青花菜BoGHL1基因在改变植物耐贮性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及青花菜BoGHL1基因在改变耐贮性中的应用。

背景技术

青花菜属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种(Brassicaoleracea)植物，是重要的蔬菜作物。其食用器官花球由幼嫩的花蕾和花茎组成，呼吸作用十分旺盛，采后极易衰老，不耐贮藏，常温条件下一般1-3天，花蕾萼片开始失绿转黄，失去营养价值和商品性。虽然目前的冷藏等贮藏保鲜技术在一定程度上能延缓青花菜的衰老，不但成本较高，且可控制性较差，不能从根本上解决问题和满足市场的多方需求。

目前，通过基因工程手段来提高蔬菜作物在不良环境条件下的抗性，将对提高蔬菜产量、品质和经济效益，保障我国蔬菜均衡供应具有十分重要的科学和现实意义。应用基因工程育种已经成为增强作物耐贮性的重要方法之一。SGR(STAY-GREEN)是一类镁离子螯合酶，在拟南芥叶片叶绿素代谢及其他细胞成分的分解和重新活化中发挥重要的作用。然而在青花菜SGR(或BoGHL)家族基因在调节花球方面功能仍然未知。因此通过分子生物学手段克隆、筛选SGR(或BoGHL)基因并揭示其生物学功能，能为青花菜耐贮性育种提供丰富的基因资源和理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供青花菜BoGHL1基因在改变植物耐贮性中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

青花菜BoGHL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且具有同等功能的衍生基因。

上述青花菜BoGHL1基因编码的蛋白选自，

(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或

(3)与(1)限定的蛋白序列有80％(较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述BoGHL1基因，还包括与SEQID NO.1具有较高同源性(如高于60％；较佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

其中，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的BoGHL1基因全长1131bp，共有4个外显子和3个内含子，CDS区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，长774bp。其基因编码一个256个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.2所示。

并且含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系以及含有所述载体的宿主细胞的获得方法也落入本发明的保护范围之内。

本发明最主要的目的在于上述BoGHL1基因在改变植物耐贮性中的应用。通过在分子水平上对BoGHL1基因的功能进行鉴定，得出BoGHL1基因对青花菜耐贮性起着重要的作用，从而为解析青花菜耐贮性调控机理提供理论基础。

进一步地，可以通过敲除、沉默或定向突变BoGHL1基因的方式来获得耐贮性增强的植物。所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述BoGHL1敲除，获得转基因植物株系。

具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还公开一种植物育种方法，所述方法为通过抑制目的植物中的BoGHL1基因的表达，获得耐贮性高于目的植物的植株，所述BoGHL1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述目的植物为青花菜。

其中，“抑制目的植物中的BoGHL1基因的表达”的方法为敲除、沉默或定向突变BoGHL1基因。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、十字花目、十字花科植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：青花菜，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

(1)本发明提供的青花菜BoGHL1基因及其编码蛋白，为进一步研究植物衰老的分子机制提供科学依据。

(2)本发明从青花菜全长cDNA文库中克隆得到青花菜BoGHL1基因序列，并以此构建靶向BoGHL1基因的基因编辑载体pCas9-BoGHL1，再将该质粒转化青花菜，得到BoGHL1的基因编辑植株，通过耐贮实验比较分析证明，敲除BoGHL1后的青花菜衰老延缓显著；说明BoGHL1基因参与青花菜花球衰老，通过敲除BoGHL1基因可延缓青花菜花球衰老，从而延长货架期。该基因的发掘与应用为耐贮青花菜的培育研究提供了基因资源和种质基础，将在定向改良耐贮植物的研究和应用中发挥重要作用，可广泛用于培育十字花科耐贮作物新品种。

附图说明

图1为青花菜BoGHL1基因结构及pCas9-BoGHL1载体结构；

图2为青花菜BoGHL1基因编辑植株测序结果示意图；

图3为敲除BoGHL1基因的植物和野生型植物耐贮性的研究结果。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

“突变体”(Mutant)，是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。

“表达载体”(Expression vectors)，是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

以下实施例所使用的青花菜材料为CX33。其为本发明申请人的实验室培育和保存的自交系，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。

实施例1青花菜BoGHL1基因的克隆

基于公布的青花菜基因组测序(Belser C，Istace B，Denis E，etal.Chromosome-scale assemblies of plant genomes using nanopore long reads andoptical maps.Nature plants，2018，4(11)：879-887)，在青花菜中总共鉴定出5个SGR家族同源基因。取大约1g的青花菜花球样品，加入液氮研磨，使用TIANGEN植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取mRNA，以此mRNA为模板，使用TIANGEN转录试剂盒合成cDNA第一条链。随后以该cDNA第一条链为模板，进行荧光定量PCR分析，发现BoGHL1基因在花球中表达较高。设计下述正向引物和反向引物进行PCR扩增，获得1个青花菜BoGHL1基因长的序列，克隆到pGEM-T载体。克隆的青花菜BoGHL1基因CDS序列如SEQ ID No.3所示，共774bp，其基因编码一个256个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.2所示。

正向引物和反向引物为：

BoGHL1-F：ATGTGTAGTTTGTCAGCGAACATGT；

BoGHL1-R：CTAGAGTTTCTCCGGATTAGGAGTA。

以青花菜幼嫩叶片为材料，采用CTAB法提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增，获得BoGHL1的基因组片段，BoGHL1基因的DNA序列SEQ ID No.1所示，全长1131bp，包含4个外显子和3个内含子。

实施例2青花菜BoGHL1基因编辑载体pCas9-BoGHL1的构建

针对青花菜BoGHL1基因使用在线网站(http://crispor.tefor.net/)进行CRSPR-Cas9靶点预测，选取特异性位点(AGCTTCCACCAACGCTTCCAAGG)，以改造载体pBWA(V)HU-CASPYL为模板，通过PCR扩增、酶切后和连接将目标sgRNA连接到载体上。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆，构建得到青花菜BoGHL1编辑载体pCas9-BoGHL1，载体示意图如图3所示。

实施例3农杆菌介导法转化青花菜

在本实施例，通过农杆菌介导法转化青花菜下胚轴的的方法，得到含有CRSPR-Cas9表达的转基因外植体，进而从中筛选出青花菜BoGHL1基因发生突变的植株。

(1)青花菜外植体的获得

选取成熟、饱满、无病斑的青花菜种子，使用75％酒精消毒3分钟，8％次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用灭菌水洗2-3次，灭菌后的种子在超净工作台中吸干多余的水，播种在萌发培养基上。在16h光照/8h黑暗条件下培养5-7天，将青花菜下胚轴切成0.8-1cm长，作为农杆菌介导转化的受体。

(2)青花菜的遗传转化

将含有pCas9-BoGHL1质粒的农杆菌培养至OD600＝0.4-0.6，用液体MS培养基重悬作为侵染液。将青花菜外植体侵染10分钟，置于共培养培养基中25℃暗培养36-48小时；随后将外植体转移到含10mg/L Basta浓度的选择培养技上，在16h光照/8h黑暗条件下，每14天更换一次选择培养。待抗性芽长到约2-3cm长度，切下抗性芽转到长苗培养基中，在16h光照/8h黑暗条件下培养20-30天，放入生根培养基中培养20天。根部生长发达的植株转入营养土中栽培。经Bar和Cas9基因PCR检测，共获得12个转基因植株。

(3)青花菜BoGHL1基因编辑植株的获得

提取已获得的12个转基因植株的基因组DNA，扩增青花菜BoGHL1基因并进行一代测序，检测在目标靶点是否存在突变，典型的突变特征为插入、缺失或双峰。共检测到4个BoGHL1基因编辑植株，移栽后3个月BoGHL1基因编辑植株开花，5个月后收获种子。

实施例4.青花菜BoGHL1基因编辑植株花球耐贮性分析

与野生型材料相比，青花菜BoGHL1基因编辑植株主要农艺性状没有改变。对青花菜BoGHL1基因编辑植株花球耐贮性进行分析，取生长状态一致的野生型和BoGHL1基因编辑植株花球，至于常温下保存(25℃，16h光照/8h黑暗)，第3天，野生型花球就开始出现失绿的花蕾，第5天黄蕾达80％以上，基本失去商品性。而BoGHL1基因敲除植株第5天才开始出现失绿的花蕾，第7天黄蕾在10-20％之间，仍具有一定的商品性，和野生型相比，耐贮性明显延长。

由此可见，BoGHL1基因参与青花菜花球衰老，通过敲除BoGHL1基因可延缓青花菜花球衰老，从而延长货架期。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。