环状RNA及其在促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及环状RNA及其在促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变中的应用。

背景技术

在胚胎发育的过程中存在着不同阶段不同状态的干细胞，原始态

目前，如何促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近年来不同基因来源的circRNA被陆续报道，在生理和病理过程中发挥着重要的调控作用。然而，环状RNA对PNT转变的影响至今还未有报道。

发明人在小鼠胚胎干细胞中发现了一种环状RNA(简称为circTET2)，通过将其进行过表达，可以有效地促进小鼠胚胎干细胞primed状态向

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种环状RNA。根据本发明的实施例，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。通过过表达该环状RNA，可以有效地促进胚胎干细胞由始发态转变为具有更好发育潜能的原始态的胚胎干细胞，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于获得前面所述环状RNA的重组表达载体。根据本发明的实施例，所述重组表达载体包括：线性RNA，所述线性RNA具有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；第一成环元件，所述第一成环元件与所述线性RNA的一端相连；第二成环元件，所述第二成环元件与所述线性RNA的另一端相连。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：前面所述环状RNA或前面所述重组表达载体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述环状RNA、所述重组表达载体或所述重组细胞。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述环状RNA、所述重组表达载体、所述重组细胞或所述试剂盒在促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变或制备原始态胚胎干细胞中的用途。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使处于始发态的胚胎干细胞中的环状RNA过表达；其中，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备原始态胚胎干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供始发态胚胎干细胞；使所述始发态胚胎干细胞中的环状RNA过表达；其中，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的circTET2表达水平示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的测序结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的质粒结构示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的circTET2表达水平示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的过表达circNC对照序列PNT转变效率示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的过表达circTET2序列PNT转变效率示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

术语“同源性”是指两种或多种核酸共享至少部分互补性的区域(位点)。在本文中术语“％同源性”与本文中的术语“％同一性”互换使用，并且是指当使用序列比对程序进行比对时，核酸序列之间同一性水平。例如，如本文所用的，80％同源性意指相同的事物通过定义的算法确定的80％序列同一性，并且因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于对给定序列，例如如本文所述的发明性核酸序列的80％、85％、90％、95％、98％或更大序列同一性。可用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序组，例如可在因特网上公开获得的BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN以及BLAT。

术语“载体”是指能够充当用于外来多核苷酸在宿主细胞中遗传转移、表达或复制的载体的任何遗传因子。例如，载体可为人工染色体或质粒，且可能能够稳定整合到宿主细胞基因组中，或其可以独立遗传因子(例如离合染色小体(episome)、质粒)形式存在。载体可以单一多核苷酸或以两种或两种以上分离的多核苷酸形式存在。当存在在宿主细胞中时，载体可为单一拷贝载体或多拷贝载体。适用于本发明的优选载体为表达载体分子，其中一个或多个功能基因可以适当定向插入载体分子中且接近驻留在表达载体分子中的表达控制元件，以便当载体分子驻留在适当(同源)宿主细胞中时，指导一种或多种蛋白的表达。

表达载体可包括但不限于真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、噬菌体载体、穿梭载体(例如可在真核和原核细胞中复制的载体)、微型染色体和各种人工染色体(例如，细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC))。优选地，用于本发明中的表达载体为质粒，更优选为稳定整合到宿主细胞基因组中的质粒表达载体，且甚至更优选为通过非同源重组稳定整合到宿主细胞基因组中的质粒表达载体。

环状RNA

在本发明的一个方面，本发明提出了一种环状RNA。根据本发明的实施例，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。通过过表达该环状RNA(简称circTET2)，可以有效地促进胚胎干细胞由始发态转变为具有更好发育潜能的原始态的胚胎干细胞，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

GATTCATTCAAAGGGCAGCCTTGTGGATGGCCCCGAAGCAAGCCTGATGGAACAGGACAGAACCACCCATGCTGAGGGCACCAGACTGAGTCCATTCCTGATAGCACCACCTTCTCCCATCAGCCATACAGAACCTCTGGCTGTCAAACTCCAGAATGGAAGCCCGTTAGCAGAGAGACCTCATCCAGAAGTAAATGGAGACACCAAGTGGCAATCTTCCCAAAGCTGTTATGGAATATCCCACATGAAAGGCAGCCAGAGCAGTCATGAGAGTCCACATGAAGACAGAGGGTATTCCAGGTGCTTACAGAATGGAGGGATAAAACGCACAGTCAGTGAACCATCTCTCTCTGGGCTCCATCCAAACAAGATATTGAAACTAGACCAAAAAGCTAAGGGAGAAAGCAATATCTTCGAGGAAAGCCAAGAAAGAAACCACGGTAAAAGCAGCCGTCAGCCAAATGTCTCCGGACTAAGTGATAATGGAGAGCCCGTGACCTCGACCACCCAGGAAAGTTCAGGTGCAGATGCTTTCCCAACACGGAACTACAATGGAGTTGAAATTCAGGTTCTCAACGAGCAGGAAGGGGAAAAAGGCAGGAGCGTTACATTACTTAAAAACAAGATTGTGCTAATGCCTAATGGTGCTACAGTTTCTGCCCATTCTGAGGAGAACACACGTGGTGAACTCCTGGAAAAAACACAGTGTTATCCAGATTGTGTCTCCATTGCCGTGCAGAGTACCGCATCTCATGTAAACACCCCTAGCAGTCAGGCTGCTATCGAGTTGTCCCACGAGATCCCTCAACCATCGCTTACCTCAGCGCAGATCAATTTCTCCCAGACCTCAAGCTTGCAGCTGCCTCCAGAGCCAGCTGCAATGGTGACTAAGGCCTGTGATGCTGATAATGCCAGTAAACCAGCTATAGTACCAGGTACCTGTCCTTTTCAGAAAGCAGAACACCAACAAAAGTCAGCTTTGGACATAGGCCCATCTCGTGCAGAAAACAAAACCATCCAAGGAAGCATGGAGCTATTTGCTGAAGAATACTATCCTAGTTCCGACCGGAATTTGCAAGCTTCGCATGGCAGCTCTGAACAGTATTCAAAGCAAAAGGAAACCAATGGTGCTTACTTCAGGCAAAGCTCGAAGTTCCCTAAAGATTCCATCTCTCCCACTACTGTGACCCCACCGTCACAATCACTTCTTGCTCCCCGTCTTGTTCTTCAGCCTCCTTTAGAAGGAAAAGGCGCTCTAAATGATGTAGCTTTGGAAGAACACCATGACTACCCCAACCGAAGCAACCGAACTCTTTTAAGGGAAGGGAAAATAGACCATCAACCCAAGACATCATCTAGCCAGAGTCTGAATCCATCTGTACATACACCCAACCCCCCCTTGATGCTTCCAGAACAGCATCAGAATGATTGTGGCTCACCGAGCCCTGAAAAGTCAAGAAAAATGTCAGAATATCTCATGTATTACCTGCCAAATCATGGCCACAGTGGAGGTTTACAAGAACATAGCCAATACCTGATGGGGCACAGGGAGCAAGAGATTCCGAAGGATGCAAACGGGAAACAAACGCAAGGCTCTGTACAGGCAGCACCTGGCTGGATAGAACTGAAAGCCCCGAATTTGCATGAAGCACTCCATCAGACAAAACGCAAGGATATATCCTTGCACTCAGTCCTCCACTCTCAGACCGGCCCTGTCAATCAGATGAGCTCCAAACAGTCCACTGGCAATGTCAACATGCCAGGAGGATTCCAAAGGCTACCTTACCTCCAGAAAACAGCCCAGCCAGAGCAGAAGGCACAAATGTACCAAGTGCAAGTGAACCAAGGACCGTCTCCAGGTATGGGGGACCAACATCTTCAGTTCCAGAAAGCTTTATACCAGGAGTGCATCCCCAGGACAGATCCGTCATCTGAGGCTCACCCGCAAGCACCGAGCGTTCCTCAGTATCATTTCCAGCAAAGAGTAAATCCCTCCAGTGATAAGCATTTGAGTCAACAGGCCACAGAGACTCAACGGTTATCAGGCTTTTTACAACATACTCCTCAGACGCAGGCATCACAAACACCAGCATCCCAGAACTCAAATTTCCCTCAAATCTGCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTTACAGAGGAAGAATAAAGAGCAAATGCCTCAGACTTTCTCTCATCTCCAAGGTAGCAATGATAAGCAAAGAGAAGGCTCGTGCTTTGGCCAGATTAAAGTGGAAGAAAGCTTTTGTGTCGGAAATCAGTACTCCAAATCAAGTAATTTCCAAACTCACAATAATACCCAAGGGGGGTTGGAGCAAGTACAAAATATAAATAAAAATTTTCCTTATTCGAAGATCTTAACACCAAATTCGAGCAACTTACAGATTCTCCCTTCAAATGACACACACCCGGCTTGTGAGCGGGAACAAGCTCTACATCCCGTAGGAAGTAAGACCTCAAACCTGCAGAACATGCAGTATTTCCCGAATAATGTGACCCCAAATCAGGACGTTCACCGGTGCTTTCAGGAACAAGCGCAGAAGCCTCAGCAAGCTTCGTCTCTACAGGGGCTTAAGGACAGAAGCCAGGGTGAGTCTCCAGCCCCACCAGCTGAGGCAGCTCAACAGAGGTATTTGGTGCATAATGAAGCAAAGGCACTCCCTGTGCCTGAGCAAGGAGGAAGTCAGACACAGACCCCTCCTCAGAAGGACACTCAGAAGCACGCTGCCTTAAGGTGGCTTCTCTTACAGAAGCAAGAACAGCAGCAAACACAGCAATCCCAGCCTGGTCATAACCAGATGCTTAGGCCAATCAAGACTGAGCCTGTATCCAAACCTTCTTCCTATAGATACCCCTTGTCACCGCCACAAGAAAATATGTCCAGCAGGATAAAGCAAGAGATCTCCTCTCCAAGCCGTGACAATGGGCAGCCAAAGAGCATCATTGAGACCATGGAACAGCACCTGAAGCAGTTTCAGCTCAAGTCACTCTGTGACTATAAGGCTCTGACTCTCAAGTCACAGAAACACGTGAAAGTGCCAACAGATATCCAGGCTGCAGAATCGGAGAACCACGCCCGAGCTGCAGAGCCTCAAGCAACCAAAAGCACAGATTGTTCTGTTCTCGACGATGTTTCAGAATCAGATACTCCTGGTGAACAAAGTCAGAATGGCAAATGTGAAGGATGCAATCCAG(SEQ ID NO：1)

重组表达载体

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于前面所述环状RNA的重组表达载体。根据本发明的实施例，所述重组表达载体包括：线性RNA，所述线性RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；第一成环元件，所述第一成环元件与所述线性RNA的一端相连；第二成环元件，所述第二成环元件与所述线性RNA的另一端相连。

通过将线性RNA插入到骨架载体上，有助于实现线性RNA过表达，并且，在其两端上设计的成环元件作用下可以使得该线性RNA环化，从而获得环状RNA。该环状RNA可以有效地促进胚胎干细胞由始发态转变为具有更好发育潜能的原始态的胚胎干细胞，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

本发明对于骨架载体的类型不做严格限定，可以为本领域常用载体，优选为常用的环状RNA过表达载体，具体地，可以为pCDH-ciR载体、plenti-ciR载体、pLO-ciR载体、pb-ciR载体等。

根据本发明的实施例，所述第一成环元件与所述第二成环元件为反向互补序列。在过表达时，反向互补序列互补配对，以便使线性RNA成环。

需要说明的是，本发明所使用的反向互补序列，既可以是本领域常用于环状RNA制备的反向互补序列，如Alu元件，也可以是人工合成的反向互补配对序列。根据本发明的具体实施例，所述第一成环元件和第二成环元件选自Alu元件。Alu元件有利于环状RNA的正确成环、成熟和加工。在一些实施例中，所述Alu元件具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

AAACAAGAGAGAATGCTATAGTCGTATAGTATAGTTTCCCGACTATCTGATACCCATTACTTATCTAGGGGGAATGCGAACCCAAAATTTTATCAGTTTTCTCGGATATCGATAGATATTGGGGAATAAATTTAAATAAATAAATTTTGGGCGGGTTTAGGGCGTGGCAAAAAGTTTTTTGGCAAATCGCTAGAAATTTACAAGACTTATAAAATTATGAAAAAATACAACAAAATTTTAAACACGTGGGCGTGACAGTTTTGGGCGGTTTTAGGGCGTTAGAGTAGGCGAGGACAGGGTTACATCGACTAGGCTTTGATCCTGATCAAGAATATATATACTTTATACCGCTTCCTTCTACATGTTACCTATTTTTCAACGAATCTAGTATACCTTTTTACTGTACGATTTATGGGTATAA TAATAAGCTAAATCGAGACTAAGTTTTATTGTTATATATATTTTTTTTATTTTATGCAGGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATAGGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGTAGATTCGTTGAAAAGTATGTAACAGGAAGAATAAAGCATTTCCGACCATGTAAAGTATATATATTCTTAATAAGGATCAATAGCCGAGTCGATCTCGCCATGTCCGTCTGTCTTATTATTTTATTACCGCCGAGACATCAGGAACTATAAAAGCTAGAAGGATGAGTTTTAGCATACAGATTCTAGAGACAAGGACGCAGAGCAAGTTTGTTGATCCATGCTGCCACGCTTTAACTTTCTCAAATTGCCCAAAACTGCCATGCCCACATTTTTGAACTATTTTCGAAATTTTTTCATAATTGTATTACTCGTGTAAATTTCCATCAATTTGCCAAAAAACTTTTTGTCACGCGTTAACGCCCTAAAGCCGCCAATTTGGTCACGCCCACACTATTGAGCAATTATCAAATTTTTTCTCATTTTATTCCCCAATATCTATCGATATCCCCGATTATGAAATTATTAAATTTCGCGTTCGCATTCACACTAGCTGAGTAACGAGTATCTGATAGTTGGGGAAATCGACTTATTTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGCTTAAGGTGTAACCTCCT(SEQ ID NO：2)

根据本发明的实施例，所述重组表达载体进一步包括：第一PB转座子，所述第一PB转座子与所述第一成环元件远离所述环状RNA的一端相连；第二PB转座子，所述第二PB转座子与所述第二成环元件远离所述环状RNA的一端相连。

由于本发明的线性RNA序列较长，瞬时转染表达或依靠载体包装病毒感染细胞均效果差，不易建立细胞系。为此，发明人经过大量实验惊奇地发现，通过在第一/第二成环元件远离线性RNA的一端上连接PB转座子，可以有效地实现环状RNA过表达，且可建立稳定传代的细胞系。在一些实施例中，所述第一PB转座子和第二PB转座子各自独立地具有如SEQID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCTTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTTAA(SEQ ID NO：3)

在本发明中，“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是直接相连，例如载体上的两个片段是直接相连，具体如线性RNA与第一/第二成环元件之间或者是第一/第二成环元件与第一/第二PB转座子之间直接相连；也可以通过中间媒介间接相连，例如线性RNA与第一/第二成环元件之间或者是第一/第二成环元件与第一/第二PB转座子之间间隔着基因片段，例如外显子，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

需要说明的是，前面针对环状RNA所描述的特征和优点，同样适用于该重组表达载体，在此不再赘述。

重组细胞

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：前面所述环状RNA或前面所述重组表达载体。通过将前述重组表达载体转入初始细胞中，构建重组细胞，在重组细胞中环状RNA可以实现过表达，并且稳定传代。

需要说明的是，本发明对于“初始细胞”的类型不作严格限定，可以为动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，但是不包含人类胚胎干细胞、生殖细胞、受精卵、胚胎及个体。在一些实施例中，重组细胞选自动物胚胎干细胞，动物可以为人、鼠、牛、兔、羊、马等。动物胚胎干细胞中，环状RNA可以促进动物胚胎干细胞由始发态向原始态转变，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。其中，人胚胎干细胞可以通过购买或者赠予获得。

另外，本发明对于重组表达载体转入初始细胞的方式也不做严格限定，可以为转化、转染或感染等，具体可以为瞬时转染或者稳定转染，例如磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染或慢病毒转染，可以根据实际情况灵活选择。

需要说明的是，前面针对环状RNA或重组表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该重组细胞，在此不再赘述。

试剂盒

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述环状RNA、所述重组表达载体或所述重组细胞。利用根据本发明实施例的试剂盒可以实现环状RNA过表达，并有助于促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

需要说明的是，前面针对环状RNA、重组表达载体或重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该重组细胞，在此不再赘述。

用途和方法

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述环状RNA、所述重组表达载体、所述重组细胞或所述试剂盒在促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变或制备原始态胚胎干细胞中的用途。由此，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使处于始发态的胚胎干细胞中的环状RNA过表达；其中，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。由此，通过使环状RNA过表达，可以促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述重组表达载体转入始发态的胚胎干细胞中，以便使环状RNA过表达。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备原始态胚胎干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供始发态胚胎干细胞；使所述始发态胚胎干细胞中的环状RNA过表达；其中，所述环状RNA具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。由此，通过使环状RNA过表达，可以促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变，为干细胞在未来科学研究和临床应用提供新的方向。

根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述重组表达载体转入始发态胚胎干细胞中，以便使环状RNA过表达。

需要说明的是，前面针对环状RNA、重组表达载体、重组细胞和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该用途和方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、提供OG2-ESC细胞系作为小鼠

2、在相同环境中分别培养上述两种细胞系，培养后提取细胞总RNA，反转录成cDNA，qPCR检测circTET2的表达水平。结果如图1所示，circTET2在

3、通过对该circTET2进行测序，结果如图2所示，获知circTET2具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2

1、提取实施例1培养后的

2、取10μL上步所得连接产物转化100μL Stbl3感受态细胞：将产物与感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的500μL LB培养基，200rpm，37℃恒温摇床培养1h，8000rpm离心1min，弃去500μL培养上清，剩余100μL用移液器混匀后均匀涂布于含50μg/mL氨苄抗性的LB平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。

3、挑选阳性单菌落送至生工生物工程有限公司测序。

4、对测序正确的阳性菌株进行扩大培养，加入含相应抗生素的20ml LB培养基中37℃过夜培养，提取质粒，得到含环状RNA过表达的载体。模式图谱如图3所示。

5、使用lipo3000将实施例2构建好的含环状RNA过表达的载体转染入OG2-EpiSCs细胞系中，转染后细胞传代五代，收集细胞提取RNA，反转录成cDNA，进行qPCR检测circTET2含量，结果如图4所示，plenti-vector为慢病毒载体，PB-vector为转座子载体(由实施例2构建的含环状RNA过表达载体)，circNC是将PB-vector中TET2改成一段随机序列，在细胞中表达的是随机序列的环状RNA，起对照作用，circTET2为目的环状RNA，可以看出大片段环状RNA在细胞系中用plenti-vector的表达水平远远低于使用PB-vector的组别，证明了用PB转座子能很好的在细胞系中过表达大片段环状RNA。

实施例3

使用实施例2中建立的过表达circNC或含circTET2的OG2-EpiSCs细胞系，进行始发态向原始态转变。OG2-EpiSCs细胞系中含有GFP基因作为报告基因，当细胞由始发态向原始态时，GFP基因会显著表达，产生可检测的荧光信号。

结果如图5和图6所示，可以看出，过表达circTET2可以使小鼠胚胎干细胞由始发态向原始态转变，转变率对比对照的5.46％，可提高到13.7％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 环状RNA及其在促进胚胎干细胞由始发态向原始态转变中的应用

<130> BI3220274

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3206

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

gattcattca aagggcagcc ttgtggatgg ccccgaagca agcctgatgg aacaggacag 60

aaccacccat gctgagggca ccagactgag tccattcctg atagcaccac cttctcccat 120

cagccataca gaacctctgg ctgtcaaact ccagaatgga agcccgttag cagagagacc 180

tcatccagaa gtaaatggag acaccaagtg gcaatcttcc caaagctgtt atggaatatc 240

ccacatgaaa ggcagccaga gcagtcatga gagtccacat gaagacagag ggtattccag 300

gtgcttacag aatggaggga taaaacgcac agtcagtgaa ccatctctct ctgggctcca 360

tccaaacaag atattgaaac tagaccaaaa agctaaggga gaaagcaata tcttcgagga 420

aagccaagaa agaaaccacg gtaaaagcag ccgtcagcca aatgtctccg gactaagtga 480

taatggagag cccgtgacct cgaccaccca ggaaagttca ggtgcagatg ctttcccaac 540

acggaactac aatggagttg aaattcaggt tctcaacgag caggaagggg aaaaaggcag 600

gagcgttaca ttacttaaaa acaagattgt gctaatgcct aatggtgcta cagtttctgc 660

ccattctgag gagaacacac gtggtgaact cctggaaaaa acacagtgtt atccagattg 720

tgtctccatt gccgtgcaga gtaccgcatc tcatgtaaac acccctagca gtcaggctgc 780

tatcgagttg tcccacgaga tccctcaacc atcgcttacc tcagcgcaga tcaatttctc 840

ccagacctca agcttgcagc tgcctccaga gccagctgca atggtgacta aggcctgtga 900

tgctgataat gccagtaaac cagctatagt accaggtacc tgtccttttc agaaagcaga 960

acaccaacaa aagtcagctt tggacatagg cccatctcgt gcagaaaaca aaaccatcca 1020

aggaagcatg gagctatttg ctgaagaata ctatcctagt tccgaccgga atttgcaagc 1080

ttcgcatggc agctctgaac agtattcaaa gcaaaaggaa accaatggtg cttacttcag 1140

gcaaagctcg aagttcccta aagattccat ctctcccact actgtgaccc caccgtcaca 1200

atcacttctt gctccccgtc ttgttcttca gcctccttta gaaggaaaag gcgctctaaa 1260

tgatgtagct ttggaagaac accatgacta ccccaaccga agcaaccgaa ctcttttaag 1320

ggaagggaaa atagaccatc aacccaagac atcatctagc cagagtctga atccatctgt 1380

acatacaccc aaccccccct tgatgcttcc agaacagcat cagaatgatt gtggctcacc 1440

gagccctgaa aagtcaagaa aaatgtcaga atatctcatg tattacctgc caaatcatgg 1500

ccacagtgga ggtttacaag aacatagcca atacctgatg gggcacaggg agcaagagat 1560

tccgaaggat gcaaacggga aacaaacgca aggctctgta caggcagcac ctggctggat 1620

agaactgaaa gccccgaatt tgcatgaagc actccatcag acaaaacgca aggatatatc 1680

cttgcactca gtcctccact ctcagaccgg ccctgtcaat cagatgagct ccaaacagtc 1740

cactggcaat gtcaacatgc caggaggatt ccaaaggcta ccttacctcc agaaaacagc 1800

ccagccagag cagaaggcac aaatgtacca agtgcaagtg aaccaaggac cgtctccagg 1860

tatgggggac caacatcttc agttccagaa agctttatac caggagtgca tccccaggac 1920

agatccgtca tctgaggctc acccgcaagc accgagcgtt cctcagtatc atttccagca 1980

aagagtaaat ccctccagtg ataagcattt gagtcaacag gccacagaga ctcaacggtt 2040

atcaggcttt ttacaacata ctcctcagac gcaggcatca caaacaccag catcccagaa 2100

ctcaaatttc cctcaaatct gccagcagca gcagcagcag cagttacaga ggaagaataa 2160

agagcaaatg cctcagactt tctctcatct ccaaggtagc aatgataagc aaagagaagg 2220

ctcgtgcttt ggccagatta aagtggaaga aagcttttgt gtcggaaatc agtactccaa 2280

atcaagtaat ttccaaactc acaataatac ccaagggggg ttggagcaag tacaaaatat 2340

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<210> 2

<211> 1190

<212> DNA

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ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300

tgttatagat atctttgtta ctttatagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata 360

aataaataaa cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat 420

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agggttaa 548