一种快速检测宠物病原体核酸检测的试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，特别涉及一种可以快速常温对宠物感染病毒核酸检测的试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

随着分子生物学技术得快速发展，它不仅仅涉及生物学、医学、遗传学、植物学、动物学等方面，更逐渐成为实际应用的底层技术。PCR作为一个已经较为成熟的技术，其具有高特异性、高效率等特点，但是一直难以摆脱需要洁净等级较高的实验室和专业的操作人员的束缚。

长期以来，生物活性样本中提取核酸(DNA和RNA)以及其纯化步骤繁多、耗时较多等缺点，使得核酸检测变成快速检测存在阻碍。尤其当检测样本中病原体滴度较低时，是否能将样本中的核酸完整提取并保存影响后续的检测结果。因此解决核酸提取步骤多、时间长这两个问题对于核酸检测具有重要意义。

对于粗糙样本(拭子、血液等)一般采用添加核酸酶抑制剂后水浴加热的方法，使得微生物或者细胞裂解，释放核酸。Hudson法即为加入EDTA和TCEP后，首先水浴60℃2分钟，将微生物灭活，随后升温到95℃10分钟，即得到混有核酸的提取液。由于其操作简单，无需提纯可以直接进行下一步检测，成本低廉，易操作，核酸损失量少等特点，可以作为快速检测的操作之一

市面上可以购买到的核酸提取液(保存液)通常加入了异硫氰酸胍作为裂解成分，虽然可以常温破坏病毒活性并且使核酸释放，但是通常需要十分钟以上的裂解时间以达到最好的提取效果。

此外还有一种常用的核酸提取方法就是碱裂解法。如中国专利申请CN201210242862.6，其利用强碱溶液在高温下让生物样本中的细胞发生裂解，释放出核酸，然后加入酸性缓冲液进行中和，进行离心，获得所提取的核酸溶液。其高温和离心步骤同时也给快速提取带来了困难。

不论采用Hudson法还是碱裂解法，利用现有技术提取和检测样本中的核酸都会涉及到加热步骤，而且加热过程的等待时间、使用电器和加热设备带来的危险性都与快速检测的初衷相反。

近年来，恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术结合为核酸恒温扩增检测技术的发展创建了一个新的平台。目前等温扩增和基因编辑检测病原体的步骤包括核酸提取、恒温扩增、Cas蛋白编辑以及产物检测。

核酸提取是核酸扩增技术中的关键步骤，但因实验室提取核酸的方法通常比较繁琐，需要一种简便、快速、高效、低耗能的核酸提取方法。常用的快速提取核酸的方法有固相提取试剂盒快速提取法，磁珠法，氧化铝膜法和裂解液处理法等。但固相提取法需要依靠仪器操作如离心机，磁珠法处理成本高，氧化铝膜法制造工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用。裂解液恒温快速提取法操作简单、价格便宜、获取方便，是十分理想的核酸提取方法。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术的不足之处，本发明提供一种可以快速常温对宠物感染病毒核酸检测的试剂、试剂盒及其应用，所述试剂、试剂盒及其应用均使用强碱性的核酸提取液提取样本中的核酸，然后酸性终止液加入提取液中进行中和，以进行下一步扩增。其中碱性核酸提取液的碱浓度适当降低，并在提取液中加入EDTA，抑制核酸酶活性；同时加入Tris作为缓冲体系，在加入酸性终止液之后，液体内存在缓冲体系，因操作引起的误差对pH影响小。对于血清、血浆、全血、尿液、口鼻眼分泌物、生殖道分泌物、肛拭子、粪便等复杂样本，使用裂解液时同样可以提取出核酸，但裂解效果会受样本状态影响，为获得最好的提取效果，可以对样本进行适当的前处理。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，所述的试剂包括提取液、终止液、TSA反应液、Cas12a检测液、胶体金试纸条；

所述的提取液包括强碱氢氧化物、Tris-HCl；

所述的终止液包括醋酸、Tris醋酸；

所述的TSA反应液包括UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、Bsu蛋白、dNTP、ATP、Tris缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、聚乙二醇35000及MgOAc；

所述的Cas12a检测液包括Cas12a蛋白、NaCl、Tris-HCl、MgCl

所述的胶体金试纸条包括T带与C带，其中T带标记有链霉亲和素，C带标记有抗-抗FAM抗体。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的提取液中：

所述的强碱氢氧化物的质量浓度为25mM～500mM，所述的强碱氢氧化物为NaOH，所述的Tris-HCl的质量浓度为10mM～70mM，

所述的EDTA的质量浓度为10mM～50mM；

所述的提取液的pH值为11.4～13.7。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的终止液中：

所述的醋酸的质量浓度为1M～5M，所述的Tris-醋酸的质量浓度为1M；

所述的终止液的pH值为2～2.5。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的TSA反应液中：

所述的UvsX蛋白的质量浓度为100-300ng/μL，

所述的UvsY蛋白的质量浓度为50-100ng/μL，

所述的GP32蛋白的质量浓度为100-500ng/μL，

所述的Bsu蛋白的质量浓度为50-200ng/μL，

所述的dNTP的质量浓度为150-300μM，

所述的ATP的质量浓度为2-10mM，所述的Tris缓冲液的质量浓度为20-80mM，

所述的磷酸肌酸的质量浓度为20-80mM，

所述的肌酸激酶的质量浓度为30-100ng/μL，

所述的聚乙二醇35000的质量浓度为1-7％(w/v)，

所述的MgOAc的质量浓度为20mM。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的Cas12a检测液中：

所述的Cas12a蛋白的质量浓度为1-10uM，

所述的NaCl的质量浓度为20-75mM，

所述的Tris-HCl的质量浓度为5-15mM，

所述的MgCl

所述的BSA的质量浓度为50-150ug/ml，

所述的crRNA的质量浓度为10-50nM，

所述的FAM-Bio修饰的ssDNA的质量浓度为1-100nM，

所述的Cas12a检测液的pH值为7.9。

一种含有上述所述的试剂的试剂盒。

一种如上述所述的试剂盒在检测宠物病原体核酸中应用。

上述所述的应用，

包括以下步骤：

(1)利用所述的提取液提取样本中的核酸，获得样本核酸溶液；

(2)将所述的终止液全部加入步骤(1)中所获得的样本核酸溶液，以中和样本核酸溶液的pH并得到混合液；其中混合的pH值为6.5-8；

(3)利用所述的混合液进行扩增反应并检测样本中的核酸。

所述混合液的pH为6.5～8。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)相比于繁琐、条件复杂的核酸提取，只需要2分钟和2步加样即可提取出样本核酸；

(2)提取的核酸可以较长时间保存，且可用于各种检测、扩增；

(3)本发明提供的核酸扩增方法，且可扩增温度范围较大，可以无需大型精密仪器设备或专业人员即可短时间内完成扩增操作；

(4)第一步核酸提取和第二步核酸扩增结合可以在采样现场快速完成布置和检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中地技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见的，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中提取液不同提取时间下的提取效果(PCR验证)图；

图2为不同温度下核酸扩增效果图；

图3为不同时间下核酸扩增效果图；

图4为恒温核酸扩增原理示意图；

图5为不同浓度下Cas12a剪切效果图；

图6为胶体金试纸条检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

本发明的基础技术方案如下：

一种快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，所述的试剂包括提取液、终止液、TSA反应液、Cas12a检测液、胶体金试纸条；

所述的提取液包括强碱氢氧化物、Tris-HCl；

所述的终止液包括醋酸、Tris醋酸；

所述的TSA反应液包括UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白、Bsu蛋白、dNTP、ATP、Tris缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶、聚乙二醇35000及MgOAc；

所述的Cas12a检测液包括Cas12a蛋白、NaCl、Tris-HCl、MgCl

所述的胶体金试纸条包括T带与C带，其中T带标记有链霉亲和素，C带标记有抗-抗FAM抗体。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的提取液中：

所述的强碱氢氧化物的质量浓度为25mM～500mM，所述的强碱氢氧化物为NaOH，

所述的Tris-HCl的质量浓度为10mM～70mM，

所述的EDTA的质量浓度为10mM～50mM；

所述的提取液的pH值为11.4～13.7。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的终止液中：

所述的醋酸的质量浓度为1M～5M，

所述的Tris-醋酸的质量浓度为1M；

所述的终止液的pH值为2～2.5。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的TSA反应液中：

所述的UvsX蛋白的质量浓度为100-300ng/μL，

所述的UvsY蛋白的质量浓度为50-100ng/μL，

所述的GP32蛋白的质量浓度为100-500ng/μL，

所述的Bsu蛋白的质量浓度为50-200ng/μL，

所述的dNTP的质量浓度为150-300μM，

所述的ATP的质量浓度为2-10mM，

所述的Tris缓冲液的质量浓度为20-80mM，

所述的磷酸肌酸的质量浓度为20-80mM，

所述的肌酸激酶的质量浓度为30-100ng/μL，

所述的聚乙二醇35000的质量浓度为1-7％(w/v)，

所述的MgOAc的质量浓度为20mM。

上述所述的快速检测宠物病原体核酸检测的试剂，

所述的Cas12a检测液中：

所述的Cas12a蛋白的质量浓度为1-10uM，

所述的NaCl的质量浓度为20-75mM，

所述的Tris-HCl的质量浓度为5-15mM，

所述的MgCl

所述的BSA的质量浓度为50-150ug/ml，

所述的crRNA的质量浓度为10-50nM，

所述的FAM-Bio修饰的ssDNA的质量浓度为1-100nM，

所述的Cas12a检测液的pH值为7.9。

一种含有上述所述的试剂的试剂盒。

一种如上述所述的试剂盒在检测宠物病原体核酸中应用。

上述所述的应用，

包括以下步骤：

(1)利用所述的提取液提取样本中的核酸，获得样本核酸溶液；

(2)将所述的终止液全部加入步骤(1)中所获得的样本核酸溶液，以中和样本核酸溶液的pH并得到混合液；其中混合的pH值为6.5-8；

(3)利用所述的混合液进行扩增反应并检测样本中的核酸。

所述混合液的pH为6.5～8。

需要说明的是，

本发明采用如下核酸提取技术方案：一种强碱性核酸提取方法，包括如下步骤：将样本放入提取液(浓度为25mM～500mM的强碱氢氧化物溶液)中提取核酸；对上述溶液进行的震荡混匀，常温下静置提取，时间为2分钟；加入终止液(浓度为0.1M-1.5M、pH为0.1-1的HCl溶液)并震荡混匀。

作为本技术方案的进一步改进，所述强碱氢氧化物为NaOH或KOH；

作为本技术方案的进一步改进，所述提取液体积为200μl；

作为本技术方案的进一步改进，所述终止液体积为200μl；

作为本技术方案的进一步改进，第三步操作后，核酸可以在-20℃条件下保存一个月；

与现有技术相比，本发明通过改变试剂的浓度、pH值、提取的温度和时间等参数，使其能满足现有的各类分子生物学检测、扩增需要，并能在相同时设备和实验条件下同时进行自动化DNA、RNA提取工作。

同时，本发明采用如下核酸扩增体系方案：包括UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白和Bsu蛋白：

所述UvsX蛋白为如下任意一种：

A 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

A 2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

所述UvsY蛋白为如下任意一种：

B 1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

B2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

单链结合蛋白GP32为如下任意一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

C2)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

DNA聚合酶Bsu为如下任意一种：

D1)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

D2)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的任意一个或几个氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白具有90％以上的同一性的蛋白；

可选的，所述UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bsu蛋白的质量比为1：(0.1-4.5)：(0.75-2.4)：(0.17-0.82)；建议优选，所述UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bsu蛋白的质量比为260：88：300：90。

可选的，还包括镁离子反应启动剂、dNTP、ATP、Tris-HCl缓冲液、磷酸肌酸、肌酸激酶(CK)、聚乙二醇(PEG35000)中的一种或几种。

可选的，所述反应启动剂镁离子,反应体系中启动剂的浓度为20mM。

可选的，所述反应启动剂镁离子，为MgCl

反应体系中含有如下各物质：一对正、反引物(每条引物浓度为300-600nM)、100-300ng/μL UvsX蛋白、50-100ng/μL UvsY蛋白、100-500ng/μL GP32蛋白、50-200ng/μL Bsu蛋白、150-300μM dNTP、2-10mM ATP、20-80mM Tris缓冲液、20-80mM磷酸肌酸；30-100ng/μL肌酸激酶；1-7％(w/v)聚乙二醇35000，20mM的MgOAc。

一种用于等温核酸检测的试剂盒，试剂盒中包括上述的体系。

一种等温核酸检测方法，将待测样本加入上述放映体系，恒温反应15-30min；于30℃-47℃，恒温反应15-30min；所述方法为非疾病诊断治疗方法。

可选的，待测样本为DNA或RNA。

可选的，待测样本为RNA时，还需在反应体系中加入逆转录酶(MuLV)。

第三，本发明采用如下核酸检测方法：包括Cas12a蛋白、NaCl、Tris-HCl、MgCl

可选的，NaCl浓度为5mM，Tris-HCl浓度为1mM，MgCl2浓度为1mM，BSA浓度为10μg/ml，Cas12a浓度为10μM，crRNA浓度为50nM，ssDNA reporter浓度为15nM。

可选的，MgCl2可替换成MgOAc。

可选的，ssDNA reporter浓度可替换为10mM。

可选的，ssDNA reporter浓度可替换为5mM。

需要注意的是，以下实施例中，未提及具体的浓度的试剂，均以其中间值作为最优选值进行实验。同时，关于引物I，Primer F：5’-GTAGTTGTAAATAATATGGATAAAACTGCAG-3’，Primer R:5’-GGCTGAGTAGCAGATTCTGAAACAGTCTTT-3’，分别如SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6所示。

实施例1

猫细小病毒的提取步骤如下：

(1)将采集的样本放入提取液(浓度为25mM～500mM的强碱氢氧化物溶液，建议选择100mM)中提取核酸；对上述溶液进行的震荡混匀，常温下静置提取，时间为2分钟；加入终止液(浓度为0.1M-1.5M、pH为0.1-1的HCl溶液，建议选择浓度为0.8M、pH为0.5)并震荡混匀。

(2)进行以下几组反应：

a-中加入空白拭子；

b-中加入猫细小样本拭子20s；

c-中加入猫细小样本拭子40s；

d-中加入猫细小样本拭子60s；

e-中加入猫细小样本拭子90s；

f-中加入猫细小样本拭子120s。

(3)对上述液体分别使用特异性引物I和PCR预混液，在Applied Biosystems2720PCR仪进行PCR扩增，程序设置如下：预变性(94℃，5min)-变性(94℃，30s)-退火(55℃，30s)-延伸(72℃，20s)go to变性，28cycle-终延伸(72℃，10min)。

(4)结果

实时结果如图1所示，结果表明，在相同条件下，同时考虑效果和效率，在2min时提取效果最好，效率最高。

实施例2

对上述提取液e进行扩增温度测试：

(1)配置反应体系(50μL体系)：5μL模板DNA e、引物I(每条引物420nM)、1μlM uLV逆转录酶、260ng/μL UvsX蛋白、88ng/μL UvsY蛋白、300ng/μL GP32蛋白、90ng/μL Bsu蛋白、240μM dNTP、5mM ATP、100mM醋酸钾、100mM Tris缓冲液、40mM磷酸肌酸；90ng/μL肌酸激酶；6％聚乙二醇35000。

(2)进行以下几组反应：

g-以DEPC水代替模板DNA e；

h-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度10℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

i-1中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度20℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

j-1中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度30℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

k-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度35℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

m-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度40℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

n-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度47℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

(3)结果

实时结果如图2所示，结果表明，反应在20-47℃均可以达到扩增效果。

实施例3

对上述提取液e进行扩增时间测试

(1)配置反应体系(50μL体系)：5μL模板DNA e、引物I(每条引物420nM)、1μlM uLV逆转录酶、260ng/μL UvsX蛋白、88ng/μL UvsY蛋白、300ng/μL GP32蛋白、90ng/μL Bsu蛋白、240μM dNTP、5mM ATP、100mM醋酸钾、100mM Tris缓冲液、40mM磷酸肌酸；90ng/μL肌酸激酶；6％聚乙二醇35000。

(2)进行以下几组反应：

o-以DEPC水代替模板DNAe；

p-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应5min后对产物提纯终止反应；

q-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应10min后对产物提纯终止反应；

r-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应15min后对产物提纯终止反应；

s-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应20min后对产物提纯终止反应；

t-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应25min后对产物提纯终止反应；

u-中加入终浓度为20mM的MgOAc启动，反应温度37℃，反应30min后对产物提纯终止反应；

(3)结果

实时结果如图3所示，结果表明，扩增效果在前30min随时间增加效果变强，在30min达到最大量。

实施例4

对上述提取液u进行Cas12a浓度测试。

(1)配置反应体系(20μl体系)：NaCl 5mM，Tris-HCl 1mM，MgCl

(2)进行以下几组反应：

v-中不加入Cas12a；

w-中加入Cas12a终浓度1μM；

x-中加入Cas12a终浓度5μM；

y-中加入Cas12a终浓度10μM；

z-中加入Cas12a终浓度20μM；

(3)结果使用ABI StepOne Plus qPCR仪读取荧光数据。

实时结果如图5所示，结果表明，在本发明所述体系中Cas12a终浓度为终浓度10μM时剪切效率最高。

实施例5

对上述提取液u进行Cas12a剪切并使用试纸条读取结果。

(1)配置反应体系(20μl体系)：NaCl 5mM，Tris-HCl 1mM，MgCl

(2)进行以下几组反应：

pc-中加入Target(u)2μl；

nc-中加入DEPC 2μl；

(3)37℃条件下孵育20min；

(4)分别插入胶体金试纸条；

(5)结果

结果如图6所示，结果表明，C带有条带T带无条带为阳性(pc)；C带有条带T带有条带为阴性。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。