一种流式平台外周血标本检测技术方法

技术领域

本发明涉及标本检测技术领域，具体为一种流式平台外周血标本检测技术方法。

背景技术

检验科作为临床科室的眼睛，不仅将医院、医师、护士的需求反馈给高校、科研机构和IVD企业，还可以将高校、科研机构、IVD企业的相关技术、方法和原理转化为临床医学检验技术，将基础研究内容和成果应用于检验，服务于临床。

在基础研究中已经有大量关于癌细胞信号传导通路蛋白和关键酶表达水平的研究，并且纯化了一些靶向治疗药物用于调节这些通路蛋白和关键酶的表达，从而实现抑制体外培养环境中和动物体内癌细胞的转移、侵袭和迁徙能力，目前，我们需要便捷快速的平台和方法将其应用于临床标本的检测，进而实现将这些基础研究成果向临床应用的转化。

Met-Flow检测技术自2020年出现以来，到目前为止其应用仅限于基础研究领域，国内尚无相关文献报道，有文献报道国外实验室对体外培养的细胞进行过该技术的检测，但是研究平台高端，技术难度大，而且患者体内的免疫细胞不同于体外环境中培养的细胞，很难在临床推广，本技术的发明实现了将Met-Flow技术在临床领域的应用，技术平台经典，操作便捷，出报告时间快速，结果精准，尤其是技术实现过程中条件的摸索，抗体浓度的选择，荧光种类的选择都是本发明的创新点，实现了该技术从免疫学角度为临床疾病的诊断，分级分期，治疗，预后判断，生存时间等提供了技术支持，更是实现了将已经成熟的基础研究成果在临床患者进行验证，为疾病特别是癌症的靶向治疗提供了更多思路。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种流式平台外周血标本检测技术方法，具备为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路等优点，解决了对体外培养的细胞进行过该技术的检测，但是研究平台高端，技术难度大，而且患者体内的免疫细胞不同于体外环境中培养的细胞，很难在临床推广的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，

1)首先取外周静脉血后用EDTA抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；

2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；

3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；

4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行Met flow检测；

5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部；

6)对细胞表面抗原以及细胞内部的代谢关键酶以及蛋白表达水平进行检测。

进一步，所述步骤2)中水平离心机的工作时间为10-12min且每分钟1400-1600r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状。

进一步，所述步骤3)中离心机的离心时间为8-10min，且每分钟800-1000r/min，来弃除上清。

进一步，所述步骤6)中细胞表面的抗原包括CD3、CD4、CD8、CD45、CD16、CD56、CD19和HLA-DR中的任意一种或多种。

进一步，所述步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：ACAC、IDH、G6PD、ASS1、HK1、CPT1A、GLUT1、PRDX2、ATP5A。

进一步，所述步骤4)中高剪切均质机的运作时间为14-16min，且转速为2600-2800r/min。

进一步，由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

进一步，所述抗体体系浓度的检测，首先基于SPR技术,利用Protein A与抗体Fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与Protein A结合的响应单位,建立标准曲线。

进一步，通过读取未知浓度抗体与Protein A芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

与现有技术相比，本申请的技术方案具备以下有益效果：

该流式平台外周血标本检测技术方法，该技术在临床的成熟应用能够将大量基础研究中涉及的代谢蛋白和关键酶的检测应用于临床标本检测，为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路，基于流式平台，MetFlow检测技术方法的建立，成功运用固定破膜技术将带荧光素的抗体导入单个细胞内部，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配，让实验既简单便捷，又精准严谨，因为运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度。

附图说明

图1为本发明技术方法示意图；

图2为本发明应用前景示意图；

图3为本发明流式平台传统检测技术方法与Met-Flow新技术的示意图对比图；

图4为本发明实施例图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1-4，本实施例中的一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，

1)首先取外周静脉血后用EDTA抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；

2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；

3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；

4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行Met flow检测；

5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部；

6)对细胞表面抗原以及细胞内部的代谢关键酶以及蛋白表达水平进行检测。

步骤2)中水平离心机的工作时间为10min且每分钟1400r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状，步骤3)中离心机的离心时间为8min，且每分钟800r/min，来弃除上清，步骤6)中细胞表面的抗原包括CD3、CD4、CD8、CD45、CD16、CD56、CD19和HLA-DR中的任意一种或多种，步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：ACAC、IDH、G6PD、ASS1、HK1、CPT1A、GLUT1、PRDX2、ATP5A，步骤4)中高剪切均质机的运作时间为14min，且转速为2600r/min，由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

抗体体系浓度的检测，首先基于SPR技术,利用Protein A与抗体Fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与Protein A结合的响应单位,建立标准曲线，通过读取未知浓度抗体与Protein A芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

将传统技术与Met-flow新技术相结合，对新鲜外周血单个核细胞进行固定破膜，将带荧光素的抗体导入细胞内部，从而实现检测细胞表面抗原的同时也能检测到细胞内部的代谢关键酶和蛋白表达水平。

将Met-Flow技术在临床领域的应用，技术平台经典，操作便捷，出报告时间快速，结果精准，尤其是技术实现过程中条件的摸索，抗体浓度的选择，荧光种类的选择都是本发明的创新点，实现了该技术从免疫学角度为临床疾病的诊断，分级分期，治疗，预后判断，生存时间等提供了技术支持，更是实现了将已经成熟的基础研究成果在临床患者进行验证，为疾病特别是癌症的靶向治疗提供了更多思路。

实施例二

请参阅图1-4，本实施例中的一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，

1)首先取外周静脉血后用EDTA抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；

2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；

3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；

4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行Met flow检测；

5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部；

6)对细胞表面抗原以及细胞内部的代谢关键酶以及蛋白表达水平进行检测。

步骤2)中水平离心机的工作时间为11min且每分钟1500r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状，步骤3)中离心机的离心时间为9min，且每分钟900r/min，来弃除上清，步骤6)中细胞表面的抗原包括CD3、CD4、CD8、CD45、CD16、CD56、CD19和HLA-DR中的任意一种或多种，步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：ACAC、IDH、G6PD、ASS1、HK1、CPT1A、GLUT1、PRDX2、ATP5A，步骤4)中高剪切均质机的运作时间为15min，且转速为2700r/min，由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

抗体体系浓度的检测，首先基于SPR技术,利用Protein A与抗体Fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与Protein A结合的响应单位,建立标准曲线，通过读取未知浓度抗体与Protein A芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

将传统技术与Met-flow新技术相结合，对新鲜外周血单个核细胞进行固定破膜，将带荧光素的抗体导入细胞内部，从而实现检测细胞表面抗原的同时也能检测到细胞内部的代谢关键酶和蛋白表达水平。

将Met-Flow技术在临床领域的应用，技术平台经典，操作便捷，出报告时间快速，结果精准，尤其是技术实现过程中条件的摸索，抗体浓度的选择，荧光种类的选择都是本发明的创新点，实现了该技术从免疫学角度为临床疾病的诊断，分级分期，治疗，预后判断，生存时间等提供了技术支持，更是实现了将已经成熟的基础研究成果在临床患者进行验证，为疾病特别是癌症的靶向治疗提供了更多思路。

实施例三

请参阅图1-4，本实施例中的一种流式平台外周血标本检测技术方法，包括以下步骤，

1)首先取外周静脉血后用EDTA抗凝，再加入平衡盐溶液并混均；

2)将分层液加入至试管中，用吸管沿管壁缓缓将血加入至分层液面上，再置入水平离心机中进行离心；

3)用尖吸管吸取截面的细胞层，至于另一试管中，加入适量的平衡盐溶液，混均后进行离心来分离出单个核细胞；

4)然后利用高剪切均质机对新鲜外周血单个核细胞进行Met flow检测；

5)将带荧光素的抗体导入至细胞的内部；

6)对细胞表面抗原以及细胞内部的代谢关键酶以及蛋白表达水平进行检测。

步骤2)中水平离心机的工作时间为12min且每分钟1600r/min，可见绝大多数单个核细胞悬浮于血浆和分层液的界面，且呈白膜状，步骤3)中离心机的离心时间为10min，且每分钟1000r/min，来弃除上清，步骤6)中细胞表面的抗原包括CD3、CD4、CD8、CD45、CD16、CD56、CD19和HLA-DR中的任意一种或多种，步骤6)中细胞内部代谢关键酶和蛋白包括但不限于：ACAC、IDH、G6PD、ASS1、HK1、CPT1A、GLUT1、PRDX2、ATP5A，步骤4)中高剪切均质机的运作时间为16min，且转速为2800r/min，由于运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配。

抗体体系浓度的检测，首先基于SPR技术,利用Protein A与抗体Fc端特异性结合的特点,通过测定一系列浓度梯度的单克隆抗体对照品与Protein A结合的响应单位,建立标准曲线，通过读取未知浓度抗体与Protein A芯片结合的响应值,实现对未知抗体浓度的定量，并对该方法的准确度、重复性、专属性、线性范围及耐用性等参数进行考察。

将传统技术与Met-flow新技术相结合，对新鲜外周血单个核细胞进行固定破膜，将带荧光素的抗体导入细胞内部，从而实现检测细胞表面抗原的同时也能检测到细胞内部的代谢关键酶和蛋白表达水平。

将Met-Flow技术在临床领域的应用，技术平台经典，操作便捷，出报告时间快速，结果精准，尤其是技术实现过程中条件的摸索，抗体浓度的选择，荧光种类的选择都是本发明的创新点，实现了该技术从免疫学角度为临床疾病的诊断，分级分期，治疗，预后判断，生存时间等提供了技术支持，更是实现了将已经成熟的基础研究成果在临床患者进行验证，为疾病特别是癌症的靶向治疗提供了更多思路。

免疫系统包含多种免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和自然杀伤细胞，当身体处于稳定状态时，这些细胞处于静止状态，当身体受到感染、炎症或其他外部物质的刺激时，这些细胞会迅速被激活并作出反应，肿瘤细胞主要利用糖酵解途径快速提供ATP供自身生长，也通过磷酸戊糖途径(PPP)和丝氨酸代谢途径为细胞复制提供生物大分子，即使在充足的氧气条件下，肿瘤细胞仍优先利用糖酵解产生ATP，这是众所周知的有氧糖酵解(Warburg效应)，类似肿瘤细胞的复杂代谢模式同样也存在于免疫细胞中，最近的研究表明，在静息状态和激活状态下，免疫细胞的能量消耗存在显著差异，例如，幼稚T细胞的新陈代谢基本上是静态的，显示出零增殖，因此只需要维持最基本的营养素摄入、最小的糖酵解速率和最小的生物合成，ATP主要由氧化磷酸化(OXPHOS)产生，一旦被外部刺激激活进入效应T细胞(Teff)，它就表现为代谢激活状态，增加营养吸收，增加糖酵解速率，蛋白质、脂质和核苷酸的合成积累，同时，线粒体耗氧量降低，最终T细胞获得生长增殖能力，产生子代细胞，发挥杀伤作用。

基于此原理和成果，我们选择了如下九种蛋白：

GLUT1:GLUT1几乎存在于人体每一个细胞中，当发生癌变时，葡萄糖是肿瘤细胞最主要的能量来源，对葡萄糖的需求剧增即被称为WarburgEffect的肿瘤细胞代谢现象，基础研究在很多种类的肿瘤细胞中都观察到GLUT1的超高量表达，以大量摄入葡萄糖维持肿瘤细胞的生长扩增，这使得GLUT1的表达量可能作为检测癌变的一个指标，癌细胞对葡萄糖的利用过于低效，以至于需要摄入大量葡萄糖才能维持能量供应，所以，这些细胞通常在表面上表达大量的葡萄糖转运蛋白，即GLUT1，来帮助细胞摄入葡萄糖。

G6PD催化戊糖磷酸途径(PPP)的第一个不可逆反应并生成NADPH，是PPP中的限速酶，研究表明，G6PD在肿瘤细胞中的表达比正常细胞高，其表达与肿瘤患者的总体生存有关，很多研究还表明，G6PD的活性在多种类型癌症中升高，包括膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、胆管癌、结肠腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝细胞肝癌(HCC)、胶质瘤、胰腺癌和黑色素瘤等，G6PD表达的不稳定性也与肿瘤的恶性程度有关。

HK1己糖激酶，糖酵解的第一步是葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖，在所有的细胞中，皆由己糖激酶进行催化，己糖激酶是六碳糖的磷酸化酶，催化使葡萄糖从稳定状态变为活跃状态的葡萄糖-6-磷酸，糖代谢的限速酶己糖激酶在固有免疫系统中发挥模式识别受体功能，类似免疫系统的守门人角色，具有重要的功能，己糖激酶有5种亚型，其中I分布在线粒体外膜，让己糖激酶能直接获得线粒体产生的ATP，线粒体己糖激酶在癌细胞中增加显著，可以超过正常水平的200倍，癌细胞高水平己糖激酶被认为是驱动糖酵解维持细胞无氧代谢的表现，这就是德国著名科学家OttoHeinrichWarburg1930年提出的著名假说Warburg效应。

ACAC:乙酰辅酶A羧化酶，是脂肪酸(FA)合成的限速酶，催化acetyl-CoAacetyl-CoA羧化为丙二酰辅酶A，ACAC有两种组织特异性异构体：ACAC1和ACAC2，ACAC1是一种胞质酶，肝脏和脂肪组织中表达，对FA合成至关重要，ACAC2则控制着线粒体对FA和FAO的摄取，ACAC1在多种人类癌症中高度表达，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和胃癌，ACAC1耗竭减少FA合成并诱导前列腺和乳腺肿瘤细胞的凋亡，而不是非恶性细胞的凋亡，ACC2高表达则与喉癌5年生存率低相关.癌细胞利用脂质代谢获取癌细胞增殖、存活、侵袭、转移以及对肿瘤微环境和癌症治疗响应所需要的能量、生物膜成分和所需的信号分子。

IDH2:异柠檬酸脱氢酶，最先研究发现IDH1的突变与脑胶质瘤密切相关，之后又发现其突变与前列腺、副神经节瘤以及IDH1/2突变与急性髓细胞白血病相关，其致瘤机制为突变的IDH能将α-酮戊二酸转化为2-羟戊二酸，且后者可以抑制前者的靶点，导致这些靶点表达异常引发癌症。

CPT1:肉碱棕榈酰转移酶1，研究论文中确定了CPT1的致癌相关性，并阐述了从脂肪酸氧化(FAO)到细胞周期调控的机制联系。

ASS1:精氨酸琥珀酸合成酶，一种产生精氨酸的关键酶，大多数肿瘤细胞缺乏ASS1，因此会导致细胞内精氨酸合成能力的丧失，在这种情况下，肿瘤细胞会利用外源性精氨酸来弥补精氨酸的缺乏所造成的细胞内关键代谢酶的缺乏，精氨酸代谢在T细胞活化和调节免疫反应中也起着至关重要的作用。

PRDX2:过氧化还原酶，属于过氧化物氧化还原酶蛋白家族成员，是一类在对抗活性氧化，抗氧化过程中发挥关键作用的蛋白质，在多种肿瘤组织中高表达，其表达与肿瘤细胞增殖分化转移复发及放化疗的敏感性密切相关。

ATP5A：ATP合成关键酶，对于许多类型的癌细胞，无论是在氧气充足或氧气不足的情况下，都主要依赖糖酵解供给能量，而非三羧酸循环与氧化磷酸化。

肿瘤细胞的代谢程序不仅影响免疫细胞的抗原提呈和识别，而且免疫细胞的代谢程序也会影响其功能，最终导致肿瘤免疫功能的改变，因此，代谢干预不仅可以改善免疫细胞对肿瘤的反应，而且可以增加肿瘤的免疫原性，从而扩大可以用免疫疗法有效治疗的癌症的范围。

上述实施例的有益效果为：该技术在临床的成熟应用能够将大量基础研究中涉及的代谢蛋白和关键酶的检测应用于临床标本检测，为临床疾病的鉴别诊断，分级分期，预后判断，靶向治疗等提供新思路，基于流式平台，MetFlow检测技术方法的建立，成功运用固定破膜技术将带荧光素的抗体导入单个细胞内部，根据要检测的靶蛋白种类，设计荧光剂的类型搭配，让实验既简单便捷，又精准严谨，因为运用于临床患者外周血标本的检测，每个患者都有其特异性，根据患者血常规结果，确定各抗体用量，计算各抗体的体系浓度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。