一种siRNA递送用的外泌体的制备方法

技术领域

本发明涉及siRNA技术领域，具体涉及一种siRNA递送用的外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30-150nm的双层脂膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNA、miRNA等生物活性物质；外泌体(exosome)具有典型的脂质双分子层膜结构。外泌体具有类似于病毒的转染机制，在体内具有较高的转染效率，且它不仅具有细胞间信息传递的作用还能被开发运用于各类物质(包括siRNA)的细胞间传输。与传统的药物载体相比，外泌体作为一种新型的，天然药物载体，显示诸如生物相容性好、生物可降解、免疫原性小等优点。

现有技术中制备的外泌体采用的提取剂较为现有、提取性差，对其进行优化改进制备，提供一种提取效率高的siRNA递送用的外泌体的制备方法。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明提供了一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻1-2h，然后置于10-20℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量5-10％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1000-1500r/min的转速下进行离心处理10-20min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入10-20％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入20-30％的siRNA，最后加入5-10％的琼脂糖珠，于30-35℃下静置反应1-2h，得到siRNA递送用的外泌体。

优选地，所述预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以350-450r/min的转速搅拌20-30min，然后以2-5r/min的速率升至500-1000r/min，继续搅拌10-20min，搅拌备用，搅拌中保持35-40℃的恒温，且加入血液总量5-10％的分散剂。

优选地，所述分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比(3-6):1:(5-7)配制而成。

优选地，所述超声分散处理的功率为350-450W，超声时间为10-20min。

优选地，所述提取改性剂的制备方法为：

将5-10份PVP加入到10-15份壳聚糖溶液中，随后加入1-4份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1000-1500r/min，搅拌时间为15-25min，得到提取改性剂。

优选地，所述壳聚糖溶液的质量分数为5-10％。

优选地，所述改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨10-20min，研磨过30-40目，研磨结束，送入到质量分数5-7％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

优选地，所述盐酸溶液的质量分数为3-6％。

优选地，所述搅拌分散处理的转速为500-700r/min，搅拌时间为20-30min。

优选地，所述步骤五中反应处理的反应温度为38-42℃。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明的外泌体通过血液经过冷冻、再水浴解冻，为了在后续中更好的将外泌体提取出，通过预搅拌改性，可以配合提取改性剂，共同对外泌体的提取提供配合效果，预搅拌改性处理的具体操作方法为：先以350-450r/min的转速搅拌20-30min，然后以2-5r/min的速率升至500-1000r/min，继续搅拌10-20min，搅拌备用，搅拌中保持35-40℃的恒温，且加入血液总量5-10％的分散剂，分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比(3-6):1:(5-7)配制而成，通过分散剂的加入将血组成更均散，再提取改性剂的改性提取下，提取外泌体的效率更强，加入的改性二氧化硅具有表面积高，承载力和分散力强，能够优化提取改进效率；提取的外泌体在缓冲溶液中分散、siRNA、琼脂糖珠的制备配合，从而对siRNA递送承担载体，具有高效的制备效率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻1-2h，然后置于10-20℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量5-10％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1000-1500r/min的转速下进行离心处理10-20min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入10-20％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入20-30％的siRNA，最后加入5-10％的琼脂糖珠，于30-35℃下静置反应1-2h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以350-450r/min的转速搅拌20-30min，然后以2-5r/min的速率升至500-1000r/min，继续搅拌10-20min，搅拌备用，搅拌中保持35-40℃的恒温，且加入血液总量5-10％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比(3-6):1:(5-7)配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为350-450W，超声时间为10-20min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将5-10份PVP加入到10-15份壳聚糖溶液中，随后加入1-4份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1000-1500r/min，搅拌时间为15-25min，得到提取改性剂。

通过分散剂的加入将血组成更均散，在提取改性剂的改性提取下，提取外泌体的效率更强，加入的改性二氧化硅具有表面积高，承载力和分散力强，能够优化提取改进效率，壳聚糖能够提高二氧化硅的溶透效率，增强提取改性剂的提取改进效果，从而加强提取效果。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为5-10％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨10-20min，研磨过30-40目，研磨结束，送入到质量分数5-7％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

经过研磨后，纳米二氧化硅的粒径更细粒，同时经过盐酸分散后，分散性能增强，从而配合壳聚糖的效率进一步的加强。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为3-6％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为500-700r/min，搅拌时间为20-30min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为38-42℃。

实施例1.

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻1h，然后置于10℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量5％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1000r/min的转速下进行离心处理10min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入10％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入20％的siRNA，最后加入5％的琼脂糖珠，于30℃下静置反应1h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以350r/min的转速搅拌20min，然后以2r/min的速率升至500r/min，继续搅拌10min，搅拌备用，搅拌中保持35℃的恒温，且加入血液总量5％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比3:1:7配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为350W，超声时间为10min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将5份PVP加入到10份壳聚糖溶液中，随后加入1份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1000r/min，搅拌时间为15min，得到提取改性剂。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为5％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨10min，研磨过30目，研磨结束，送入到质量分数5％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为3％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为500r/min，搅拌时间为20min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为38℃。

实施例2.

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻2h，然后置于20℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量10％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1500r/min的转速下进行离心处理20min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入20％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入30％的siRNA，最后加入10％的琼脂糖珠，于35℃下静置反应2h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以450r/min的转速搅拌30min，然后以5r/min的速率升至1000r/min，继续搅拌20min，搅拌备用，搅拌中保持40℃的恒温，且加入血液总量10％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比6:1:7配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为450W，超声时间为20min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将10份PVP加入到15份壳聚糖溶液中，随后加入4份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1500r/min，搅拌时间为25min，得到提取改性剂。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为10％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨20min，研磨过40目，研磨结束，送入到质量分数7％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为6％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为700r/min，搅拌时间为30min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为42℃。

实施例3.

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻2h，然后置于20℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量10％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1500r/min的转速下进行离心处理20min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入20％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入30％的siRNA，最后加入10％的琼脂糖珠，于35℃下静置反应2h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以450r/min的转速搅拌30min，然后以5r/min的速率升至1000r/min，继续搅拌20min，搅拌备用，搅拌中保持40℃的恒温，且加入血液总量10％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比6:1:7配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为400W，超声时间为15min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将7.5份PVP加入到12.5份壳聚糖溶液中，随后加入2.5份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1250r/min，搅拌时间为20min，得到提取改性剂。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为7.5％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨15min，研磨过35目，研磨结束，送入到质量分数6％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为4.5％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为60r/min，搅拌时间为25min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为40℃。

实施例4.

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻1.2h，然后置于12℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量6％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1100r/min的转速下进行离心处理12min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入12％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入22％的siRNA，最后加入6％的琼脂糖珠，于32℃下静置反应1.2h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以360r/min的转速搅拌22min，然后以3r/min的速率升至600r/min，继续搅拌12min，搅拌备用，搅拌中保持36℃的恒温，且加入血液总量6％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比4:1:6配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为360W，超声时间为12min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将6份PVP加入到12份壳聚糖溶液中，随后加入2份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1200r/min，搅拌时间为17min，得到提取改性剂。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为6％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨12min，研磨过33目，研磨结束，送入到质量分数6％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为4％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为550r/min，搅拌时间为22min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为39℃。

实施例5.

本实施例的一种siRNA递送用的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将血液置于-10℃下冷冻1.8h，然后置于18℃的水浴条件下进行解冻处理，解冻完全；

步骤二：然后通过预搅拌改性处理，处理结束，得到待用体；

步骤三：向待用体中加入总量8％的提取改性剂，超声分散处理，处理结束，备用；

步骤四：再于1450r/min的转速下进行离心处理18min，离心结束、得到外泌体沉淀物；

步骤五：向外泌体沉淀物加入18％的PBS缓冲溶液，随后反应处理；

步骤六：然后向步骤五中加入28％的siRNA，最后加入5-10％的琼脂糖珠，于34℃下静置反应1.8h，得到siRNA递送用的外泌体。

本实施例的预搅拌改性处理的具体操作方法为：

先以420r/min的转速搅拌28min，然后以4r/min的速率升至600r/min，继续搅拌18min，搅拌备用，搅拌中保持38℃的恒温，且加入血液总量8％的分散剂。

本实施例的分散剂为海藻酸钠、柠檬酸、水按照重量比5:1:6配制而成。

本实施例的超声分散处理的功率为440W，超声时间为18min。

本实施例的提取改性剂的制备方法为：

将8份PVP加入到14份壳聚糖溶液中，随后加入3份改性纳米二氧化硅，搅拌混合充分，搅拌混合充分的转速为1350r/min，搅拌时间为22min，得到提取改性剂。

本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为8％。

本实施例的改性纳米二氧化硅的改性方法为：

将纳米二氧化硅送入到研磨机中研磨18min，研磨过38目，研磨结束，送入到质量分数6％的盐酸溶液中搅拌分散处理，搅拌充分，水洗至表面中性、干燥，得到改性纳米二氧化硅。

本实施例的盐酸溶液的质量分数为5％。

本实施例的搅拌分散处理的转速为600r/min，搅拌时间为28min。

本实施例的步骤五中反应处理的反应温度为41℃。

本发明的创新点在于，通过血液经过冷冻、再水浴解冻，为了在后续中更好的将外泌体提取出，通过预搅拌改性，可以配合提取改性剂，共同对外泌体的提取提供配合效果；通过分散剂的加入将血组成更均散，在提取改性剂的改性提取下，提取外泌体的效率更强，加入的改性二氧化硅具有表面积高，承载力和分散力强，能够优化提取改进效率；提取的外泌体在缓冲溶液中分散、siRNA、琼脂糖珠的制备配合，从而对siRNA递送承担载体，具有高效的制备效率。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。