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一种HPLC法测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及辅料的方法

文献发布时间：2023-06-19 11:00:24

技术领域

本发明涉及医药产品中有关物质的检测方法，具体涉及一种HPLC法测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及辅料的方法。

背景技术

普瑞巴林属于非γ-氨基丁酸（GABA）受体激动剂或拮抗剂，是一种新型钙离子通道调节剂，能阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放。普瑞巴林与中枢神经系统组织中的α2-δ位点（一个电压门控钙通道辅助性亚单位）亲合力较高，尽管普瑞巴林的作用机制尚不完全清楚。但是，改良小鼠试验结果以及与普瑞巴林结构类似的化合物（如：加巴喷丁）的试验结果表明，普瑞巴林与α2-δ位点结合，与普瑞巴林动物模型的抑制疼痛和抗癫痫发作作用有关。离体试验表明，普瑞巴林可能通过调节钙通道功能，降低多种钙依赖性神经递质的释放。

普瑞巴林口服溶液（Pregabalin，商品名：lyrica®）由Pfizer公司生产，2004年7月，欧盟批准其用于治疗部分癫痫发作，2005年由美国FDA批准上市，用于缓解与治疗神经性疼痛包括糖尿病周围神经病变神经痛（DPN）、带状疱疹后神经痛（PHN）、脊髓损伤相关神经痛、纤维肌痛相关神经痛以及4岁及以上患者癫痫部分发作的治疗。普瑞巴林是首个被美国FDA批准用于糖尿病周围神经病变和带状疱疹后神经痛的药物，也是目前最畅销的镇痛药。

普瑞巴林结构式：

普瑞巴林口服溶液的处方成分有：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯蔗糖、羟苯甲酯、羟苯丙酯、草莓香精、纯化水。

普瑞巴林口服溶液中的降解产物及辅料有如下来源：一为普瑞巴林在放置过程中的降解杂质；二为普瑞巴林与处方中防腐剂（羟苯甲酯、羟苯丙酯）降解产物反应生成的降解杂质；三为制剂处方中引入的辅料，主要有：

1.降解杂质：

（1）内酰胺：（S）-4-异丁基-2酮，具体结构式分别如式Ⅰ：

式Ⅰ

（2）杂质A：（S）-3-（4-羟基苯甲酸氨基）5-甲基己酸，具体结构式分别如式Ⅱ：

式Ⅱ

（3）杂质B： 2，5-（（s）-2-异丁基-3-羧基丙胺基）-1，4-苯醌，具体结构式分别如式Ⅲ：

式Ⅲ

2.辅料：

（1）对羟基苯甲酸甲酯，具体结构式分别如式Ⅳ：

式Ⅳ

（2）对羟基苯甲酸丙酯，具体结构式分别如式Ⅴ：

式Ⅴ

（3）三氯蔗糖，具体结构式分别如式Ⅵ：

式Ⅵ

（4）草莓香精。

对于生产、存储普瑞巴林口服溶液的过程中可能产生的降解杂质，需要进行严格控制，以保证产品的质量。且因口服溶液中除原料药外，还有众多辅料，容易干扰杂质测定。因此，实现普瑞巴林口服溶液中降解杂质的检出和分离，同时保证处方中的各辅料不干扰这些降解杂质的测定，保证方法的专属性，在制剂过程的重量控制方面具有重要的现实意义。

另外，在上述提到的降解杂质中，其中2，5-（（s）-2-异丁基-3-羧基丙胺基）-1，4-苯醌杂质，其结构中存在1，4-苯醌的结构，根据CPDB数据库（致癌性数据库）查阅，该结构的物质具有潜在基因毒性，有一定的致癌率。且有相关研究文献指出，1，4-苯醌可以诱导K562细胞活性氧增加，导致线粒体损伤和细胞凋亡增加（文献出处：论著，2019年7月第31卷第4期，Camk2b低表达对1,4-苯醌致K562细胞线粒体毒性的影响，张虹，王彤，王坤，王博深，章梦莹，周燕华，浦跃朴，张娟，东南大学公共卫生学院，环境医学工程教育部重点实验室，江苏南京 210009）。另因该杂质的产生与药液中辅料羟苯甲酯结构相关，故该杂质与羟苯甲酯在液相色谱系统中出峰时间较为相近，而本方法可将该杂质有效分离及检出，对本品质量控制有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HPLC法测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及各辅料的方法，该方法能有效分离测定普瑞巴林口服溶液中的降解杂质的含量，且各辅料不干扰杂质测定，方法灵敏度高、专属性好、精密度高、准确性好，检测结果准确可靠。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种HPLC法测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及辅料的方法，同时将各辅料与杂质分离，使辅料不干扰杂质测定。所述的方法采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测。

所述流动相A为有机溶剂与磷酸盐缓冲液的混合溶液，有机溶剂为甲醇和乙腈。磷酸氢二钠缓冲液：甲醇：乙腈体积比比例为：80:15:5。所述流动相A中的磷酸盐缓冲液，优选为磷酸氢二钠缓冲液；缓冲液的浓度范围为0.005mol/L~0.015mol/L，优选为0.01mol/L；磷酸氢二钠缓冲液用磷酸调节缓冲液pH值范围至6.8~7.2，优选为7.0。

所述流动相B为乙腈。

所述梯度洗脱设置如下：

作为一种优选，所述梯度洗脱设置如下：

所述流动相进行洗脱的流速为0.7~0.9ml/min，优选为0.8ml/min。

所述色谱柱的柱温为20~30℃，优选为25℃。

所述检测器的检测波长为210±5nm，优选为210nm。

所述方法具体包括以下步骤：

1）供试品溶液：取供试品溶液即得，样品溶液的进样量为10μl；

2）对照品溶液：分别称取内酰胺、杂质A和杂质B的对照品，用溶剂溶解稀释制成对照品溶液；

3）空白辅料溶液：按照处方比例，分别称取羟苯甲酯、羟苯丙酯、三氯蔗糖和草莓香精，用水溶解稀释制成空白辅料溶液；

4）分别取步骤1）所述的供试品溶液和步骤2）的对照品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定内酰胺、杂质A和杂质B的保留时间，计算杂质的含量；

5）取步骤3）所述的空白辅料溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定羟苯甲酯、羟苯丙酯、三氯蔗糖及草莓香精的出峰位置，考察辅料出峰对杂质检测的干扰。

所述对照品溶液的浓度为0.04mg/ml。

步骤2）所述的溶剂为流动相A。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明用以十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱，有机相与磷酸盐缓冲液的混合溶剂作为流动相梯度洗脱，可以将普瑞巴林口服溶液中的杂质及辅料在同一色谱条件下进行快速高效的分离，使本品有关物质检测结果专属可靠，可有效控制制剂的质量。该检测方法专属性强、精密度高、准确性好、操作方便，可有效控制药品品质。

（2）本发明提供的HPLC法能有效分离测定普瑞巴林及其降解杂质内酰胺、杂质A及杂质B的含量，且灵敏度高、专属性强和重复性好，口服溶液中的其他各辅料不干扰杂质测定，检查结果可靠准确，降解杂质内酰胺、杂质A及杂质B峰之间的分离度大于1.5。

附图说明

图1为普瑞巴林口服溶液高效液相色谱图

图2为内酰胺、杂质A及杂质B的混合溶液图

图3为空白辅料的高效液相色谱图

图4为普瑞巴林口服溶液高效液相色谱图

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实离中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1 分离测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及辅料的方法

仪器：Thermo U3000

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（XB-C18，250mm×4.6mm，5μm或性能相当的色谱柱）

流动相A：缓冲液（0.01mol/L磷酸氢二钠溶液，用磷酸调pH值至7.0）-甲醇-乙腈（80:15:5）

流动相B：乙腈

表1 线性洗脱梯度如下：

检测器：UV

检测波长：210nm

流速：0.8ml/min

柱温：25℃

进样体积：10μl

色谱工作站：变色龙

取本品，作为供试品溶液；精密称取普瑞巴林、内酰胺、杂质A与杂质B对照品适量，加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Welch Ultimate XB-C18，4.6mm×250mm，5μm）；以0.01mol/L磷酸氢二钠缓冲液（用磷酸调节pH值至7.0）-甲醇-乙腈（80:15:5）为流动相A；乙腈为流动相B；按上表1进行梯度洗脱；检测波长为210nm；柱温为25℃；流速为每分钟0.8ml。精密量取空白辅料定位溶液、对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果表明：该方法能有效将内酰胺、杂质A、杂质B以及空白辅料中的各辅料进行分离，空白辅料不干扰杂质检测，内酰胺、杂质A、杂质B各峰之间分离度均大于1.5，见图1。

此方法测定的灵敏度高。内酰胺的LOD浓度为0.4μg/ml，相当于成品含量的0.002%，杂质A LOD浓度为0.04μg/ml，相当于成品含量的0.0002%，杂质B的LOD浓度为0.05μg/ml，相当于成品含量的0.0002%。

此方法的专属性强。空白辅料中各辅料出峰位置均不干扰降解杂质测定，方法专属性强。见图2-图3。

实施例2 分离测定普瑞巴林口服溶液中降解杂质及辅料的方法