沉香提取物对AMPK的激活作用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及沉香提取物对AMPK的激活作用。

背景技术

沉香是瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria Lam.)或拟沉香属植物(Gyrinops Gaertn.)在伤害诱导防御反应下形成的含树脂木材。在我国，沉香药材主要来自瑞香科植物白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)，是临床常用传统名贵药材，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，广泛应用于中成药、藏药和日本汉方药。

AMPK(一磷酸腺苷激活的蛋白激酶，Adenosin 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛存在于真核细胞中。AMPK已被发现是治疗各种疾病的重要药物靶点，它是治疗糖尿病的一线临床药物二甲双胍的主要效应物，也被认为是控制代谢综合征、癌症等人类疾病的重要治疗靶点。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)激动剂长期以来一直作为研究肥胖、糖尿病等代谢性疾病的国际热点。

具体而言，AMPK信号通路是一种能量的传感器和调节器，在促进各种组织中ATP的产生并抑制ATP的消耗过程中发挥着重要的作用。该激酶在应对耗尽细胞ATP供应的应激时被激活，如低血糖、缺氧、缺血和热休克。AMPK作为能够对低ATP水平作出高效反应的细胞能量传感器，AMPK的激活可以积极调节和补充细胞ATP供应的信号通路。例如，AMPK的激活可以有效促进GLUT4转录和易位，进而会导致机体受胰岛素刺激而产生的葡萄糖摄取增加。

作为脂质和糖代谢的中央调节器，AMPK被认为是治疗肥胖、二型糖尿病和癌症的关键治疗靶点。AMPK负调节ATP消耗过程中的几个核心蛋白质，如CREB转录共激活因子(TORC2)和糖原合酶最终都可以导致糖异生、糖原、脂质和蛋白质合成的下调或抑制。AMP活化蛋白激酶(AMPK)在调节细胞能量稳态中起着重要作用。这种酶在低ATP条件下被激活，通常由各种应激引起，并调节增加可用ATP供应的信号通路。

近年来，人们对AMPK激活和AMPK信号通路都有了许多新的认识。新的发现认为，葡萄糖水平下降时，AMPK能够在ATP水平下降之前就被激活，及时补充了潜在ATP的不足。

目前已知的AMPK的间接激活方式，主要有两种。其中更重要的是升高细胞内AMP/ATP的比值，如盐酸小檗碱、二甲双胍就是通过抑制呼吸链来增加AMP/ATP的比值以达到间接激活AMPK的效果，从而产生疗效。

AMPK作为机体能量调控过程中的重要激酶通过感知机体内ATP的水平高低，来维持细胞自身能量供应和营养补给。在低能量供应条件下，AMPK磷酸化特异性的酶和位点，能增加ATP生成，降低ATP消耗。在哺乳动物体内，当AMPK被激活，它的调控几乎作用于生命体的整个生理代谢过程，在蛋白质代谢、脂质代谢、糖类代谢、自噬和线粒体稳态四大类生理代谢活动中具有不可或缺的重要作用。遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。AMPK的激活能积极改善由二型糖尿病引起的代谢失衡，然而激活AMPK的分子机制十分复杂，通过药物分子激活AMPK，找到能够高效激活AMPK且低副作用的AMPK激活剂，是治疗糖尿病所面临的一个巨大挑战。

而沉香中的包含巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物(简称“FTPECs”)和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物(简称“THPECs”)的提取物未见与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的相关报道。

发明内容

基于此，本发明提供了一种沉香提取物在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

进一步地，该沉香提取物包括巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

进一步地，该沉香提取物通过包括以下步骤的制备方法进行制备：

(1)称取适量的沉香样品，加入一定质量/体积之比的醇溶液；

(2)室温浸泡之后进行提取；以及

(3)冷却并过滤，去除溶剂并干燥，得到该沉香提取物。

进一步地，该质量/体积之比的单位为g/ml或kg/L。

进一步地，该质量/体积之比为1:50～300，例如1:75～200，例如1:90～150，例如约1:100。

进一步地，该醇为乙醇。

进一步地，该醇溶液的体积百分比浓度为80～100％，例如约95％。

进一步地，该室温浸泡的时间为0.2h～1h，例如约0.5h。

进一步地，该提取为回流提取或超声提取，例如微沸回流提取。

进一步地，该提取的时间为0.5h～2h，例如约1h。

进一步地，该干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。

进一步地，该制备方法进一步包括将该沉香提取物悬浮于水中之后，使用二氯甲烷进行萃取，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

进一步地，在使用该二氯甲烷萃取之前，使用石油醚进行萃取。

进一步地，该制备方法进一步包括以下步骤：

(4)将该沉香提取物加入一定质量/体积之比的溶剂溶解之后加入一定质量/质量之比的干硅胶粉，搅拌并挥干溶剂，干法上样于硅胶层析柱中；

(5)使用洗脱液进行洗脱冲洗，其中所述洗脱液包括二氯甲烷和/或甲烷；以及

(6)收集流分，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

进一步地，该质量/体积之比的单位为g/ml或kg/L。

进一步地，该质量/体积之比为1:10～50，例如1:15～30，例如约1:22。

进一步地，该质量/质量之比的单位为g/g或kg/kg。

进一步地，该质量/质量之比为1～5:10，例如约1:7。

进一步地，该溶剂为醇溶液与二氯甲烷的混合物。

进一步地，该醇为乙醇。

进一步地，该醇溶液的体积百分比浓度为80～100％，例如约95％。

进一步地，该醇溶液与该二氯甲烷的体积之比为约3:约2。

进一步地，该溶解为在超声条件下进行溶解。

进一步地，该超声的时间为0.5～2min，例如约1min。

进一步地，该洗脱液包括二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇＝约40：约1和/或二氯甲烷：甲醇＝约1：约1。

进一步地，该洗脱的顺序为以二氯甲烷洗脱0.5～8个柱体积，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱0.5～10个柱体积，以及以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱0.5～10个柱体积。

进一步地，该洗脱的顺序为以二氯甲烷洗脱约4个柱体积，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱约3个柱体积，收集3个流分，每个流分约1个柱体积，以及以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱约1个柱体积。

进一步地，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱的中间流分为巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位。

进一步地，以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱的约1个柱体积所对应的流分为5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述沉香提取物的组合物在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

进一步地，该组合物进一步包括一种或多种药物和/或提取物。

进一步地，该药物包含降糖药。

进一步地，该降糖药选自以下的一种或多种：格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、格列波脲、格列美脲、格列喹酮、阿卡波糖、伏格列波糖、吡格列酮、西格列汀、沙格列汀、维格列汀、二甲双胍、罗格列酮和胰岛素。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述沉香提取物或者上述组合物的制剂在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

进一步地，该制剂进一步包括一种或多种药学上可接受的辅料。

进一步地，该辅料选自以下的一种或多种：分散剂、润湿剂、粘合剂、稀释剂、助流剂、润滑剂、缓释剂、增塑剂、崩解剂、包合剂、矫味剂、遮光剂和抗氧化剂。

进一步地，该制剂的剂型为片剂、滴丸剂、胶囊剂、散剂、注射液、膜剂、锭剂、颗粒剂或口服液。

进一步地，该糖尿病包括I型糖尿病和/或II型糖尿病。

进一步地，该并发症为急性并发症和/或慢性并发症。

进一步地，该急性并发症为糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷和/或乳酸性酸中毒。

进一步地，该慢性并发症为大血管并发症、微血管并发症、神经病变和/或糖尿病足。

进一步地，该大血管并发症为心脑血管病变、冠心病、脑卒中和/或下肢坏疽。

进一步地，该微血管并发症为糖尿病视网膜病变和/或糖尿病肾病。

进一步地，与AMPK激活相关的糖尿病和/或其并发症相关的细胞为人肾上皮细胞系细胞。

进一步地，该人肾上皮细胞系细胞为HEK293T细胞。

进一步地，该AMPK激活是间接激活机制。

进一步地，该AMPK包含α2亚基、β1亚基和γ1亚基。

进一步地，该AMPK的活化发生在肌肉、肝脏和/或肾脏组织中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备沉香提取物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)称取适量的沉香样品，加入一定质量/体积之比的醇溶液；

(2)室温浸泡之后进行提取；

(3)冷却并过滤，去除溶剂并干燥，得到该沉香提取物；

(4)将该沉香提取物溶解于溶剂之后上样于硅胶层析柱中；

(5)使用不同梯度的二氯甲烷：甲醇进行洗脱冲洗；以及

(6)收集流分，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

本发明的有益效果：

本发明所述的沉香提取物能够显著激活AMPK的体外活性，并能够促进葡萄糖摄取，可应用在制备与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

图1为混合对照品溶液的出峰色谱图。

图2为制备方法1所对应的流分结果示意图。其中，1表示二氯甲烷：甲醇1：0第一流分；2表示二氯甲烷：甲醇1：0第二流分；3表示二氯甲烷：甲醇1：0第三流分；4表示二氯甲烷：甲醇1：1第一流分；5表示二氯甲烷：甲醇1：1第二流分；6表示二氯甲烷:甲醇1：1第三流分；7表示二氯甲烷：甲醇0：1第一流分；8表示二氯甲烷：甲醇0：1第二流分。

图3为制备方法2所对应的流分结果示意图。其中，1表示二氯甲烷：甲醇1：0第一流分；2表示二氯甲烷：甲醇1：0第二流分；3表示二氯甲烷：甲醇40：1第一流分；4表示二氯甲烷：甲醇40：1第二流分；5表示二氯甲烷：甲醇40；1第三流分；6表示二氯甲烷：甲醇1:1第一流分。

图4为沉香提取物在293T细胞中激活AMPK的体外活性结果示意图。其中，结果以平均值±SD(n＝3)的形式呈现，与溶剂对照(DMSO)，**p<0.01，***p<0.001。

图5为沉香提取物的不同溶剂萃取部位在293T细胞中激活AMPK的体外活性结果示意图。其中，1号代表石油醚(PE)萃取部位，2号代表二氯甲烷萃取部位，3号代表乙酸乙酯(EtOAc)萃取部位，4号代表正丁醇萃取部位，5号代表萃取后水部位。

图6为沉香提取物不同分离部位促进成熟3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取结果示意图。其中，结果以平均值±SD(n＝3)的形式呈现，与溶剂对照(DMSO)，**p<0.01。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。

本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

正如背景技术部分所描述的，沉香中的包含巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物的提取物未见与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的相关报道的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种沉香提取物在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

在一种优选的实施方式中，该沉香提取物包括巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

在一种优选的实施方式中，该沉香提取物通过包括以下步骤的制备方法进行制备：

(1)称取适量的沉香样品，加入一定质量/体积之比的醇溶液；

(2)室温浸泡之后进行提取；以及

(3)冷却并过滤，去除溶剂并干燥，得到该沉香提取物。

在一种优选的实施方式中，该质量/体积之比的单位为g/ml或kg/L。

在一种优选的实施方式中，该质量/体积之比为1:50～300，例如1:75～200，例如1:90～150，例如约1:100。

在一种优选的实施方式中，该醇为乙醇。

在一种优选的实施方式中，该醇溶液的体积百分比浓度为80～100％，例如约95％。

在一种优选的实施方式中，该室温浸泡的时间为0.2h～1h，例如约0.5h。

在一种优选的实施方式中，该提取为回流提取或超声提取，例如微沸回流提取。

在一种优选的实施方式中，该提取的时间为0.5h～2h，例如约1h。

在一种优选的实施方式中，该干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。

在一种优选的实施方式中，该制备方法进一步包括将该沉香提取物悬浮于水中之后，使用二氯甲烷进行萃取，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

在一种优选的实施方式中，在使用该二氯甲烷萃取之前，使用石油醚进行萃取。

在一种优选的实施方式中，该制备方法进一步包括以下步骤：

(4)将该沉香提取物加入一定质量/体积之比的溶剂溶解之后加入一定质量/质量之比的干硅胶粉，搅拌并挥干溶剂，干法上样于硅胶层析柱中；

(5)使用洗脱液进行洗脱冲洗，其中所述洗脱液包括二氯甲烷和/或甲烷；以及

(6)收集流分，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

在一种优选的实施方式中，该质量/体积之比的单位为g/ml或kg/L。

在一种优选的实施方式中，该质量/体积之比为1:10～50，例如1:15～30，例如约1:22。

在一种优选的实施方式中，该质量/质量之比的单位为g/g或kg/kg。

在一种优选的实施方式中，该质量/质量之比为1～5:10，例如约1:7。

在一种优选的实施方式中，该溶剂为醇溶液与二氯甲烷的混合物。

在一种优选的实施方式中，该醇为乙醇。

在一种优选的实施方式中，该醇溶液的体积百分比浓度为80～100％，例如约95％。

在一种优选的实施方式中，该醇溶液与该二氯甲烷的体积之比为约3:约2。

在一种优选的实施方式中，该溶解为在超声条件下进行溶解。

在一种优选的实施方式中，该超声的时间为0.5～2min，例如约1min。

在一种优选的实施方式中，该洗脱液包括二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇＝约40：约1和/或二氯甲烷：甲醇＝约1：约1。

在一种优选的实施方式中，该洗脱的顺序为以二氯甲烷洗脱0.5～8个柱体积，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱0.5～8个柱体积，以及以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱0.5～8个柱体积。

在一种优选的实施方式中，该洗脱的顺序为以二氯甲烷洗脱约4个柱体积，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱约3个柱体积，收集3个流分，每个流分约1个柱体积，以及以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱约1个柱体积。

在一种优选的实施方式中，以二氯甲烷：甲醇＝约40：约1洗脱的中间流分为巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位。

在一种优选的实施方式中，以二氯甲烷：甲醇＝约1：约1洗脱的约1个柱体积所对应的流分为5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1:100”包括1:100的±5％，或从1:95到1:105，包含1:95和1:105；

“约95”包括95的±5％，或从90.25到99.75，包含90.25和99.75；

“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525，包含0.475和0.525；

“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05，包含0.95和1.05；“约1:22”包括1:22的±5％，或从1:20.9到1:23.1，包含1:20.9和1:23.1；

“约1:7”包括1:7的±5％，或从1:6.65到1:7.35，包含1:6.65和1:7.35；“约3”包括3的±5％，或从2.85到3.15，包含2.85和3.15；

“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1，包含1.9和2.1；“约4”包括4的±5％，或从3.8到4.2，包含3.8和4.2；“约40”包括40的±5％，或从38到42，包含38和42。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述沉香提取物的组合物在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

在本发明中，术语“治疗”也包括“预防”，除非存在与此相反的具体说明。术语“治疗(的)”和“治疗(地)”应该作相应的理解。

在本发明中，术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生；改善或预防潜在代谢综合症；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，某一组合物或某一制剂，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。

在一种优选的实施方式中，该组合物进一步包括一种或多种药物和/或提取物。

在一种优选的实施方式中，该药物包含降糖药。

在一种优选的实施方式中，该降糖药选自以下的一种或多种：格列吡嗪、格列齐特、格列本脲、格列波脲、格列美脲、格列喹酮、阿卡波糖、伏格列波糖、吡格列酮、西格列汀、沙格列汀、维格列汀、二甲双胍、罗格列酮和胰岛素。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述沉香提取物或者上述组合物的制剂在制备用于预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的药品、食品、饮料或饮食补充剂中的用途。

在一种优选的实施方式中，该制剂进一步包括一种或多种药学上可接受的辅料。

在一种优选的实施方式中，本发明的制剂含有相对于制剂的重量计算总量为0.00001至50wt.％、或0.0001至10wt.％、或0.0001至5wt.％、或0.005至1wt.％、或0.1至20wt.％、或0.5至15wt.％、或1至5wt.％的至少一种药学上可接受的辅料。

在本发明中，术语“药学上可接受”这里指一种物质，如载体或稀释液，不会使提取物中的化合物的生物活性或性质消失，且相对无毒，如，给予个体某物质，不会引起不想要的生物影响或以有害的方式与任何其含有的组分相互作用。

在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。

在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：分散剂、润湿剂、粘合剂、稀释剂、助流剂、润滑剂、缓释剂、增塑剂、崩解剂、包合剂、矫味剂、遮光剂和抗氧化剂。

本领域技术人员将知晓如何选择具体的在上述辅料类别范围内的化学物质。例如，该分散剂可选自以下的一种或多种：交联羧甲基纤维素钠、淀粉甘醇钠和预明胶化的玉米淀粉。该润湿剂可选自以下的一种或多种：硬脂酸聚甲醛、泊洛沙姆、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、鲸蜡醇、甘油脂肪酸酯(如三醋精、甘油单硬脂酸酯和类似物)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯醚、苯扎氯铵、聚氧乙烯蓖麻油和多库酯钠。该粘合剂可选自以下的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、聚乙二醇和甲基纤维素。该稀释剂可选自以下的一种或多种：糖粉、淀粉、可压性淀粉、乳糖、糊精、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、硫酸钙和碳酸钙。该助流剂为微粉硅胶。该润滑剂可选自以下的一种或多种：硬脂酸钙、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和胶态二氧化硅。该缓释剂可选自以下的一种或多种：羧甲基纤维素钠、低取代的羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、明胶和紫胶。该增塑剂可以是二丁基癸二酸酯和/或各种柠檬酸酯。该崩解剂可选自以下的一种或多种：羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐和羧甲基纤维素钠。该包合剂为羟丙基倍他环糊精。该矫味剂可选自以下的一种或多种：山梨醇、葡萄糖、甘露糖、蔗糖和乳糖。该遮光剂为二氧化钛。该抗氧化剂可选自以下的一种或多种：亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠和硫代硫酸钠。

这些辅料优选为药物惰性的，或者可以具有协同或增加作用，以增强药物组合物的治疗活性，并且上述辅料仅是列举式的，本发明实际使用的辅料并不限于上述辅料，可根据实际情况进行调整，均能实现本发明的效果。

在一种优选的实施方式中，该制剂的剂型为片剂、滴丸剂、胶囊剂、散剂、注射液、膜剂、锭剂、颗粒剂或口服液。

在一种优选的实施方式中，该糖尿病包括I型糖尿病和/或II型糖尿病。

在一种优选的实施方式中，该并发症为急性并发症和/或慢性并发症。

在一种优选的实施方式中，该急性并发症为糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷和/或乳酸性酸中毒。

在一种优选的实施方式中，该慢性并发症为大血管并发症、微血管并发症、神经病变和/或糖尿病足。

在一种优选的实施方式中，该大血管并发症为心脑血管病变、冠心病、脑卒中和/或下肢坏疽。

在一种优选的实施方式中，该微血管并发症为糖尿病视网膜病变和/或糖尿病肾病。

在一种优选的实施方式中，与AMPK激活相关的糖尿病和/或其并发症相关的细胞为人肾上皮细胞系细胞。

在一种优选的实施方式中，该人肾上皮细胞系细胞为HEK293T细胞。

在一种优选的实施方式中，该AMPK激活是间接激活机制。

在一种优选的实施方式中，该AMPK包含α2亚基、β1亚基和γ1亚基。

在一种优选的实施方式中，该AMPK的活化发生在肌肉、肝脏和/或肾脏组织中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述沉香提取物、上述组合物或上述制剂，用于预防和/或治疗受试者中的与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症。

根据本发明的另一个方面，提供了一种预防和/或治疗与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症的方法，包括向该受试者施用有效量的上述沉香提取物、上述组合物或上述制剂。

在本发明中，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表与AMPK激活相关的糖尿病、肥胖症和/或其并发症模型的受试者。优选地，该受试者是人。

本发明所用的组合物或制剂的“有效量”可以获得所需要的治疗和/或预防效果。对此用途有效的量将取决于例如药物组合物、给药方式、治疗的疾病的阶段和严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备沉香提取物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)称取适量的沉香样品，加入一定质量/体积之比的醇溶液；

(2)室温浸泡之后进行提取；

(3)冷却并过滤，去除溶剂并干燥，得到该沉香提取物；

(4)将该沉香提取物溶解于溶剂之后上样于硅胶层析柱中；

(5)使用不同梯度的二氯甲烷：甲醇进行洗脱冲洗；以及

(6)收集流分，得到巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和/或5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例

1.材料与仪器

1.1材料

人源肾胚上皮细胞株HEK293T细胞(清华大学生命科学学院保藏，原购自美国模式培养物集存库，American Type Culture Collection，ATCC)和3T3-L1小鼠脂肪前体细胞(购自美国模式培养物集存库，American Type Culture Collection，ATCC)；抗AMPK磷酸化和抗AMPK总量抗体(美国Cell Signalling公司)；抗β-actin的抗体(北京BI公司)；PBS磷酸盐缓冲液(Hyclone)；南美胎牛血清(Gibco)；青链霉素双抗混合液(Hyclone)；胰蛋白酶(trypsin)；PVDF膜(美国Millipore公司)；葡萄糖摄取试剂盒(Promega)；DMEM高糖培养基(Gibco)；OPTI-MEM培养基(Hyclone)；支原体抑制剂(ScienCell)；地塞米松(DEX)、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素(Insulin)、1-甲基-3-异丁醇黄嘌呤(IBMX)、5'-ATP二钠盐、5'-AMP二钠盐、5'-ADP二钠盐、二甲双胍(Met)、盐酸小檗碱(BBR)和Compund C均来源于美国Sigma公司。沉香样品经中国中医科学院中药研究所张志杰教授鉴定后，保存于中药所生药中心药材储藏室。甲醇(批号：20230504，北京市通广精细化工公司)。二氯甲烷(批号：20230515，天津市富宇精细化工有限公司)。硅胶粉(200-300目，青岛海洋化工厂)。无水乙醇(批号：20230603，北京市通广精细化工公司)。层析柱、玻璃棒、烧杯和量筒来源于商购。

对照品：沉香四醇(批号：111980-201904，纯度≥98％)购自中国食品药品检定研究院；6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮(批号：AF21042704，纯度≥98％)、异沉香四醇(批号：AF21042702，纯度≥98％)、8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮(批号：AF210328076，纯度≥95％)、4’-甲氧基沉香四醇(批号：AF21042706，纯度≥90％)以及6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(批号：AF22030801，纯度≥98％)均购自成都埃法生物科技有限公司；6,7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮(批号：STC8600105，纯度≥98％)、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(批号：STC6680105，纯度≥98％)以及6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯)乙基]色酮(批号：STC6690105，纯度≥98％)均购自上海诗丹德生物技术有限公司；2-(2-苯乙基)色酮(批号：PS020524，纯度＞98％)购自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2仪器

Scientz-IID型超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物公司)，DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一仪器厂)，ELITE II型二氧化碳恒温培养箱(Revco公司)，YP4002N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)，SK7210HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，LC-20T型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器邮箱公司)。

2.实验方法

2.1药物制备

2.1.1沉香提取物的制备

精密称取沉香样品5g，加入500ml 95％乙醇，室温浸泡半小时后微沸回流提取1小时。提取结束冷却后用8层纱布和0.45μm微孔滤膜过滤，滤液旋转蒸发去除乙醇，冷冻干燥，得到沉香提取物。

细胞给药时，沉香提取物溶于DMSO并稀释至合适浓度，DMSO的最终浓度为0.1％对细胞无毒性。

将沉香提取物悬浮在水中后，依次使用石油醚(PE)、二氯甲烷和乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇进行萃取。

2.1.2巨盘木型-2-2苯乙基色酮类化合物分离部位和5,6,7,8-四羟基型-2-(2-苯乙基)色酮类化合物分离部位的制备

2.1.2.1制备方法1

(1)铁架台固定层析柱，层析柱活塞关闭；

(2)向层析柱底部放一小块棉花，然后放1-2cm高的石英砂；

(3)柱中倒入20mL二氯甲烷(1/3-1/4柱体积的液体)；

(4)打开活塞，洗耳球敲打柱身，排出棉花和石英砂中的气泡；

(5)关闭活塞，柱内留有液体(1/3-1/4柱体积的液体)；

(6)称取5.06g硅胶粉，用15-20mL二氯甲烷稀释，搅拌成糊状；

(7)打开活塞，将搅拌好的硅胶粉匀浆一次性倒入层析柱中；

(8)洗耳球敲打柱身，使硅胶下沉压实(最后硅胶柱体积为14mL)；

(9)硅胶压实后，待液体流到距离硅胶面1-2cm处，关闭活塞；

(10)称取0.26g沉香提取物粉末(来源于“2.1.1沉香提取物的制备”)，用4mL溶剂(3mL95％乙醇，1mL二氯甲烷)溶解，超声1min；

(11)用1mL胶头滴管吸取样品溶液，沿柱壁缓慢滴加至硅胶层析柱中；

(12)上样完成后，用不同梯度的二氯甲烷：甲醇洗脱冲洗；

(13)洗脱顺序：①二氯甲烷：甲醇＝1：0(三个柱体积)收集3个流分(各流分均为1个柱体积)、②二氯甲烷：甲醇＝1：1(三个柱体积)收集3个流分(各流分约为1个柱体积)、③二氯甲烷：甲醇＝0：1(三个柱体积)收集1个流分；

(14)各流分取5ml置旋转蒸发仪旋干，然后用5ml95％乙醇复溶；

(15)复溶后的溶液，过0.22μm的微孔滤膜，进高效液相。

2.1.2.2制备方法2

(1)铁架台固定层析柱，层析柱活塞关闭；

(2)向层析柱底部放一小块棉花，然后放1-2cm高的石英砂；

(3)柱中倒入20mL二氯甲烷(1/3-1/4柱体积的液体)；

(4)打开活塞，洗耳球敲打柱身，排出棉花和石英砂中的气泡；

(5)关闭活塞，柱内留有液体(1/3-1/4柱体积的液体)；

(6)称取5.13g硅胶粉，用15-20mL二氯甲烷稀释，搅拌成糊状；

(7)打开活塞，将搅拌好的硅胶粉匀浆一次性倒入层析柱中；

(8)洗耳球敲打柱身，使硅胶下沉压实(最后硅胶柱体积为14mL)；

(9)硅胶压实后，待液体流到距离硅胶面2-3cm处，关闭活塞；

(10)称取0.23g沉香提取物粉末(来源于“2.1.1沉香提取物的制备”)，用5mL溶剂(3mL95％乙醇，2mL二氯甲烷)溶解，超声1min；

(11)向溶解好的样品溶液加入1.59g干硅胶粉，用玻璃棒搅拌均匀，置于通风橱中放置过夜，待溶剂完全挥干；

(12)向硅胶层析柱中倒入吸附好样品的硅胶粉末；

(13)用洗耳球敲打柱身，使样品硅胶粉末下沉；

(14)上样完成后，用不同梯度的二氯甲烷：甲醇洗脱冲洗；

(15)洗脱顺序：①二氯甲烷：甲醇＝1：0(4个柱体积，收集2个流分，各流分2个柱体积)、②二氯甲烷：甲醇＝40：1(3个柱体积，收集3个流分，各流分1个柱体积)、③二氯甲烷：甲醇＝1：1(3个柱体积，收集3个流分，各流分1个柱体积)、④二氯甲烷：甲醇＝0：1(3个柱体积，收集1个流分)。

(16)各流分取5ml置旋转蒸发仪旋干，然后用5ml 95％乙醇复溶。

(17)复溶后的溶液，过0.22μm的微孔滤膜，进高效液相。

2.1.2.3制备方法3

(1)称取0.23g沉香提取物粉末(来源于“2.1.1沉香提取物的制备”)，用5mL溶剂(即无水乙醇)溶解，超声1min；

(2)将溶解好的样品溶液上MCI柱，以不同乙醇-水(水、30％、50％、70％、95％乙醇)比例对沉香提取物进行部位分离。

2.2对照品溶液制备与检测

取对照品沉香四醇、异沉香四醇、8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮、6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮、6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基)苯乙基]色酮、6,7-二甲氧基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、2-(2-苯乙基)色酮、4’-甲氧基沉香四醇适量，精密称定，用无水乙醇充分溶解配制成1mg/ml的对照品母液，过0.22μm滤膜，即得。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，测定洗脱梯度条件为0-20min，20-25％ A；20-60min，25-65％ A；60-65min，65-75％ A；65-70min，75-95％ A。柱温30℃，流速1ml/min，进样量10μl。

2.3人肾上皮细胞系HEK293T细胞的培养和药物处理

HEK293T细胞在提前配制的含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基中进行培养，CO

2.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹检测

给药后收集细胞后加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液在4℃下进行裂解2小时，然后将细胞裂解液离心后取上清液，用β-巯基乙醇处理样品30分钟，并煮沸5分钟使蛋白质变性。将细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，以湿转法将分离后的蛋白转移PVDF膜上，接着用5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2h，再用抗AMPK抗体(CellSignaling)和抗p-AMPK抗体(Cell Signaling)在4℃下孵育过夜，然后用山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(Santa Cruz)在室温下孵育1小时，充分洗膜后加入发光物，放入暗室曝光感光胶片，再拍照并处理图谱数据。

其中AMPK总量作为参照，使用NIH Image J软件分析并获取不同浓度点pAMPK和AMPK蛋白免疫印迹条带灰度值，以pAMPK/AMPK比值代表AMPK磷酸化水平，利用GraphPadPrism 6.0对pAMPK/AMPK进行统计分析，**即p＜0.01以及***即p＜0.001表明差异具有显著统计学意义。

2.5葡萄糖摄取-生物体外分析

葡萄糖摄取检测实验通过Promega葡萄糖摄取检测试剂盒完成，用试剂盒对药物处理后的成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取能力进行检测。试剂盒从-20℃冰箱中取出解冻。按照试剂盒的使用说明，试剂盒中的中和缓冲液和终止缓冲液于4℃保存，其余组分在-20℃保存。实验方法如下：

(1)细胞处理

3T3-L1细胞诱导至第7天成为成熟的脂肪细胞。换液，除去维持液，加入含有药物的全培养基处理24h，在37℃，5％ CO

(2)脱糖处理

对细胞进行24h药物处理后，移除培养基，加入含有药物的无糖无血清无抗培养基饥饿处理2-3h，于37℃，5％ CO

(3)胰岛素激活

移除(2)中培养基，加入含有10μg/mL胰岛素的PBS溶液，于37℃、5％ CO

(4)配制2DG6P检测反应液

提前1h配制该反应液。按照100μL/样品的体积，根据试剂盒说明书提供的各组比例配制。

(5)配制细胞反应液

用PBS小心清洗胰岛素处理过的细胞以及未激活的细胞。用1mM2DG溶液于37℃，5％ CO

(6)葡萄糖摄取的检测

取100μL细胞反应液与100μL 2DG6P检测反应液放入96孔板中充分混合，避光孵育1h(室温)，在EnSpire多模式微孔板检测仪上检测各实验组的荧光强度。

2.6数据处理及统计学分析

蛋白质印迹法条带分析采用NIH Image J图像分析软件，采用GraphPad Prism6.0进行统计学分析包括单因素方差分析(ANOVA)和均值比较。*表示P<0.05说明结果具有统计学意义，**表示P<0.01以及***表示P<0.001说明结果具有显著的统计学差异。

3.结果

3.1化合物类型确定

根据混合对照品溶液的出峰图谱数据，如图1所示，得知前3个出峰的化合物为极性大的THPECs类化合物，后面出峰的为FTPECs类化合物。

3.2分离部位的制备方法优化

如图2所示，所需的相关活性部位(即THPECs类化合物分离部位和FTPECs类化合物分离部位)主要分布在二氯甲烷：甲醇(1：0)第一个流分和二氯甲烷：甲醇(1：1)第二个流分中，由于上样是用95％乙醇溶解样品的湿法上样，所以导致二氯甲烷：甲醇(1：0)洗脱的第一个流分中一些极性大的物质也有部分洗脱出来。

根据上述结果，将上样方法做进一步的优化，具体如“2.1.2.2制备方法2”所示。

如图3所示，所需的相关活性部位主要分布在二氯甲烷：甲醇(40：1)第二个流分(将该流分旋蒸至干，得到FTPECs类化合物分离部位)和二氯甲烷：甲醇(1：1)第一个流分(将该流分旋蒸至干，得到THPECs类化合物分离部位)中，由于洗脱过程用二氯甲烷：甲醇(1：0)洗脱，硅胶柱中样品的几乎没有流出，所以使用二氯甲烷：甲醇(40：1)进行进一步洗脱。该制备方法实现了沉香提取物中THPECs类化合物和FTPECs类化合物非常有效地分离，取得了预料不到的技术效果。

“2.1.2.3制备方法3”所涉及的技术方案无法实现沉香提取物中THPECs类化合物和FTPECs类化合物的分离。

3.3沉香活性验证

为了检测沉香提取物是否能够激活AMPK，我们用不同浓度的沉香提取物处理HEK293T细胞1小时，然后用SDS-PAGE和Western Blot(蛋白免疫印迹)检测细胞裂解液中pAMPK(Thr-172)及AMPK水平。如图4所示，经沉香提取物处理后，细胞中pAMPK水平呈剂量依赖性升高。Western Blot分析结果展示沉香提取物均能够在体外HEK293T细胞中激活AMPK，均具有AMPK激活活性并且以活性-剂量依赖的方式激活。在120μg/ml的浓度下沉香提取物的AMPK激活能力与阳性药物二甲双胍相似。

沉香提取物的AMPK激活能力集中在二氯甲烷萃取部位，如图5所示。

3.4葡萄糖摄取-生物体外分析

胰岛素敏感性与细胞葡萄糖摄取能力有着密切的关系。为了研究沉香提取物不同分离部位对成熟3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响，首先我们经过7-8天诱导分化脂肪前体细胞成为成熟的脂肪细胞，观察细胞状态良好，并出现大量脂滴。

然后用不同分离部位的沉香提取物(即THPECs类化合物分离部位和FTPECs类化合物分离部位)加DMSO配制成细胞实验的母液，以20μg/ml的浓度处理细胞，检测了非胰岛素依赖性葡萄糖摄取。分别用等浓度的沉香提取物不同分离部位处理成熟的3T3-L1细胞，用1μM BBR作为阳性对照。为了验证样品是通过激活AMPK促进细胞摄取葡萄糖，我们用20uMAMPK抑制剂Compund C与药物同时处理细胞。经过24h处理后，用含有相同药物的无糖、无血清、无双抗的培养基饥饿处理细胞2h。

最后除去饥饿培养基，向细胞中加入葡萄糖摄取检测试剂盒中的2DG(葡萄糖替代物)，细胞经过20分钟的摄取2DG，最后利用Promega葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖的摄取量，收集和分析数据，以DMSO点的2DG摄取量为1，对数据使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析，对其所有数据进行处理，得到各组数据结果，形成统计图。

结果如图6所示，沉香提取物的两个分离部位均能够在成熟脂肪细胞中促进葡萄糖的摄取。THPECs分离部位能提升细胞葡萄糖摄取1.4倍，FTPECs分离部位能提升细胞葡萄糖摄取1.59倍，作为阳性对照的BBR则能提升1.44倍，并且FTPECs分离部位相对于THPECs分离部位，表现出显著性差异(p＜0.01)。使用AMPK抑制剂Compound C和样品同时处理后，细胞葡萄糖摄取没有明显变化。

实验结果表明：沉香提取物的两个分离部位均可以提升非胰岛素依赖的葡萄糖摄取，在存在Compound C的实验组中，沉香提取物的两个分离部位并不能够提升葡萄糖的摄取量。说明沉香提取物的两个分离部位通过激活AMPK来促进非胰岛素依赖地葡萄糖摄取，当AMPK活性被抑制时，其葡萄糖摄取的促进作用会消失。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。