基于杂交捕获及酶保护的microRNA高通量检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域；更具体地，本发明揭示一种基于杂交捕获以及酶保护的新型microRNA检测方法及试剂盒，所述检测方法可实现高通量检测。

背景技术

miRNA即micro RNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA的长度一般在22nt左右，在细胞内与Argonaute蛋白和Dicer酶组成RNA沉默复合物(RISC)参与mRNA的转录后调控，通过碱基互补配对与靶mRNA结合，抑制后者的翻译过程，或者促进靶mRNA的降解。

miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多地引起本领域技术人员的关注。在癌症中，细胞癌变往往伴随miRNA表达水平的变化，如癌基因相关的miRNA水平下调或抑癌基因相关的miRNA水平上调。因此miRNA可以作为一个肿瘤标志物，检测其表达的变化可以进行癌症的早期诊断或预后判断。miRNA还被发现与多种多样的其它类型疾病具有相关性，例如心血管疾病，高血糖、高血脂相关的疾病等等。此外，在植物体内，也存在miRNA，与植物体的多种多样的性状变化及信号机制具有紧密的相关性。

由于miRNA长度仅22nt左右，对其进行检测较为困难。目前主要方法有RNA测序、miRNA芯片和RT-PCR法。其中前两者主要用于高通量的miRNA分析，意义在于寻找新的miRNA或miRNA的作用等基础研究，成本高昂，不适用于临床应用。

在诊断方面，经典的RT-PCR仍然是目前最常用的方法，优点是灵敏度高，但由于miRNA很短，一般需要设计茎环引物进行逆转录并扩增，引物设计难度较高，且逆转录过程容易引入更多的误差，造成结果的准确度、精密度下降。此外，也有核酸扩增共有的缺点，如操作复杂，需要专门的PCR实验室等。虽然可以实现自动化，但其成本也会提高很多。

因此，本领域还有必要进一步进行miRNA的检测方法的探索和开发，以其改变上述技术缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于杂交捕获以及酶保护的新型microRNA检测方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种基于杂交捕获的microRNA检测方法，所述方法包括：(1)将茎环探针、延长DNA探针和RNA连接酶与待测样品混合，进行连接反应；其中，所述茎环探针的“环”部5’端序列与待测microRNA互补、“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列与延长DNA探针的3’端序列互补；(2)在(1)的体系中加入核酸外切酶，进行消化反应；(3)在(2)的体系中加入延长RNA探针，进行杂交反应；其中，所述延长RNA探针与所述延长DNA探针互补(例如为完全互补)；(4)以抗DNA-RNA杂合体抗体对(3)的杂交体系进行捕获反应，检测捕获产物的存在情况或存在量。

在一个优选例中，(1)中，所述茎环探针的“环”部5’端序列与所述待测microRNA序列的碱基数目相等。

在另一优选例中，(1)中，所述“环”部3’端序列的碱基数目为2～6个(如3、4、5个)。

在另一优选例中，(1)中，所述“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列的碱基数目为6～12个(如7、8、9、10、11个)。

在另一优选例中，(1)中，“环”部3’端序列及邻接的茎部部分序列与延长DNA探针3端互补，长度5-10个碱基，优选地6-8个碱基。

在另一优选例中，(1)中，所述的茎环探针中，“茎”部的单侧序列的碱基数为4～12nt；较佳地5～10nt。

在另一优选例中，(1)中，所述的RNA连接酶为T4 RNA连接酶2。

在另一优选例中，(2)中，所述核酸外切酶为核酸外切酶I。

在另一优选例中，(1)或(3)中，所述延长DNA探针或所述延长RNA探针的长度为50～5000nt；较佳地，长度为60～3000nt；更佳地，长度为80～2000nt(如90、100、110、120、130、140、150、200、300、500、800、1000、1500nt)。

在另一优选例中，所述抗DNA-RNA杂合体抗体包被于固相载体；较佳地，所述固相载体为高通量检测的固相载体，例如24孔、48孔、96孔、192孔、384孔等的微孔板。

在另一优选例中，以抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物及该酶标记物相应的可检测(如发光)底物检测捕获产物的存在情况或存在量。

在另一优选例中，所述的酶标记物包括选自：碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。

在另一优选例中，所述连接反应中，所述茎环探针的终浓度为100±40nM，较佳地为100±20nM，更佳地为100±10nM。

在另一优选例中，所述连接反应中，所述延长DNA的终浓度为100±40nM，较佳地为100±20nM，更佳地为100±10nM。

在另一优选例中，所述连接反应中，所述RNA连接酶的用量为2±1U，较佳地为2±0.6U，更佳地为2±0.3U。

在另一优选例中，所述消化反应中，所述核酸外切酶的用量为2±1U，较佳地为2±0.6U，更佳地为2±0.3U。

在另一优选例中，所述杂交反应中，所述延长RNA探针的终浓度为50～500ng/mL(如80ng/mL、100ng/mL、125ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL)。

在另一优选例中，所述的捕获反应中，所述抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物的终浓度为2～30ng/mL(如3、5、7、8、8.5、9、10、15、20ng/mL)。

在另一优选例中，本发明的方法为不以疾病的诊断为直接目的的方法；也即本发明的方法为非诊断性的方法。例如，将所述方法用于离体的或来自于自然界的但并非来自人或动物疾病相关的样本的检测。又例如，应用于在实验室中分析miRNA的存在情况，或应用于不以诊断为目的的辅助性样本参数测定。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测microRNA的试剂盒，所述试剂盒中包括：茎环探针和延长DNA探针，所述茎环探针的“环”部5’端序列与待测microRNA互补、“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列与延长DNA探针的3’端序列互补；延长RNA探针，所述延长RNA探针与所述延长RNA探针互补(例如为完全互补)；RNA连接酶，较佳地为T4 RNA连接酶2；核酸外切酶，较佳地为核酸外切酶I；抗DNA-RNA杂合体抗体；抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物；或，酶标记物相应的可检测(如发光)底物。

在一个优选例中，所述茎环探针的“环”部5’端序列与所述待测microRNA序列的碱基数目相等。

在另一优选例中，所述“环”部3’端序列的碱基数目为2～6个(如3、4、5个)。

在另一优选例中，所述“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列的碱基数目为6～12个(如7、8、9、10、11个)。

在另一优选例中，所述茎环探针中，与所述“环”部3’端序列邻接的茎部的3’端，存在1～4个(如2、3个)碱基不与所述延长DNA探针互补。

在另一优选例中，所述延长DNA探针或所述延长RNA探针的长度为50～300nt；较佳地，长度为60～200nt；更佳地，长度为80～160nt(如90、100、110、120、130、140、150nt)。

在另一优选例中，所述抗DNA-RNA杂合体抗体包被于固相载体；较佳地，所述固相载体为匹配高通量检测的固相载体。

在另一优选例中，以抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物及该酶标记物相应的可检测(如发光)底物检测捕获产物的存在情况或存在量。

在另一优选例中，所述的酶标记物包括选自：碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的材料：所述酶标记物相应的底物，显色剂，所述连接缓冲液，较佳地为Tris-HCl缓冲液；MgCl

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括说明所述基于杂交捕获的microRNA检测方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明的基于杂交捕获以及外切酶保护的microRNA检测方法的检测示意图。

图2A～C、本发明的基于杂交捕获以及外切酶保护的microRNA检测方法的检测原理说明图。

图3、本发明的检测方法的基本原理示例图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种基于杂交捕获以及酶保护的新型microRNA检测方法。本发明的方法可不运用核酸提取、逆转录和扩增过程，可有效避免逆转录步骤的误差和扩增造成的污染风险，其可方便地实现高通量检测，适用于需要大规模检测的情景。本发明也揭示了应用于所述方法进行microRNA检测的试剂盒。

术语

如本文所用，“待测样本”或“待测核酸样本”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。

如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸，除非另外说明，本发明中的目标核酸为microRNA(miRNA)。

如本文所用，所述“DNA-RNA杂合体”或“双链杂交体(双链杂合体)”是指一种核酸，其含有两条链，其中一条链是DNA链，另一条链是RNA链，所述的DNA链和RNA链的核苷酸序列是基本上互补的。

如本文所用，“互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，形成双链；在较佳的方式中，所述的“互补”为完全互补。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(包括DNA或RNA)，其具有与目标核酸的碱基部分或全部互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

如本文所用，“捕获抗体”或“包被抗体”是指可被包被在固相载体上的，特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“捕获抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。将抗体包被在固相载体上是本领域技术人员熟知的技术。术语“捕获抗体”可以与“包被抗体”互换使用。

如本文所用，“抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物”或“酶偶联抗体”也称为“检测抗体”，是指特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸(包括DNA或RNA等)。所述的“检测抗体”通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。所述的“检测抗体”携带有酶标记物，用于报告双链杂交体的捕获情况。

测定方法

本发明提供了一种基于杂交捕获的microRNA检测方法，所述方法包括：(1)将茎环探针、延长DNA探针和RNA连接酶与待测样品混合，进行连接反应；其中，所述茎环探针的“环”部5’端序列与待测microRNA互补、“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列与延长DNA探针的3’端序列互补；(2)在(1)的体系中加入核酸外切酶，进行消化反应；(3)在(2)的体系中加入延长RNA探针，进行杂交反应；其中，所述延长RNA探针与所述延长DNA探针互补；(4)以抗DNA-RNA杂合体抗体对(3)的杂交体系进行捕获反应，检测捕获产物的存在情况或存在量。

本发明中，所述的茎环探针是单链DNA探针，其两端各有4-12nt(较佳地5-10nt)自身互补，中间“环”部与靶标miRNA互补。

本发明中，所述延长DNA探针是单链DNA探针，长度数百至数千nt，其3’端与茎环探针的一部分(例如5-10nt)互补，剩余部分与延长RNA探针互补。

本发明中，所述延长RNA探针是单链RNA探针，与所述延长DNA探针互补。

本发明的方法中，主要的检测试剂包括：①茎环探针、②延长DNA探针、③延长RNA探针、④T4 RNA连接酶2、⑤核酸外切酶。

本发明的检测方法的基本原理示例于图2～图3中。

根据图2A，使用与miRNA互补的茎环探针①，当靶miRNA存在时，茎环探针①打开并与延长DNA探针②结合，由RNA连接酶④连接相邻的miRNA的5’端和延长DNA探针②的3’端。也即，在①、②、④以及靶miRNA均存在时，①的茎环打开，miRNA和②同时杂交在①上且miRNA的5’端和②的3’端紧密相邻，此时④可以催化miRNA的5’端磷酸和②的3’端羟基结合，从而将miRNA和②连接为一体。RNA连接酶只能连接相邻的5’端磷酸和3’端羟基，且两条核酸必须同时杂交在一条互补链上(在这里是茎环探针①)，这样就保证了高的特异性：因为只有与茎环探针①完全匹配的miRNA才能够打开，而打开状态的茎环探针①才能与延长DNA探针②结合。

根据图2B，在靶miRNA存在的情况下，在如图2A的反应后，用核酸外切酶⑤消化未连接的延长DNA探针②。核酸外切酶⑤加入后，过量的没有被miRNA连接的②被⑤从3’端开始全部降解；而连接过miRNA的②则不被降解。根据核酸外切酶的特性，其是从3’羟基端开始降解单链DNA，而对双链DNA、单链RNA、双链RNA、DNA-RNA杂合体都不发生作用，对3’端有其它修饰(如磷酸化、乙酰化)的单链DNA也没有反应。经过这一步骤后，有多少靶miRNA就有多少②留存，比例为1:1；且此时，茎环探针存在与否及存在量已无需关注，其不再参与之后的任何反应，本发明人的实验结果也显示，其是否被消化不会影响整体的反应过程、特异性和灵敏度。

根据图2C，在靶miRNA存在的情况下，在如图2B的反应后，加入与延长DNA探针②互补的延长RNA探针③进行杂交形成DNA-RNA杂合体。然后通过杂交捕获的步骤，所述DNA-RNA杂合体被抗DNA-RNA杂合体捕获；之后可进行检测。在优选的情况下，将抗DNA-RNA杂合体的抗体包被于固相载体上，对DNA-RNA杂合体进行捕获、利用抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物(酶偶联抗体)进行检测。

根据本发明，仅在靶标miRNA存在时，茎环探针与之杂交并被打开，进一步与延长DNA探针杂交。在没有靶标miRNA存在时，如图3，茎环探针自身互补配对成环状，不与延长DNA探针杂交。

本发明的方法中，本质是核酸酶保护，利用核酸外切酶只能从3’端降解单链DNA的特性，用miRNA保护单链DNA的3端，使之免被降解，然后转而检测残留的单链DNA。

同时，本发明的方法基于杂交捕获技术，其中抗体捕获的对象是特殊的，即由DNA与RNA互补形成的DNA-RNA杂合体，而非常规的蛋白质。较佳地，DNA-RNA杂合体与固相载体如微孔板上的特异性抗DNA-RNA抗体结合被固定在固相微孔板上，同时与偶联有酶标记物的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体结合，通过检测该酶标记物，定性检测样本中的目标核酸。利用微孔板等固相载体，可设置大量检测单位(如检测孔)，一次检测可以获得高通量的检测结果。

所述的包被抗体与所述的检测抗体可以基于相同的抗体或不同的抗体，即检测抗体在不携带酶标记物的情况下可以是与包被抗体相同的或不同的。以双链杂交体作为抗原与以蛋白质作为抗原不同，抗DNA-RNA双链杂交体所产生的抗体无特定的序列或抗原决定簇的要求，其特异性识别双链杂交体所特有的双螺旋结构。抗DNA-RNA抗体(无论是单克隆或多克隆抗体)能与任何DNA-RNA双链杂交体相结合。优选的，所述的包被抗体与所述的检测抗体基于不同的抗体，例如，所述的包被抗体是一种抗所述双链杂交体的多克隆抗体，而所述的检测抗体是一种抗所述双链杂交体的单克隆抗体。利用特定的双链杂交体来制备抗所述双链杂交体的抗体的方法是本领域已知的技术，例如可以按照Kitagawa&Stollar的方法(Kitagawa Y,Stollar BD,Mol Immunol 1982，19：413-420)来制备多克隆抗体；或可以按照Fliss等的方法(Fliss I,Laurent M,Emond E,et al.,Appl Environ Microbiol,1993,59(8):2698-2705)来制备单克隆抗体。

所述的酶标记物是连接或偶联于检测抗体上的、用于报告检测抗体的结合情况的报告分子。优选的，所述的酶标记物选自：碱性磷酸酶(AP)，辣根过氧化物酶(HRP)，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。这些酶标记物具有特定的底物，在与底物接触后可以发生显色反应或其它可被检测到或可见的反应，从而报告检测抗体的结合情况。所述的底物比如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)、CDP-Star；等等。

尽管本发明所述的捕获方法的部分方面中基于ELISA原理，但是本发明人设计的方法中，捕获的对象是特殊的，即由DNA与RNA互补形成的双链杂交体，而非常规的蛋白质。本发明的整体技术方案中，不涉及核酸提取、逆转录和扩增过程，避免了逆转录步骤的误差和扩增造成的污染风险。同时，本发明使用的是ELISA平台，用96孔板或384孔微孔板可以达到高通量检测。

检测试剂盒

结合本发明的检测方法，本发明也提供了一种用于检测microRNA的检测试剂盒，其中包含用于本发明的方法的：茎环探针和延长DNA探针，所述茎环探针的“环”部5’端序列与待测microRNA互补、“环”部3’端序列及与之邻接的茎部部分序列与延长DNA探针的3’端序列互补；延长RNA探针，所述延长RNA探针与所述延长RNA探针互补(例如为完全互补)；RNA连接酶，较佳地为T4 RNA连接酶2；核酸外切酶，较佳地为核酸外切酶I；抗DNA-RNA杂合体抗体；抗DNA-RNA杂合体抗体-酶标记物；酶标记物相应的可检测(如发光)底物。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括：所述酶标记物相应的底物，显色剂，所述连接缓冲液，较佳地为Tris-HCl缓冲液；MgCl

本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相结合(偶联、连接)即可。例如，所述的固相载体选自但不限于：微量滴定板(如96孔板)、载玻片、磁珠、试纸或微球。将抗体包被到固相载体上的技术也是本领域技术人员所熟知的。

为了便于操作，所述的试剂盒中还可含有进行核酸解链处理、洗涤、显色等操作所需要的试剂。用于解链处理的如变性试剂(如碱处理试剂)，用于显色处理的如指示剂染料。

作为本发明的优选方式，所述试剂盒中，还包括样本保存液，所述的样本保存液主要成份为含有一定浓度盐的TE缓冲液，使核酸稳定地保存在TE缓冲液中。

作为本发明的优选方式，洗涤液为一定pH值的缓冲液，具有减少非特异性吸附的作用。

本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，成本低廉，无需DNA扩增，无需特殊试验条件，操作简单易培训，使实验污染的降到最低。

此外，所述的试剂盒中还可包括说明所述基于杂交捕获的microRNA检测方法的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、基于抗体捕获且应用双酶的miRNA-424的检测示例

1、检测试剂的设计

以miRNA-424为例，材料如下(5’→3’)：

CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA(SEQ ID NO:1)。

茎环探针(5’→3’)：

该序列中，波浪下划线部分是与miRNA-424互补的部分，直下划线部分是自身互补的7bp茎部，斜体加黑字体是与延长DNA的3端互补的7个碱基。

延长DNA探针(5’→3’)：

延长RNA探针(5’→3’)：

CUCGACAGGUUUCCCGACUGGAAAGCGGGCAGUGAGCGCAACGCAAUUAAUGUGAGUUAGCUCACUCAUUAGGCACCCCAGGCUUUACACUUUAUGCUUCCGGCUCGUAUGUUGUGUGGA(SEQ ID NO:4)；

该“延长RNA探针”与“延长DNA探针”互补。

同时，本发明人也设置了一组miRNA-424人为变异的miRNA作为对照(其中下划线碱基为突变位点碱基)：

2、利用前述检测试剂进行测定

合成用于实验的待测miRNA，该待测miRNA选自：miRNA-424及其变异体miRNA-424-T1、miRNA-424-T2。测定方法的示意图如图1，测定的实验步骤如下：

(1)连接

将茎环探针、延长DNA探针、T4 RNA连接酶2和50μL待测miRNA样本混合，缓冲液为50mM Tris-HCl，10mM MgCl

其中，茎环探针、延长DNA各自终浓度为100nM，T4 RNA连接酶2为2U。

25℃孵育15min。

(2)消化

在上述体系中，加入1μL核酸外切酶I(2U)，37℃孵育30min。

(3)杂交

加入25μL、500ng/mL(终浓度为125ng/mL)的延长RNA探针，65℃孵育60min。

(4)捕获检测

杂交液冷却后，加入包被有抗DNA-RNA杂合体抗体的微孔板(96孔板)，再加入75μL、20ng/mL(终浓度为8.57ng/mL)抗DNA-RNA杂合体抗体-碱性磷酸酶偶联体的0.6M NaCl，0.1mM ZnCl

(5)清洗、读数

弃去微孔板中液体，加入300μL 0.1M Tris-HCl pH7.4，0.6M NaCl缓冲液，清洗6次。

加入75μL碱性磷酸酶发光底物CDP-Star，室温避光孵育15min后于化学发光仪读取信号。

定义信号/噪声(Signal/Noise)比例(信噪比)：“样本与空白对照的信号值的比”大于2为检出。

3、灵敏度测定

检测本发明的检测的灵敏度。实验时，将miRNA-424稀释至0.1～10pM进行检测、设置空白组作为对照。

结果如表1。

表1

根据表1结果可见，利用上述设计的检测试剂针对miRNA-424进行检测，在miRNA浓度低至0.1pM时，仍有理想的信噪比。因此，miRNA-424检测灵敏度达0.1pM。

加长延长DNA和延长RNA探针到2000nt时，其灵敏度大约达到0.01pM。

4、特异性测定

检测本发明的检测的特异性。实验时，将miRNA-424及其变异体miRNA-424-T1、miRNA-424-T2稀释至100pM进行检测，结果如表2。

表2

根据表2可见，本发明针对miRNA-424设计的检测试剂，对于miR424具有很高的特异性，对于变异体miRNA-424-T1、miRNA-424-T2则呈现阴性，特异性非常理想。

实施例2、基于抗体捕获且应用双酶的miRNA-375的检测示例

1、检测试剂的设计

以miRNA-375为例，材料如下(5’→3’)：

UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQ ID NO:7)。

茎环探针(5’→3’)：

该序列中，波浪下划线部分是与miRNA-375互补的部分，直下划线部分是自身互补的7bp茎部，斜体加黑字体是与延长DNA的3端互补的7个碱基。

延长DNA探针(5’→3’)：

延长RNA探针(5’→3’)：

CUCGACAGGUUUCCCGACUGGAAAGCGGGCAGUGAGCGCAACGCAAUUAAUGUGAGUUAGCUCACUCAUUAGGCACCCCAGGCUUUACACUUUAUGCUUCCGGCUCGUAUGUUGUGUGGA(SEQ ID NO:10)；

该“延长RNA探针”与“延长DNA探针”互补。

同时，本发明人也设置了一组miRNA-375人为变异的miRNA作为对照(其中下划线碱基为突变位点碱基)：

miRNA-375-T1：UUUGUUCGUUCGGCUC

miRNA-375-T2：UUUGU

2、利用前述检测试剂进行测定

合成用于实验的待测miRNA，该待测miRNA选自：miRNA-375及其变异体miRNA-375-T1、miRNA-375-T2。测定方法的示意图如图1，测定的实验步骤如下：

(1)连接

将茎环探针、延长DNA探针、T4 RNA连接酶2和50μL待测miRNA样本混合，缓冲液为50mM Tris-HCl，10mM MgCl

其中，茎环探针、延长DNA各自终浓度为100nM，T4 RNA连接酶2为2U。

25℃孵育15min。

(2)消化

在上述体系中，加入1μL核酸外切酶I(2U)，37℃孵育30min。

(3)杂交

加入25μL、500ng/mL(终浓度为125ng/mL)的延长RNA探针，65℃孵育60min。

(4)捕获检测

杂交液冷却后，加入包被有抗DNA-RNA杂合体抗体的微孔板(96孔板)，再加入75μL、20ng/mL(终浓度为8.57ng/mL)抗DNA-RNA杂合体抗体-碱性磷酸酶偶联体的0.6M NaCl，0.1mM ZnCl

(5)清洗、读数

弃去微孔板中液体，加入300μL 0.1M Tris-HCl pH7.4，0.6M NaCl缓冲液，清洗6次。

加入75μL碱性磷酸酶发光底物CDP-Star，室温避光孵育15min后于化学发光仪读取信号。

定义信号/噪声(Signal/Noise)比例(信噪比)：“样本与空白对照的信号值的比”大于2为检出。

3、灵敏度测定

检测本发明的检测的灵敏度。实验时，将miRNA-375稀释至0.1～10pM进行检测、设置空白组作为对照。

结果如表3。

表3

根据表3结果可见，利用上述设计的检测试剂针对miRNA-375进行检测，在miRNA浓度低至0.1pM时，仍有理想的信噪比。因此，miRNA-375检测灵敏度达0.1pM。

加长延长DNA和延长RNA探针到2000nt时，其灵敏度大约达到0.01pM。

4、特异性测定

检测本发明的检测的特异性。实验时，将miRNA-375及其变异体miRNA-375-T1、miRNA-375-T2稀释至100pM进行检测，结果如表4。

表4

根据表4可见，本发明针对miRNA-375设计的检测试剂，对于miR375具有很高的特异性，对于变异体miRNA-375-T1、miRNA-375-T2则呈现阴性，特异性非常理想。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州德同生物技术有限公司

<120> 基于杂交捕获及酶保护的microRNA高通量检测方法及试剂盒

<130> 20A052

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cagcagcaau ucauguuuug aa 22

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> 茎环探针

<400> 2

gttgacgttc aaaacatgaa ttgctgctgc tcgacaac 38

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(120)

<223> 延长DNA探针

<400> 3

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 60

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgag 120

<210> 4

<211> 120

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(120)

<223> 延长RNA探针

<400> 4

cucgacaggu uucccgacug gaaagcgggc agugagcgca acgcaauuaa ugugaguuag 60

cucacucauu aggcacccca ggcuuuacac uuuaugcuuc cggcucguau guugugugga 120

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 突变miRNA

<400> 5

cagcagcaau ucaugucuug aa 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 突变miRNA

<400> 6

cagcaucaau ucauguuuug aa 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

uuuguucguu cggcucgcgu ga 22

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> 茎环探针

<400> 8

gttgacgtca cgcgagccga acgaacaaac tcgacaac 38

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(120)

<223> 延长DNA探针

<400> 9

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 60

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgag 120

<210> 10

<211> 120

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(120)

<223> 延长RNA探针

<400> 10

cucgacaggu uucccgacug gaaagcgggc agugagcgca acgcaauuaa ugugaguuag 60

cucacucauu aggcacccca ggcuuuacac uuuaugcuuc cggcucguau guugugugga 120

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 突变的miRNA

<400> 11

uuuguucguu cggcucucgu ga 22

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 突变的miRNA

<400> 12

uuuguccguu cggcucgcgu ga 22