一种检测抗Ri抗体的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和抗体检测技术领域，具体涉及一种检测抗Ri抗体的试剂盒及其应用。

背景技术

副肿瘤神经综合症是一种严重的致残性的神经系统免疫病，该病对免疫治疗有效，但其早期诊断非常关键，及时的确诊和治疗有助于改善患者神经功能，延长患者生命。目前该病的诊断主要依据副肿瘤神经综合症相关的抗神经抗体，抗体阳性可作为确诊依据。副肿瘤性小脑性共济失调是副肿瘤神经综合症中较常见的一种，抗小脑浦肯野细胞抗体检测阳性是诊断副肿瘤性小脑性共济失调的主要依据。抗Ri抗体是副肿瘤性小脑性共济失调的诊断性抗体之一，而NOVA1与NOVA2两种蛋白是抗Ri抗体针对的抗原。目前临床应用的抗Ri抗体的检测试剂主要是商品化的免疫印迹法试剂盒，抗原为NOVA1，未包括NOVA2，抗原覆盖不全面；另外，免疫印迹法只能检测针对抗原线性表位的抗体，在检测准确性，包括特异性和敏感性方面存在不足。

目前，在国内、外的临床神经免疫实验室，抗体检测的主流方法和检测实验平台正在逐步升级为以转染细胞为底物的间接免疫荧光方法(IIF)，即以基于细胞的检测(CBA)，CBA可以表达具有三维结构的抗原表位，对抗体检测具有更高的准确性。然而，目前市售试剂没有基于CBA法的同时覆盖NOVA1与NOVA2两种抗原的试剂，急需研发对应的技术与产品。

现有技术的缺点：(1)抗原为NOVA1，未包括NOVA2，抗原覆盖不全面；(2)免疫印迹法只能检测针对线性表位的抗体，不能检测识别抗原的构象或者三维结构表位；(3)不适合目前主流的基于细胞的检测(CBA)的检测实验平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CBA法的同时覆盖NOVA1与NOVA2两种抗原的检测试剂。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种细胞爬片组件，包含表达NOVA1和NOVA2的细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述NOVA1的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，所述NOVA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述NOVA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述NOVA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施方式中，所述细胞爬片组件还包括：固定液、封闭液、通透液、洗涤液。

在本发明的一些实施方式中，所述固定液为多聚甲醛、可使用无水乙醇、丙酮、其他浓度的多聚甲醛溶液或任何商业化的细胞固定液。

在本发明的一些实施方式中，所述通透液为0.1～2％Triton X-100的PBS溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述洗涤液为PBS和/或吐温。

在本发明的一些实施方式中，所述封闭液包含0.01～0.5％叠氮钠、0.2～5％胎牛血清、0.1～2％Triton X-100的PBS溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述稀释液包含0.01～0.5％叠氮钠、0.2～5％胎牛血清、0.1～5％Triton X-100的PBS溶液。

上述固定液、通透野、洗涤液、封闭液等可以替换为本领域常用的其他试剂，本发明并不对此进行特殊限定。

本发明的第二方面，提供本发明第一方面检测抗Ri抗体的试剂盒用的细胞爬片组件的制备方法，包含以下步骤：

S11：分别构建表达NOVA1、NOVA2的质粒；

S12：将步骤S1中的质粒同时转染细胞，固定、通透、封闭，即得。

在本发明的一些实施方式中，步骤S12中具体操作包括：将细胞接种至培养系统中，当细胞达到合适的转染密度时，将步骤S11中的表达NOVA1的质粒和表达NOVA2的质粒共同转染细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述质粒载体为真核生物表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述表达NOVA1的质粒和表达NOVA2的质粒的摩尔比为1:(1～10)；若超过了则不利于阳性结果的判读。

在本发明的一些优选实施方式中，所述表达NOVA1的质粒和表达NOVA2的质粒的摩尔比为1:1。

本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的细胞爬片组件。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、稀释液、二抗、封闭液中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述阳性对照为阳性病人血清。

在本发明的一些实施方式中，所述阴性对照为健康人血清。

本发明的第四方面，提供本发明第二方面所述的细胞爬片组件或本发明第三方面所述的试剂盒在非诊断目的检测抗Ri抗体或制备检测抗Ri抗体的产品中的应用。

本发明的第五方面，提供本发明第四方面所述试剂盒的使用方法，包含以下步骤：

S21：将细胞爬片组件与样本混合孵育；

S22：对步骤S21孵育完成后的细胞加入二抗孵育，荧光显微镜观察。

在本发明的一些实施方式中，所述样本包括：血清、脑脊液。

本发明的有益效果是：

本发明提供了检测抗Ri抗体的试剂盒，该试剂盒中包含检测抗Ri抗体的试剂盒用的细胞爬片组件，所述细胞爬片组件包含NOVA1和NOVA2抗原的转染细胞，覆盖抗原表位更加完整、全面。试剂盒采用基于转染细胞的检测方法(CBA)以识别靶抗原的三维结构表位；更加适用于采用目前主流抗体检测技术平台的临床检验实验室，特异性强、灵敏度高，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为副肿瘤性小脑性共济失调患者组检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

试剂的购买来源

293T细胞系(SV40T转化的人胚肾细胞)：源井生物；Goat Anti-Human IgG H&L

实施例1

一种检测抗Ri抗体的试剂盒，包括：细胞爬片组件、固定液、封闭液、通透液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、二抗、样本稀释液、封片剂等。其中细胞爬片组件包含NOVA1和NOVA2抗原的转染细胞，固定液为多聚甲醛-PBS溶液；通透液为0.2％Trit on X-100溶液的PBS；洗涤液为PBS；封闭液为0.04％叠氮钠、2％胎牛血清、0.2％Tr iton X-100的PBS溶液；稀释液为0.04％叠氮钠、2％胎牛血清、0.2％Triton X-100的PBS溶液；阳性对照为阳性病人血清；阴性对照为健康人血清。

其中细胞爬片组件的制备方法包括以下步骤：

1、构建NOVA1/NOVA2质粒：

目的质粒克隆载体使用pLJM1-EGFP(addgene Plasmid#19319)载体(可以替换为任何真核生物表达载体)将其中eGFP的序列去除，在Kozak sequence后插入目的片段。NOVA1序列首先使用鼠源cDNA进行克隆，得到鼠源Nova1 DNA后，对其DNA进行点突变，使其符合人源氨基酸序列。NOVA2序列使用公共数据库中所注释人源氨基酸序列，结合密码子优化，化学合成全DNA序列；最终构建出使用的表达载体。

其中构建表达质粒A中NOVA1的DNA序列如下：

ATGATGGCGGCAGCTCCCATTCAGCAGAACGGGACCCATACGGGGGTTCCCATAGATCTGGACCCGCCGGACTCGCGGAAAAGGCCGCTTGAAGCGCCCCCTGAAGCCGGCAGCACCAAGAGGACCAACACGGGCGAAGACGGCCAGTACTTTCTAAAGGTTCTCATACCTAGTTATGCTGCTGGATCTATAATTGGGAAGGGAGGACAGACAATTGTTCAGTTGCAAAAAGAAACTGGAGCCACTATCAAGCTGTCTAAATCCAAAGATTTTTATCCAGGTACTACTGAGAGGGTTTGCTTGATCCAGGGAACAGTTGAAGCGCTGAACGCAGTTCATGGATTCATTGCAGAAAAAATCCGAGAAATGCCCCAAAATGTTGCCAAGACAGAACCAGTCAGTATCCTACAACCTCAGACCACCGTTAATCCTGATCGCATCAAACAAACATTGCCATCTTCCCCAACTACCACCAAGTCCTCTCCATCTGACCCCATGACCACCTCCAGAGCCAATCAGGTAAAGATTATAGTTCCCAACAGCACAGCAGGTCTGATAATAGGGAAGGGAGGTGCTACTGTGAAGGCTGTAATGGAGCAGTCAGGGGCTTGGGTGCAGCTTTCCCAGAAACCCGATGGGATCAACTTGCAAGAGAGGGTTGTCACTGTGAGTGGAGAACCTGAACAAAACCGAAAAGCTGTTGAACTTATCATCCAGAAGATACAAGAGGATCCACAGAGTGGCAGCTGTCTCAATATCAGTTATGCCAATGTGACAGGTCCAGTGGCAAATTCCAATCCAACCGGATCTCCTTATGCAAACACTGCTGAAGTGTTACCAACTGCCGCAGCAGCCGCAGGGCTATTAGGACATGCTAACCTTGCTGGCGTTGCGGCCTTTCCAGCAGTTTTATCTGGCTTCACAGGCAATGACCTGGTGGCCATCACCTCTGCACTTAATACATTAGCCAGCTATGGATATAATCTCAACACATTAGGTTTAGGTCTCAGCCAAGCAGCAGCAACGGGGGCTTTGGCTGCCGCAGCTGCCAGTGCCAACCCAGCAGCAGCAGCAGCCAATTTGTTGGCCACCTATGCCAGTGAAGCCTCAGCCAGCGGCAGCACGGCTGGTGGAACGGCGGGGACATTTGCATTAGGTAGCCTGGCTGCTGCTACTGCTGCAACCAATGGATACTTTGGAGCTGCCTCGCCCCTAGCTGCCAGTGCCATTCTAGGGACAGAGAAATCCACAGATGGATCAAAGGATGTAGTTGAAATAGCAGTTCCAGAAAACTTAGTTGGTGCAATACTTGGCAAAGGAGGGAAAACCTTAGTGGAATACCAGGAGTTGACTGGTGCAAGGATACAGATCTCCAAAAAGGGAGAATTCGTACCTGGCACAAGGAATCGGAAGGTAACCATTACTGGAACACCAGCTGCAACACAGGCTGCTCAGTATTTAATTACACAGAGGATCACATATGAGCAAGGAGTTCGGGCTGCCAATCCTCAGAAAGTGGGTTGA(SEQ ID NO.1)；

构建表达质粒B中NOVA2的DNA序列如下：

ATGGAGCCTGAGGCTCCTGATAGCAGGAAGAGACCCCTGGAGACCCCTCCTGAAGTGGTGTGTACCAAGAGAAGCAACACCGGGGAGGAGGGAGAGTACTTCCTGAAGGTGCTGATTCCCTCCTACGCCGCTGGAAGTATCATCGGAAAAGGCGGCCAGACAATCGTGCAGCTGCAGAAAGAAACCGGAGCCACCATCAAGCTGTCTAAGAGCAAGGACTTCTACCCCGGCACCACCGAAAGAGTGTGCCTGGTGCAGGGAACCGCTGAAGCTCTGAACGCTGTGCACTCTTTCATCGCCGAAAAGGTGAGAGAGATCCCCCAGGCTATGACCAAGCCCGAAGTGGTGAACATCCTGCAGCCTCAGACCACCATGAATCCCGACAGAGCCAAACAGGCCAAGCTGATCGTGCCCAATAGCACAGCCGGCCTGATCATTGGCAAAGGCGGAGCTACCGTGAAGGCTGTGATGGAACAGTCCGGAGCCTGGGTGCAGCTGTCTCAGAAACCAGAGGGAATCAACCTGCAGGAAAGAGTGGTGACCGTGAGCGGAGAGCCTGAACAGGTGCATAAGGCCGTGTCCGCTATCGTGCAGAAGGTGCAGGAGGACCCTCAGTCTAGCAGCTGTCTGAACATCAGCTACGCCAACGTGGCCGGACCAGTGGCTAATTCTAACCCCACAGGCAGCCCCTACGCCTCTCCTGCTGATGTGCTGCCTGCTGCTGCTGCTGCCTCTGCTGCTGCTGCTTCTGGACTGCTGGGACCTGCTGGACTGGCTGGAGTGGGAGCTTTTCCTGCTGCTCTGCCTGCTTTCTCTGGCACTGACCTGCTGGCTATTTCCACCGCTCTGAACACCCTGGCCTCCTATGGATATAACACAAACTCTCTGGGCCTGGGACTGAATTCCGCCGCTGCTTCTGGCGTGCTGGCTGCTGTGGCTGCTGGAGCTAATCCTGCTGCTGCCGCTGCTGCTAACCTGCTGGCTTCTTACGCCGGAGAGGCTGGAGCTGGACCTGCTGGCGGAGCTGCTCCTCCTCCTCCTCCCCCTCCTGGAGCTCTGGGATCTTTTGCTCTGGCCGCTGCTGCCAACGGATACCTGGGAGCTGGAGCTGGCGGAGGAGCTGGAGGAGGAGGAGGCCCTCTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGAGCCGCTGGAGGATTCCTGACAGCTGAAAAGCTGGCCGCCGAAAGCGCTAAGGAGCTGGTGGAAATCGCCGTGCCTGAGAATCTGGTGGGAGCTATTCTGGGCAAGGGAGGAAAGACACTGGTGGAGTATCAGGAACTGACCGGAGCCAGAATCCAGATCAGCAAGAAAGGAGAATTCCTGCCCGGAACCAGAAACAGGAGAGTGACAATCACAGGCAGCCCAGCCGCTACACAGGCTGCTCAGTATCTGATCAGCCAGAGAGTGACCTACGAGCAGGGAGTGAGAGCCTCAAACCCCCAGAAGGTGGGACTCGAGTGA(SEQ ID NO.2)；

构建表达人源NOVA1蛋白的表达载体质粒A，其氨基酸序列如下：MMAAAPIQQNGTHTGVPIDLDPPDSRKRPLEAPPEAGSTKRTNTGEDGQYFLKVLIPSYAAGSIIGKGGQTIVQLQKETGATIKLSKSKDFYPGTTERVCLIQGTVEALNAVHGFIAEKIREMPQNVAKTEPVSILQPQTTVNPDRIKQTLPSSPTTTKSSPSDPMTTSRANQVKIIVPNSTAGLIIGKGGATVKAVMEQSGAWVQLSQKPDGINLQERVVTVSGEPEQNRKAVELIIQKIQEDPQSGSCLNISYANVTGPVANSNPTGSPYANTAEVLPTAAAAAGLLGHANLAGVAAFPAVLSGFTGNDLVAITSALNTLASYGYNLNTLGLGLSQAAATGALAAAAASANPAAAAANLLATYASEASASGSTAGGTAGTFALGSLAAATAATNGYFGAASPLAASAILGTEKSTDGSKDVVEIAVPENLVGAILGKGGKTLVEYQELTGARIQISKKGEFVPGTRNRKVTITGTPAATQAAQYLITQRITYEQGVRAANPQKVG(SEQ ID NO.3)；

构建表达人源NOVA2蛋白的表达载体质粒B，其氨基酸序列如下：MEPEAPDSRKRPLETPPEVVCTKRSNTGEEGEYFLKVLIPSYAAGSIIGKGGQTIVQLQKETGATIKLSKSKDFYPGTTERVCLVQGTAEALNAVHSFIAEKVREIPQAMTKPEVVNILQPQTTMNPDRAKQAKLIVPNSTAGLIIGKGGATVKAVMEQSGAWVQLSQKPEGINLQERVVTVSGEPEQVHKAVSAIVQKVQEDPQSSSCLNISYANVAGPVANSNPTGSPYASPADVLPAAAAASAAAASGLLGPAGLAGVGAFPAALPAFSGTDLLAISTALNTLASYGYNTNSLGLGLNSAAASGVLAAVAAGANPAAAAAANLLASYAGEAGAGPAGGAAPPPPPPPGALGSFALAAAANGYLGAGAGGGAGGGGGPLVAAAAAAGAAGGFLTAEKLAAESAKELVEIAVPENLVGAILGKGGKTLVEYQELTGARIQISKKGEFLPGTRNRRVTITGSPAATQAAQYLISQRVTYEQGVRASNPQKVGLE(SEQ ID NO.4)。

2、制备检测抗Ri抗体的细胞爬片组件：将HEK293T细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中分别培养。按每孔一片，将使用多聚赖氨酸处理的细胞爬片预先铺在标准24孔细胞培养板中。将293T细胞系使用胰酶消化并细胞计数。按每孔10万种入铺有细胞爬片的标准24孔细胞培养板的每孔之中。细胞系达到50％汇合度时，使用商业化的转染试剂Lipofectamine

3、使用方法

检测抗NOVA1/NOVA2抗体方法：将放有预制的细胞爬片组件的24孔板从4度取出，每孔作为最小检测单元。检测开始前，吸去表面多余液体；将稀释(可使用0.04％叠氮钠、2％胎牛血清、0.2％Triton X-100的PBS溶液稀释；一般定量稀释浓度推荐为1:10，稀释浓度可根据实验需求调整)后将0.4ml稀释液覆盖细胞爬片组件，室温处理1小时。使用1mlPBS清洗3遍。使用0.4ml提前稀释的荧光二抗[0.04％叠氮钠，2％胎牛血清的PBS溶液；按照合理浓度稀释的商品化抗体，如1:500稀释的Goat Anti-Human IgG H&L

注：荧光二抗可替换为抗人IgG的带488、FITC基团等不同的荧光基团的二抗。

荧光显微镜下进行观察，合格的制品应该：①正常人血清样本对照中无背景或低背景；②明确阳性的血清样本染色结果中，40％-60％的细胞的细胞核有明显的阳性信号。

效果例

使用实施例1中的试剂盒进行副肿瘤性小脑性共济失调患者的诊断。其中包含3例抗Ri抗体(免疫印迹法)阳性的副肿瘤性小脑性共济失调患者的血清标本，以及3例抗Ri抗体(免疫印迹法)阴性的神经免疫病患者的血清作为对照组，检测结果见图1。

从结果可以看出，在3例抗Ri抗体(免疫印迹法)阳性的副肿瘤性小脑性共济失调患者的血清标本中，实施例1中的CBA法抗NOVA1/NOVA2抗体检测结果均为阳性，无漏诊病例。对于对照组的样本，本实施例1中的CBA法抗NOVA1/NOVA2抗体检测结果均为阴性，无假阳性结果；

综上，说明实施例1中试剂盒具有100％的特异性，可以用于检测待测血清中是否存在抗Ri抗体；也可以用于副肿瘤性小脑性共济失调患者的诊断。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。