenome shotgun sequence。

实施例1

1、GsPIP1-4基因的克隆、生物信息学分析和基因定位

将以下三种栽培大豆：A、干旱敏感品种汾豆93，B、耐干旱品种铁丰31，C、桐庐野生大豆进行如下的模拟干旱处理实验(常规技术)：

在发芽盒砂培培养中采用2.5M PEG-8000(渗透势-0.54MPa)进行模拟干旱处理。发芽盒大小为19×13×12cm，每个发芽盒可装载1.3kg的河沙。首先将河沙捡去杂质用水清洗干净，然后进行高温高压灭菌，烘干备用。大豆种子表面采用氯气干燥灭菌后直接播种到发芽盒中，每个发芽盒播20粒种子，待大豆种子发芽后二片单叶展开时，将幼苗定苗到每发芽盒10株，第一张三出复叶长出时每发芽盒浇含有2.5M PEG 8000(渗透势-0.54MPa)100ml1/2Hogland营养液作为模拟干旱处理，以正常浇100ml 1/2Hogland营养液作为对照，3天后观察植株形态并进行比较。

第3天发现：

干旱敏感品种汾豆93植株萎蔫，叶片干枯；对照为正常生长，叶片嫩绿；

耐干旱品种铁丰31株叶片耷拉萎蔫；对照为正常生长，叶片嫩绿；

桐庐野生大豆干旱处理后与对照无明显差异，均能正常生长。

因此，上述实验结果表明2.5M PEG 8000(渗透势-0.54MPa)模拟干旱处理3天野生大豆表现为明显的抗旱性(图1C)。

正常生长11天的野生大豆分别采用2.5M PEG-8000处理和100μmol/L ABA处理，在PEG或ABA处理前和处理后2h、6h、12h、24h、48h不同组织进行取样，提取RNA进行GsPIP1-4定量表达分析。

结果显示PEG处理后呈现先上升后下降的趋势，处理12h时表达量上升为未处理时的4.8倍；在ABA处理短时间内(2h和6h)GsPIP1-4的表达受到抑制，表达下降约50％，在12h后表达量不断上升，处理2d时表达量达到最大，上升了8.3倍。这表明GsPIP1-4基因的表达在PEG和ABA处理后都能产生明显的响应，说明GsPIP1-4基因在干旱胁迫中可能起着重要作用。

具体如图2所述：GsPIP1-4基因随着干旱处理时间的延长表达先上升后下降(图2A)；随ABA处理时间的延长，表达增强(图2B)，鉴于此，推断GsPIP1-4基因可能与耐干旱有关。

以野生大豆(桐庐野生大豆)cDNA为模板，以GsPIP1-4基因CDs全长序列设计引物进行PCR扩增，最终获得GsPIP1-4基因的碱基序列SEQ ID NO.2。

GsPIP1-4基因CDs全长序列

通过生物信息学分析同源性多序列比对表明：大豆GsPIP1-4基因与栽培大豆、水稻、拟南芥GsPIP1-4基因编码蛋白的序列同源一致性较高，反映出GsPIP1-4基因的蛋白序列保守性较高(图3)，由系统进化树(图4)可以看出野生大豆GsPIP1-4基因与栽培大豆、拟南芥、水稻、茶树PIP基因亲缘关系较近。

根据融合GFP报告基因定位的方法构建表达载体，借助GFP表达产物绿色荧光的特性定位目的蛋白质，对GsPIP-4基因进行亚细胞定位，具体如下：

(1)烟草培养：播种烟草种子若干，12h于光照培养箱中培养，生长一个月后可用于实验。

(2)农杆菌培养：准备35s::mGFP、35s::GsPIP1-4-mGFP载体；将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌(GV3101)，30℃培养2d。

(3)悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h。

(4)收集菌体：将悬浮农杆菌4000rpm/min，离心4min，去上清。

(5)重悬：用10mM MgCl

(6)注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。

(7)培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2d，即可观察。

(8)观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。

所得结果如图5所示。基因定位分析表明该基因定位在细胞质质膜上。

2、转GsPIP1-4基因大豆的获得及鉴定

本实验以在生产上大面积推广应用的由中国农业科学院油料作物所育成的大豆品种天隆一号为转化受体材料。

本实验的载体是农杆菌重组表达载体pPIP1-4(图6)，将GsPIP1-4基因通过多克隆酶切位点直接克隆到含有启动子和终止子的表达载体pLM-B001上，经检验合格后将质粒DNA转入根癌农杆菌EHA101中以获得的。可参照常规的农杆菌介导转化法进行。表达载体pLM-B001是从pTF101.1(Paz MM et al.,2006)衍生而来，在pTF101.1的载体上增加了表达目的基因的启动子和终止子。

Paz MM,Matinez JC,Kalvig AB,Fonger Tm,Wang K(2006)Improvedcotyledonary node method using an alternative explants derived from matureseed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation.Plant CellReports,25:206–213。

本实验采用的农杆菌介导转基因方法是上述农杆菌介导大豆子叶节转化体系。成熟大豆种子经由灭菌、萌发、外植体分离、农杆菌侵染、共培养、芽诱导、芽伸长、芽生根、组培苗温室驯化等步骤获得T0代转基因大豆，T0代经草丁膦涂抹(图7)、Bar试纸条(图8)和目的基因PCR(图9)快速鉴定；

鉴定方式具体如下：

草丁膦涂抹的实验方式为：将草丁膦原液配制到135mg/L浓度，用棉签或者毛笔沾除草剂稀释液涂半片叶子后，在无草丁膦的半片叶子上做标记；大豆植株在温室中继续生长一周左右查看叶片变化；所得结果如图7，为：1，2，5，6，12，13和15涂草丁膦叶片没有变黄，说明抗除草剂草丁膦的标记基因Bar已转入到这些植株中，为阳性植株。

Bar试纸条的的实验方式为：取少量大豆叶片在离心管中，加入钢柱和250μl提取液后在研磨机中磨碎，将试纸条插入离心管中5分钟左右查看试纸条结果；所得结果如图8，为：1，2，5，6，12，13和15试纸条上有两条红色条带，说明该植株有Bar蛋白，判定为阳性植株，其他试纸条只出现一条带说明这些植株为阴性植株。

基因PCR为通过PCR的方法扩增转入植株中的目的基因，提取植株叶片DNA，以叶片的DNA为模板和含有目的基因的载体质粒为阳性对照，应用目的基因特异性引物(扩增片段长度为855bp左右)。以此来鉴定表达载体是否转入大豆受体中，所得结果如图9，为：1，2，5，6，12，13和15植株中能扩增出目的基因片段，结果与叶片涂抹草丁勝的试验结果完全符合，说明GsPIP-4基因已经整合到大豆受体中了。

因此可得知：1，2，5，6，12，13和15为7个独立的转GsPIP-4基因阳性植株。而，其余11株为阴性植株说明外源基因和Bar基因没有转入到大豆受体中。

本发明中，自花授粉得到T1代种子，T1代种子再通过验证明确为转GsPIP-4基因植株的，用于抗旱性的鉴定。

3、转GsPIP1-4基因植株耐旱性鉴定

将氯气干法灭菌后的T

将水培11天的转基因大豆与野生型大豆(天隆一号)用20％PEG8000处理2天，然后正常生长(即，于培养箱中培养，温度在25±1℃，光照为14h/10h(昼/夜))5天，发现干旱引起三个转基因株系L5、L12和L15(随机选择)茎和叶的鲜重分别减少18.7％、18.1％和24.2％，而野生型大豆则减少47.5％，达到显著水平；20％PEG8000模拟干旱，L5、L12和L15根鲜重分别减少15.8％、16.9％和13.0％，而野生型大豆减少了37.6％(表1)。

表1、天隆一号和转基因株在PEG模拟干旱处理和复水后株高、根长、茎叶鲜重和根系鲜重的减少量

为了进一步明确GsPIP1-4基因的抗旱功能，本发明采用非转基因大豆天隆一号、耐旱性强的大豆品种“铁丰31”(汪桂凤，2019)以及转GsPIP1-4基因株系L12和L15进行失水复水实验，在沙培中种植上述四个株系，正常生长至三叶期后停止浇水至叶片萎蔫，然后复水，两天后统计复活并正常生长植株的数量。经统计，天隆一号、“铁丰31”、转基因株系L12和L15的复水后存活率分别为42.1％、47.5％、54.4％和53.7％，因此，可证明“铁丰31”较“天隆一号”具有良好的抗旱性，且转GsPIP1-4基因大豆植株材料在干旱复水后较“铁丰31”有更好的恢复生长能力，在耐旱方面有一定的优势。具体如表2。

表2、天隆一号、铁丰31、转基因株系L12和L15在干旱处理并复水后的植株存活率统计

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 野生大豆水通道蛋白GsPIP1-4及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 284

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine L.)

<400> 1

Met Glu Gly Lys Glu Glu Asp Val Arg Val Gly Ala Asn Arg Tyr Gly

1 5 10 15

Glu Arg Gln Pro Ile Gly Thr Ala Ala Gln Ala Lys Asp Tyr Arg Glu

20 25 30

Pro Pro Ser Ala Pro Leu Phe Glu Pro Gly Glu Leu Ser Ser Trp Ser

35 40 45

Phe Tyr Arg Ala Gly Ile Ala Glu Phe Val Ala Thr Phe Leu Phe Leu

50 55 60

Tyr Ile Thr Val Leu Thr Val Met Gly Val Phe Lys Ser Lys Ser Lys

65 70 75 80

Cys Ser Thr Val Gly Ile Gln Gly Ile Ala Trp Ala Phe Gly Gly Met

85 90 95

Ile Phe Ala Leu Val Tyr Ser Thr Ala Gly Ile Ser Gly Gly His Ile

100 105 110

Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Leu Phe Leu Ala Arg Lys Leu Ser Leu

115 120 125

Thr Arg Ala Ile Phe Tyr Ile Ile Met Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys

130 135 140

Gly Ala Gly Val Val Lys Gly Phe Glu Pro His Leu Tyr Glu Arg Leu

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ala Asn Thr Ile Ala Lys Gly Tyr Thr Asn Ser Ala Gly

165 170 175

Leu Gly Ala Glu Ile Val Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr Thr Val Phe

180 185 190

Ser Ala Thr Asp Ala Lys Arg Asn Ala Arg Asp Ser His Val Pro Ile

195 200 205

Leu Ala Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe Leu Val His Leu Ala

210 215 220

Thr Ile Pro Val Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ala Ile Ile Phe Asn Lys Asp Gln Ala Trp Asp Asp His Trp Ile

245 250 255

Phe Trp Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Ala Leu Ala Ala Leu Tyr His

260 265 270

Gln Ile Val Ile Arg Ala Ile Pro Phe Ser Ser Lys

275 280

<210> 2

<211> 855

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine L.)

<400> 2

atggagggaa aagaagagga cgtaagagtt ggagccaaca ggtacggaga gaggcagcca 60

atagggaccg ctgctcaggc taaagactac agagagccac cgtcggcgcc tctcttcgaa 120

ccgggagagt tgtcatcgtg gtctttctat agggctggca tagcagagtt tgtggccact 180

ttcttgttcc tctacatcac agtgctgact gtgatgggtg tgttcaaatc taagagcaag 240

tgttccactg tgggtatcca aggcattgct tgggcttttg ggggaatgat ctttgctctt 300

gtttattcca ctgctggaat ctcagggggt catattaacc cagcagtgac gtttgggctg 360

ttcttggcac gcaagctctc tctgacaagg gcaatttttt acataatcat gcagtgcttg 420

ggagctatat gtggtgctgg tgtagttaag gggttcgagc cacacctcta tgagaggctt 480

ggtggtggtg ccaacacaat cgctaaaggg tacaccaata gtgctggcct tggagcagag 540

attgttggca catttgtgct tgtttacact gtcttctctg ccactgatgc caaaagaaat 600

gctagagact cccatgttcc aattttggca ccactgccta ttggttttgc tgtgtttcta 660

gtgcacttgg ctacaattcc tgttacaggg actggtatca accctgctag aagtctaggt 720

gcagccatta tcttcaacaa ggaccaagct tgggatgacc attggatatt ttgggttggg 780

cctttcattg gggcagcact tgcagctttg taccatcaga tagtgatcag ggccatcccc 840

ttctcgtcga agtga 855