一种浓缩海带渣蛋白的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物化工加工领域，特别是涉及一种浓缩海带渣蛋白的方法及其应用。

背景技术

目前从植物原料中浓缩蛋白质的方法已较为成熟，大豆浓缩蛋白已成为水产配合饲料中重要的原料之一。大豆浓缩蛋白的生产方法主要有稀酸沉淀法、酒精洗涤沉淀法、湿热水洗法、酸浸醇析法和膜分离法等。这些方法共同的特点是：首先用一定的方法(如加热、加酒精)将大豆粉中的蛋白质沉淀出来，然后将体系中的可溶性成分分离出去，从而达到提高蛋白质含量的目的。

海带渣是从生产海藻酸钠的废水中分离出来，经过脱水、干燥、粉碎后制成的墨绿色的粉末状固体。海带渣中含有20％左右的粗蛋白，30％的粗纤维，20％左右的粗灰分。海带渣目前已被应用于畜禽饲料中，但是受味道和营养成分的影响，使用量仅占饲料原料总量的5％以下。目前已有关于酶解海带渣的报道，多是联合采用纤维素酶和蛋白酶进行酶解，提高养殖动物对其营养素的消化吸收。但粗纤维含量高、粗蛋白含量低仍是限制海带渣规模化利用的关键因子。与豆粕(蛋白含量45％)不同，海带渣中的蛋白质含量较低(20％)，常规浓缩方法得到的产品蛋白质含量仍不能满足需求。因此提供一种提高海带渣蛋白含量的浓缩方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种浓缩海带渣蛋白的方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法充分利用了蛋白质“碱溶酸沉”的物理特性，辅以超声、酶解处理工艺，打破海带细胞壁，进一步释放蛋白质，提高蛋白质的溶出率，提高粗蛋白含量至60％以上，有效扩大了海带渣蛋白的使用范围。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种浓缩海带渣蛋白的方法，包括对海带渣同步进行碱溶、生物酶酶解和超声波处理提取海带渣蛋白的步骤。

进一步地，具体步骤如下：

(1)向海带渣样品中加水得海带渣液，之后加入碱性纤维素酶和表面活性剂，并调pH至8.5-9.5，进行超声提取；

(2)提取结束后，收集提取液，之后调提取液pH为3.0-4.0，静置沉淀后，将得到的沉淀浓缩，获得海带渣蛋白。

进一步地，在步骤(1)中，所述海带渣样品与水的料液比为(1-5)kg：(1-3)L；所述碱性纤维素酶和所述表面活性剂的添加量占所述海带渣样品的质量百分比均为0.2-0.5％。

进一步地，所述碱性纤维素酶包括碱性纤维素酶E-L，所述碱性纤维素酶E-L的酶活为20U/g；所述表面活性剂包括月桂醇硫酸钠。

进一步地，在步骤(1)中，所述超声提取条件具体为：超声波功率密度为0.35-0.5W/cm

进一步地，在步骤(2)中，所述静置沉淀的时间为30-40min；沉淀浓缩之前，先将得到的沉淀调为中性。

进一步地，所述沉淀浓缩具体为：将沉淀干燥至含水量为8-12％。

本发明还提供一种所述方法制得的海带蛋白。

本发明还提供一种所述的海带蛋白在畜牧饲料中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

①设计科学、工艺合理，充分利用了蛋白质“碱溶酸沉”的物理特性，辅以超声、酶解处理工艺，打破海带细胞壁，进一步释放蛋白质，提高蛋白质的溶出率，采用本发明浓缩海带渣，粗蛋白含量能提高至60％以上，有效扩大了海带渣蛋白的使用范围。

②操作简便，提取率高。本发明选用碱性纤维素酶E-L，将碱溶、酶解、超声处理三道工序融合在一起，减少了反应步骤和时间，操作简便。

③无需特殊设备。本发明将搅拌罐作为反应釜，利用搅拌罐自带的加热功能调节反应温度，将超声波发生装置置于反应体系中心位置，碱溶、酶解、超声波破碎三种反应集中到同一个反应釜中，不需要其它特殊设备。

④产品多样性。本发明在浓缩海带渣蛋白质后的剩余物质中，纤维素的含量高达50％，可被进一步开发利用。

⑤酶解效率高。本发明选用了来自枯草芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶E-l，该酶是大分子量酶，不受表面活性剂SDS的影响，且反应温度及pH要求与本方法基本吻合。

⑥超声波处理经济性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：超声+酶解前后海带渣物性变化；左：处理前，右：处理后；

图2：超声+酶解处理前后海带渣微观结构的变化；左：处理前，右：处理后；

图3：不同浓缩方法对产品得率的影响；

图4：不同的碱性纤维素酶对产品得率的影响；

图5：不同的超声波功率及不同的提取时间对产品得率的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

1材料与方法

1.1材料与试剂及仪器设备

原料：碱性纤维素酶E-L和碱性纤维素酶E-H均来自于产碱性纤维素酶的芽孢杆菌KSM-635，碱性纤维素酶celA和celB均来自枯草芽孢杆菌N-4，(实验室自制，可常规市售获得)、月桂醇硫酸钠(CR，国药集团上海有限公司)、NaOH(CR，国药集团上海有限公司)、HCl(CR，国药集团上海有限公司)。

仪器：搅拌罐(100L，江苏亿昂环保科技有限公司)、超声波发生器(AK1241200mm，深圳福洋科技有限公司)、干燥箱(101-1AB，天津泰斯特仪器有限公司)、电子显微镜(CX-33,奥林巴斯)。

1.2方法

1.2.1一种浓缩海带渣蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)称取提取过褐藻酸钠的海带剩余物(海带渣)500kg(含水量在40％左右)，加入300L水，置于1m

(2)向搅拌罐中加入1.6kg碱性纤维素酶E-L(20U/g)，1.6kg月桂醇硫酸钠(纯度为10％)，并使用0.1M的NaOH调节反应体系的pH为8.5-9.5，搅拌混匀。同时将超声波发生器置于搅拌罐中心位置，调节超声波发生器工作频率为20kHz，功率密度0.35W/cm

(3)结束反应后，打开搅拌罐，移出超声波发生器，并打开搅拌罐底部的阀门，收集液体。并用水反复冲洗2次，合并液体；

(4)将合并的液体置于1m

1.2.2观察超声+酶解处理前后海带渣变化

1.2.2.1观察超声+酶解处理前后海带渣物性变化

对处理前后的海带渣混合物进行拍照，如图1，左图为海带渣进行超声波及碱性纤维素蛋白酶处理前，右图为海带渣进行超声波及碱性蛋白酶纤维素处理后(超声0.35w/cm

采用电子显微镜观察图1中处理前后的海带渣混合物的微观结构，结果如图2，左：处理前，右：处理后(超声0.35w/cm

1.2.3优化浓缩海带渣蛋白反应工艺

1.2.3.1优化浓缩方法

以产品得率为指标，验证不同浓缩方法的效果。以1.2.1的方法为本方法，在此方法基础上去除酶解和超声处理，为碱溶酸沉方法；在本方法基础上去除超声处理，为酶解+碱溶酸沉方法；在本方法基础上去除酶解处理，为超声+碱溶酸沉方法；检测以上4种浓缩方法获得的产品得率及最终产物中粗蛋白含量。

产品得率：最终产物的干物质重量/初始海带渣的重量×100；

粗蛋白含量：采用GB/T6432方法检测；

粗蛋白含量为60％的得率：得率×产物中粗蛋白含量(％)/60％。

结果如表1，四种方法处理后，均能提高最终产物中的粗蛋白含量。本方法的处理效果优于其它三种方法，酶解+碱溶酸沉的方法优于超声波+碱溶酸沉的方法。

表1

将最终产品中蛋白质含量折算为60％进行比较，结果如图3，显示超声波及碱性纤维素酶均可提高最终产品的得率，酶解+碱溶酸沉的方法优于超声波+碱溶酸沉的方法，本方法采用酶解+超声波+碱溶酸沉的方法明显优于其它三种方法。

1.2.3.2碱性纤维素酶单因素实验

以产品得率(以产物粗蛋白含量为60％计算)为测定指标，对碱性纤维素酶种类进行单因素实验，设置碱性纤维素酶分别为碱性纤维素酶E-L、碱性纤维素酶E-H、碱性纤维素酶celA、碱性纤维素酶celB，按照1.2.1方法分别比较四种碱性纤维素酶对产品得率的影响。

结果如图4所示，来自枯草芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶E-L和E-H的酶解效果显著优于来自枯草芽孢杆菌N-4的celA和celB，且E-L优于E-H。

1.2.3.3优化超声波功率及反应时间

为探究不同的超声波功率及不同的提取时间(反应时间)对产品得率(以产物粗蛋白含量为60％计算)的影响，按照1.2.1方法分别比较两种超声波功率密度0.35W/cm

结果如图5，结果表明在提取的前60分钟内，随着时间的延长，提取率逐步提高，但超过60分钟后，提取率基本稳定；较大的功率密度(0.5w/cm

综合上述，本发明在传统的“碱溶酸沉”工艺基础上进行了改进，在碱溶过程中集成了纤维素酶解及超声波处理工艺，超声技术将海带渣中的细胞壁破碎，然后利用碱性纤维素酶在碱性条件下进一步破坏海带纤维，提高海带蛋白的溶出率，之后采用稀酸沉淀，得到蛋白质浓缩物，将海带渣中的粗蛋白从20％左右浓缩到60％以上，有效扩大了海带渣蛋白的使用范围。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。