一种葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人及其制备方法

技术领域

本发明属于游动纳米机器人技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人及其制备方法。

背景技术

游动纳米机器人是指在流体中能够将周围环境中的化学能或光、电、磁等能量转化为自身机械运动的纳米系统。游动纳米机器人的大小通常在微纳米尺度，处于低雷诺数区，由于粘滞效应的存在导致游动纳米机器人无法维持宏观物体运动的惯性力，游动纳米机器人需要克服粘滞阻力和布朗运动，使其驱动和运动控制面临挑战。通过可持续转化(输入)能量，可以在低雷诺数环境下发生有效位移。游动纳米机器人与其他微纳米尺度上只做布朗运动的胶体粒子不同，它可以通过持续转化周围环境的能量，打破对称性，打破时间反演性，在低雷诺数下产生有效位移。目前游动纳米机器人经过化学修饰后可用于药物靶向运输，肿瘤治疗等生物医学领域；现在游动纳米机器人在生物体相容的环境中应用的要求越来越高。构建具有生物相容性的小尺度游动纳米机器人，可以更好地应用于医学治疗。

发明内容

到目前为止，游动纳米机器人经过数十年的发展，在已有报道的用于驱动游动纳米机器人的各种燃料中，使用最多的燃料是过氧化氢。水、酸、碱、尿素、葡萄糖也可作为化学燃料，这些燃料具有生物相容性好、毒性低的优点。酶驱动的游动纳米机器人因尺寸小、运动灵活、驱动机理明确等特点，使其在药物靶向运输、生物传感等领域具有良好的应用前景。

本发明开发了一种葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人。本发明方法将介孔二氧化硅球进行不对称修饰，通过金属真空溅射的物理气相沉积技术在介孔二氧化硅的表面一侧沉积金属金，从而形成阴阳型介孔硅-金纳米颗粒，在介孔二氧化硅球的金侧接枝葡萄糖氧化酶和聚乙二醇后，可在葡萄糖溶液中进行自驱动运动。本发明的马达的优点在于利用溶胶-凝胶的方法制备尺度较小的介孔二氧化硅球，单侧修饰金属金之后，构建阴阳型介孔硅-金纳米颗粒。在金侧修饰葡萄糖氧化酶和聚乙二醇后，使其具备一定的生物相容性，该游动纳米机器人可以在葡萄糖溶液中进行自推进运动。

为了解决上述技术问题，本发明采取了以下的技术方案：

本发明的目的在于提供一种葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的制备方法，所述制备方法是按照以下步骤进行的：

步骤一、将介孔二氧化硅球分散于去离子水中，超声分散至均匀，然后滴加在亲水基底上，待自然铺展成单层粒子后，烘干；

步骤二、然后利用真空溅射物理气相沉积技术，将金属沉积在介孔二氧化硅球表面的一侧，再使用去离子水将亲水基底上的粒子冲洗下来，离心，得到MSN@Au阴阳介孔硅-金属纳米颗粒；

步骤三、将步骤二制备的MSN@Au阴阳介孔硅-金纳米颗粒分散于体积浓度90％～100％的乙醇溶液中，加入巯基聚乙二醇和巯基丙酸，振荡至少30min，离心水洗至少3次，得到MSN@Au-COOH-PEG颗粒；

步骤四、将MSN@Au-COOH-PEG颗粒分散于PBS缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应至少30min，离心至少15min后分散于PBS缓冲液中，再加入葡萄糖氧化酶反应至少30min，离心至少15min，即得到葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人。

进一步地限定，步骤一中，所述介孔二氧化硅球是通过下述步骤制备的：

步骤1、将200mg～250mg十六烷基三甲基溴化铵，50mg～80mg氢氧化钠和100mL～120mL去离子水混合，加热至80℃后，逐滴加入1mL～2mL原硅酸四乙酯，滴加完毕后加热2h，然后在转速为7000r/min～8000r/min的条件下，离心水洗3次，80℃烘干得到白色固体粉末；

步骤2、将步骤1获得的粉末放置于石英舟中并置于管式炉中，在空气气氛下，升温速率为1℃/min～2℃/min，将温度升温至500℃～550℃，然后在煅烧温度为500℃～550℃的条件下，煅烧4h～5h，最后洗涤、离心及干燥，得到介孔二氧化硅球。

进一步地限定，步骤二中金属为金，沉积厚度为为10nm～20nm。

进一步地限定，步骤二中，真空溅射参数：电流20mA～30mA，溅射时间为1min～2min。

进一步地限定，步骤三中，巯基聚乙二醇在反应体系中的浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL和巯基丙酸在反应体系中的浓度为0.2mg/mL～0.5mg/mL。

进一步地限定，步骤三中，在转速为7000r/min～8000r/min的条件下，离心15min～20min。

进一步地限定，步骤三中，乙醇溶液的体积浓度为90％～100％，介孔二氧化硅球分散液浓度为0.2mg/mL～1mg/mL。

进一步地限，步骤四中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在反应体系中的浓度为0.01M～0.02M，N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的浓度为0.05M～0.01M。

进一步地限定，步骤四中，葡萄糖氧化酶在反应体系中的浓度为1mg/mL～2mg/mL。

上述方法制备的葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明制备方法操作简单，所制备的游动纳米机器人尺度小且具备较好的化学稳定性和分散性，通过负载葡萄糖氧化酶将周围环境中的葡萄糖转化为驱动力，该游动纳米机器人部分修饰聚乙二醇，可有效避免生物粘附，在生物体环境中应用时可满足应用场景需求，可在主动给药，生物传感等领域具有良好的应用前景。

本发明通过真空溅射的物理气相沉积法制备游动纳米机器人，在胶体颗粒表面的一侧沉积金属，引入不对称性，制备成一定功能的游动纳米机器人。再根据不同应用场景的需求，对游动纳米机器人进行不同的化学修饰后，使其具有不同的运动特性。

本发明在金侧修饰聚乙二醇和葡萄糖氧化酶，可利用生物体内的葡萄糖进行化学驱动，可更好地应用在生物医学领域。

本发明制备一种具有良好的稳定性和生物相容性并且可以在葡萄糖溶液中运动的游动纳米机器人，对于推进游动纳米机器人在生物医学环境中的实际应用具有重要的意义。

为了能够更进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明详细说明与附图，然而所附的附图仅提供参考和说明之用，并非用来对本发明加以限制。

附图说明

图1为本发明葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的制备方法流程示意图；

图2为实施例1制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的透射电子显微镜图；

图3为实施例1制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的能量色散X射线光谱图，a为Si元素，b为Au元素，c为S元素；

图4为实施例1制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的葡萄糖氧化酶活性测试图；

图5为实施例1制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的平动扩散系数与葡萄糖溶液浓度的关系图；

图6为实施例1制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人酶催化驱动的原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：本实施例中一种葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的制备方法是按下述步骤实现的：

步骤一：制备介孔二氧化硅球

步骤1、将250mg十六烷基三甲基溴化铵，60mg氢氧化钠固体和120mL去离子水加热至80℃后，逐滴加入1.25mL原硅酸四乙酯，加热2h。离心水洗3次，80℃烘干得到白色固体粉末；

步骤2、将步骤1获得的粉末放置于石英舟中并置于管式炉中，在空气气氛下，升温速率为1℃/min，将温度升温至550℃，然后在煅烧温度为550℃的条件下，煅烧5h，最后洗涤、离心及干燥，得到介孔二氧化硅球。

步骤二、然后利用真空溅射物理气相沉积技术在电流20mA的条件下，溅射时间为1min，将金沉积在介孔二氧化硅球表面的一侧，再使用去离子水将亲水基底上的粒子冲洗下来，在转速为8000r/min的条件下，离心15min，得到MSN@Au阴阳介孔硅-金纳米颗粒；

步骤三、将步骤二制备的MSN@Au阴阳介孔硅-金纳米颗粒分散于体积浓度为90％乙醇溶液中，介孔二氧化硅球分散液浓度为0.2mg/mL，加入巯基聚乙二醇和巯基丙酸，巯基聚乙二醇加入量占反应体系的浓度为0.3mg/mL，巯基丙酸加入量占反应体系的浓度为0.3mg/mL，振荡30min，离心水洗至少3次，每次在转速为7000r/min的条件下离心15min，得到MSN@Au-COOH-PEG颗粒；

步骤四、将0.5mg/MSN@Au-COOH-PEG颗粒分散于5mL～10mLPBS缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺加入量占反应体系的浓度为0.01mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺加入量占反应体系的浓度为0.01mg/mL，反应30min，离心15min后分散于PBS缓冲液中，再加入葡萄糖氧化酶反应30min，葡萄糖氧化酶加入量占反应体系的浓度为1mg/mL，在转速为7000r/min的条件下，离心15min，即得到葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人。

为了验证葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的自驱动性，将该马达置于不同浓度的葡萄糖溶液中进行运动，使用马尔文动态光散射仪进行检测，经运动分析后，从平动扩散系数等运动参数证明该游动纳米机器人在葡萄糖溶液中进行自驱动运动。

本实施例制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的透射电子显微镜图如图2所示；由图2可知葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的形貌特征，介孔二氧化硅球具有均一的孔道结构，且介孔硅球的一侧覆盖金属金，金层厚度为10nm，证实葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的阴阳结构；

本实施例制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的能量色散X射线光谱图如图3所示，由图3可知，葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人的元素分析，硅元素为介孔二氧化硅球，金元素的分布表明介孔二氧化硅球单侧覆盖金属金，硫元素的分布表明介孔二氧化硅球金侧的巯基聚乙二醇和葡萄糖氧化酶的结合位点，即在游动纳米机器人表面单侧分布巯基聚乙二醇和葡萄糖氧化酶，即葡萄糖氧化酶和巯基聚乙二醇同时覆盖在金属金一侧；

本实施例制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的葡萄糖氧化酶活性测试图如图4所示，由图4可知，葡萄糖氧化酶活性与时间的关系，利用紫外可见光谱探究GOx的的活性，葡萄糖氧化酶分解溶液中的葡萄糖溶液产生葡萄糖酸和过氧化氢溶液，然后过氧化物酶分解过氧化氢产生自由基，TMB与产生的自由基形成显色反应会产生吸收峰。配制含有250μM3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、175mM葡萄糖水溶液和4μg过氧化物酶(HRP)的2mL的混合液，向混合液中加入葡萄糖氧化酶驱动游动纳米机器人，混合分散后进行紫外可见近红外光谱测试，测试波长为400-800nm；溶液中的过氧化氢浓度随时间的变化，在40min内过氧化氢的浓度随时间的增加逐渐升高至稳定，表明葡萄糖氧化酶修饰于游动纳米机器人表面，且在40min内有活性。

本实施例制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的平动扩散系数与葡萄糖溶液浓度的关系图如图5所示；由图5可知，葡萄糖溶液由0mM增加到75mM，MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人的平移扩散系数由0.57μm

本实施例制备的MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人酶催化驱动的原理图参见图6。MSN@Au-GOx-PEG游动纳米机器人表面上的葡萄糖氧化酶催化分解周围环境中的葡萄糖溶液，产物为葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖氧化酶提供驱动力。