一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法

技术领域

本发明属于食品快速检测技术领域，具体涉及一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法。

背景技术

目前，国内外关于烟酸的检测方法主要有：微生物法、高效液相色谱法、超高效液相色谱 -串联质谱法、酶联免疫吸附法等。

相对于其他方法，微生物发具有较高的灵敏度，且可检测具有生物活性的烟酸。我国食品安全国家标准亦将微生物法作为烟酸的首选方法和仲裁方法。但现有的微生物法存在以下几点问题：

1、在菌种使用方面，将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC 8014) 转接至琼脂培养基活化保存为储备菌株后，需每月传种一次。试验前需将储备菌株转接斜面培养24h重新活化，再使用乳酸杆菌肉汤培养基培养18h后，离心洗脱数次、调整菌浓度制成接种液。试验过程容易造成菌株污染，且工作量大，时效性差。

该方法虽然将菌浓度和培养时间控制在一定范围内，但是由于不同代数的菌株活力不同，使用相同的菌浓度和培养时间不适用于不同代数菌株的生长。菌的生长规律也存在一定的偏差，无法有效的控制试验结果的稳定性。

2、样液的制备方面，样品需要经过多步灭菌、调pH值、稀释，分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL试样提取液至试管中,补水至5.0mL,加入5.0mL烟酸测定用培养液。

制备过程用到大量的玻璃器皿，对器皿清洗要求高。试验操作繁琐、耗时长，无法满足大批量样品的检测需求。并且试验过程容易出现人为误差，导致试验结果不稳定。

3、单个样品的培养需要用到至少60mL培养基，分装至12根玻璃试管。成本高，且需要足够的空间培养。

4、测定方面，现有方法需将培养液混匀后，转移至比色皿，使用分光光度计进行读数。每个样品需测量12个数据，且由于培养液中菌处于活动状态，因此容易造成数据不稳定，操作繁琐且测定时间长。

5、试验成本方面，以100个样计，现有方法以两名实验人员计算，耗时35天以上、耗材约1.5万元。

综上所述，现有微生物法检测烟酸存在操作繁琐、测定时间长、对人员要求较高，不易掌握，易污染、重现性差，无法满足大批量样品快速检测的需求等问题。

虽然中国专利CN201010277447.5公开了一种测定维生素H的生物学检测方法，通过维生素H浓度的对数值与生长圈直径的线性关系，建立一种快速简便检测维生素H含量的方法。但是，仍然存在以下问题：

2、在进行试验前，需配置菌悬液，且菌悬液配置时间较长，一般为3天，检测效率低；

3、采用的储备菌液，须反复活化传代，影响实验结果；

5、培养皿中培养基含量为25mL，培养基厚度大，不利于菌的生长扩散，且生长圈不易观察测量；同时采用的是覆盖法：培养基厚度大，透光性不强，模糊不易测量；

6、培养时间为2天，时间较长。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法。

本发明的技术方案为：

一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，33-39℃培养20-28 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含甘油的烟酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，- 70℃冻存备用；

S2.制备测定用平板；配制一定量的烟酸测定用培养基，加入琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至50-60℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度在设定的OD

S3.制备标准溶液；

S4.制备样液；

S5.制备标准曲线及烟酸含量的测定；

制备标准曲线：将无菌牛津杯放入烟酸测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33-39℃恒温培养箱中培养20-28h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以烟酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；

烟酸含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33-39℃恒温培养箱中培养20-28h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中烟酸的含量。

本发明是利用微生物的特异性，给予一定的营养条件或改变微生物的生存环境，通过其生长繁殖和代谢表达来完成对单一维生素成分的测定。虽然现有技术中微生物法已经非常成熟，利用微生物本身对生存环境极为敏感，且其特异性表达决定了微生物法检出限低、灵敏度高、结果可靠的优点，但同时也因为微生物易染菌、特异性强造成了其具有培养周期长、重现性差等缺点。尤其是活化培养及分离，不论传统方法或现代检测技术，受检测灵敏度的限制，经前处理后多需经过活化培养、选择性分离后方可用于后续检测分析。传统微生物检测中上述两个步骤耗时长达24-96h，为整个检测流程中的关键限速步骤。

本发明中，通过将植物乳杆菌的冻干菌株活化传代后，利用甘油将同一批次储备菌株分装冻存到菌株保存管中，可长时间保持菌株的活力，节省了菌种制备的时间，简化了实验操作，有效降低了污染的概率；并且，由于同一批次分装的菌株活力基本一致，制备平板时无须重复测定。有效控制试验菌株的活力，保证了试验的稳定性，简化了实验操作，避免交叉污染。另外，制备的平板相当于特异性检测试剂盒，保存时间长，试验前现取现用，节省了检验时间，有效提高了检测效率解决了传统微生物法试验周期长、操作复杂的问题，极大缩短了检测时间。

进一步的，步骤S1中，所述营养缺陷型菌株为植物乳杆菌。本发明中，烟酸是植物乳杆菌生长所必须的营养素，根据分子扩散的原理，利用杯碟法使烟酸在含植物乳杆菌的特异性培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度烟酸的球形区。植物乳杆菌在无烟酸的培养基区域无法生长繁殖，在含烟酸的培养基区域生长繁殖而呈现浑浊的生长圈。在一定浓度范围内，植物乳杆菌生长圈的大小与烟酸浓度呈线性关系。

进一步的，步骤S1中，加入含10-30%甘油的烟酸测定用培养基。

本发明中，通过添加10-30%甘油，利用甘油保护菌种，节省菌种制备时间，简化试验操作，同时菌种活力更稳定，保证了试验的有效性。

进一步的，步骤S2中，所述烟酸测定用培养基中琼脂的浓度为0.5%-2%。

本发明中，通过控制测定用平板中琼脂的特定比例，为植物乳杆菌提供适宜的生长条件，保证菌在测定用平板中有效生长，保证了试验的有效性；同时，琼脂可作为凝固剂将液体培养基转化为凝固态培养基，方便后续测试。

进一步的，步骤S2中，使培养基中菌浓度OD

本发明中，通过控制培养基与菌株储备液在特定比例，可通过OD

本发明中，通过大量创造性试验，发现在600nm光波长下，可以有更加快速准确地获得菌株储备液在培养基中浓度的真实值，避免造成实验误差，可保证实验结果的准确度。

进一步的，步骤S2中，分装于无菌培养皿内，每皿10-15mL。

本发明中，通过预先制备测定用平板，保存于2-4℃环境下，试验前按量取用，简化试验操作，节省了检验时间，有效提高了检测效率。

进一步的，步骤S3中，包括精确称取烟酸标准品，用蒸馏水稀释成1ug/mL的标准工作液，121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；使用无菌水稀释成50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL的标准溶液，备用。

进一步的，步骤S4中，包括取待测样品1g，加入40mL蒸馏水，充分混匀；121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；根据样品中烟酸的浓度稀释至标准曲线范围内，备用。

进一步的，步骤S5中，牛津杯的加样量为100-300uL。

进一步的，步骤S5中，标准曲线的制备和烟酸含量的测定采用同一批次步骤S2中制备的平板，并同时进行检测。

需要强调的是，虽然国标的微生物法中公开了本申请采用的植物乳杆菌，但是其测试原理与本申请完全不同。虽然现有技术中公开了生长圈测试的原理，但本领域中，并没有公开采用不同菌类进行生长圈测试的方案。需强调的是，本发明的技术方案，不是随机选取，是发明人通过大量创造性试验获得的，取得的技术效果是意想不到的。

特别的，本申请的检测方法，同样适用于采用其他对烟酸具有特异性菌类（营养缺陷型菌株）进行检测，适用范围广。其他特异性菌类（营养缺陷型菌株）的筛选方法如下：取1mL不同的样液分别涂布至MRS培养基和补充培养基（预先加入烟酸标液的MRS培养基）中培养一定时间，观察两种培养基上细菌生长速率和形态的差异，挑选差异明显的单菌落于含烟酸的烟酸测定培养基中进行验证，选择验证有效的菌进行鉴定。

同时，针对不同类型的检测样品，可通过农产品、乳粉等富含维生素成分的自然污染样品获得本发明的营养缺陷型菌株，可以进一步的提高检测的特异性和灵敏度，使得检测平板对于对应的特定产品，拥有更低浓度的检出限。

另外，与在分光光度计下检测透光率需要重复确认相比，本申请的检测实验要求较低，实验误差可控，检测效率明显提高，同时不会受到检测过程中分光光度计设备稳定性的影响，检测灵敏度和重现性更好。

另外，本领域的研发不同于其他领域，研发并非纯粹的开拓性研究，往往都需要建立在现有技术的基础上，借助于现有技术已有成果的指引进行相应的探索和研发，对于本领域技术人员而言，是无法通过有限次实验获得的本申请技术方案的。

本发明的有益效果在于：

1、将植物乳杆菌的冻干菌株活化传代后，利用甘油将同一批次储备菌株分装冻存到菌株保存管中，可长时间保持菌株的活力，节省了菌种制备的时间，简化了实验操作，有效降低了污染的概率。

2、取其中一管储备菌株进行测定，确定该批次菌株储备液的制备平板所需添加量。由于同一批次分装的菌株活力基本一致，制备平板时无须重复测定。有效控制试验菌株的活力，保证了试验的稳定性，简化了实验操作，避免交叉污染。

3、在烟酸测定用培养基中加入琼脂粉，121℃灭菌5min，冷却后，加入适量的菌株储备液制成平板， 2-4℃保存备用，平板可保存30天。试验前现取现用，节省了检验时间，有效提高了检测效率。

4、样品初步稀释后灭菌。使用无菌水稀释一定倍数至无菌离心管中，加样至牛津杯中。无须使用大量的器皿，离心管和牛津杯均为一次性使用，避免了测试中的交叉干扰，制备过程简单快速，适用于大批量样品的检测。

5、单个样品最多只需15mL培养基，于一个培养皿中培养，成本低且占用空间少。

6、测定方面，使用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定生长圈直径。测量速度快且数据稳定。

7、试验成本方面，以100个样品， 1名实验人员计算，耗时约2天，耗材约1000元。

本发明采用杯碟法建立烟酸的快速测定方法，克服传统微生物法的检测缺陷，操作简单，效率高，成本低，重现性好，结果稳定，适用于大批量样品的检测需求。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法，采用的仪器设备与试剂包括：

1、仪器设备：抑菌圈测量仪，灭菌锅、一次性培养皿（无菌），超净工作台，培养箱36℃，菌株保存管（1.5mL）,移液枪20-200μL 和100-1000μL，移液枪头20-200μL和100-1000μL（灭菌），50mL离心管，1.5mL离心管（灭菌）。

2、试剂：（1）植物乳杆菌（Lactobacillus leichmannii ATCC 8014），市售；（2）烟酸标准品，市售；（3）烟酸测定用培养基，含有除烟酸外，植物乳杆菌生长所需要的其他营养物质，市售；（4）无菌水，自制。

包括以下步骤：

1、菌株储备液的制备：

将植物乳杆菌的冻干菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，36℃培养24 h。再转种3代增强活力。将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀。重复洗脱3次，确保无残留培养基。加入含20%甘油的烟酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，- 70℃冻存备用。

2、测定用平板的制备：

配制一定量的烟酸测定用培养基，加入1%的琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至55℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中植物乳杆菌浓度OD

3、标准曲线的制备：

精确称取适量烟酸标准品，用蒸馏水稀释成1ug/mL的标准工作液，121℃灭菌5min，迅速冷却至室温。使用无菌水稀释成50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL的标准溶液，备用。

4、样液的制备：

取待测样品1g，加入40mL蒸馏水，充分混匀。121℃灭菌5min，迅速冷却至室温。根据样品中烟酸的浓度稀释至标准曲线范围内，备用。

5、烟酸含量的测定：

将无菌牛津杯放入烟酸测定用平板中，分别移取200uL标准曲线溶液和样液于各牛津杯中，另移取200uL无菌蒸馏水空白对照组。一式3份。将平板正置于36℃恒温培养箱中培养24h。测量各溶液的菌株生长圈的直径。

以烟酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品中烟酸的含量。

实施例2

一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，39℃培养28 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含30%甘油的烟酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，- 70℃冻存备用；

S2.制备测定用平板；配制一定量的烟酸测定用培养基，加入2%的琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至60℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度OD

S3.制备标准溶液；

S4.制备样液；

S5.制备标准曲线及烟酸含量的测定；

制备标准曲线：将无菌牛津杯放入烟酸测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于39℃恒温培养箱中培养28h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以烟酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；

烟酸含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于39℃恒温培养箱中培养28h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中烟酸的含量。

进一步的，步骤S1中，所述营养缺陷型菌株为植物乳杆菌。

进一步的，步骤S2中，分装于无菌培养皿内，每皿15mL。

进一步的，步骤S3中，包括精确称取烟酸标准品，用蒸馏水稀释成1ug/mL的标准工作液，121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；使用无菌水稀释成50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL的标准溶液，备用。

进一步的，步骤S4中，包括取待测样品1g，加入40mL蒸馏水，充分混匀；121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；根据样品中烟酸的浓度稀释至标准曲线范围内，备用。

进一步的，步骤S5中，牛津杯的加样量为300uL。

进一步的，步骤S5中，标准曲线的制备和烟酸含量的测定采用同一批次步骤S2中制备的平板，并同时进行检测。

实施例3

一种食品和乳品中烟酸高通量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，33℃培养20 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含10%甘油的烟酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，- 70℃冻存备用；

S2.制备测定用平板；配制一定量的烟酸测定用培养基，加入0.5%的琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至50℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度OD

S3.制备标准溶液；

S4.制备样液；

S5.制备标准曲线及烟酸含量的测定；

制备标准曲线：将无菌牛津杯放入烟酸测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33℃恒温培养箱中培养20h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以烟酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；

烟酸含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于33℃恒温培养箱中培养20h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中烟酸的含量。

进一步的，步骤S1中，所述营养缺陷型菌株为植物乳杆菌。

进一步的，步骤S2中，分装于无菌培养皿内，每皿10mL。

进一步的，步骤S3中，包括精确称取烟酸标准品，用蒸馏水稀释成1ug/mL的标准工作液，121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；使用无菌水稀释成50、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL的标准溶液，备用。

进一步的，步骤S4中，包括取待测样品1g，加入40mL蒸馏水，充分混匀；121℃灭菌5min，迅速冷却至室温；根据样品中烟酸的浓度稀释至标准曲线范围内，备用。

进一步的，步骤S5中，牛津杯的加样量为100uL。

进一步的，步骤S5中，标准曲线的制备和烟酸含量的测定采用同一批次步骤S2中制备的平板，并同时进行检测。

实验效果验证：

1、标准曲线；通过实施例1的方法，获得的烟酸标准品浓度的对数值和生长圈直径如下表1所示，并以此为基础，绘制标准曲线（如下表所示）：

表1烟酸标准曲线

烟酸浓度在50~500ng/mL范围内，烟酸浓度对数值与生长圈直径线性关系良好，线性回归方程为Y = 8.1069X +0.1028，相关系数R² = 0.9974。标准曲线各点的偏移较小，结果稳定。

2、精密度试验；

以SRM 1869a 质控样品的烟酸含量为基准，进行6次平行试验；并与国标法（GB5009.89-2016 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定）的测定结果进行比较，结果如下表2所示

表2杯碟法与国标法测定SRM 1869a 中烟酸含量的比较

由SRM 1869a说明书可知，该样品中烟酸含量为(99.5±4.4)mg/100g，2种方法所测结果(表2)都与标示值相符，满足要求，方法的准确性良好。相对于国标法，杯碟法结果更准确，平行测试的相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)较小。

3、重复性试验

随机选取5种不同的样品，对每个样品进行6次重复性试验。由表3可知，5种不同样品中烟酸含量的RSD均小于5%，表面该方法具有重复性良好。

表 3 杯碟法的重复性试验结果

4、同一批次分装的菌株活力测试

采用本发明方法，从同一批次分装的菌株冻存管中随机取十根，分别吸取1mL菌液，稀释一定倍数，使用MRS平板培养基，在一定条件下培养后，对平板上菌落进行计数。结果如下表所示：

表4菌株活力测试试验结果

结果表明，同一批次分装的菌株冻存管经培养后菌落总数基本一致，采用同一批次分装的菌株活力基本一致。

5、平板检测有效性测试

采用本发明方法制备测定用平板，2-4℃保存，分别在0、5、15、20、25、30天使用该批次平板测定SRM 1869a 质控样品中的烟酸含量。结果如下表所示：

表5平板有效性测试试验结果

结果表明，测定用平板保存30天期间，烟酸测定结果偏差可控，证明此时间内，测定用平板有效，因此，保存期限可达30天。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。