一种核酸检测装置
文献发布时间:2024-04-18 19:58:26
本申请主张中国在先申请,申请号:2022100300570,申请日2022年1月11日的优先权;其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及一种核酸检测装置。
背景技术
随着科学技术的发展,病原体、环境微生物、生化指标、肿瘤和器官标志物、毒品等领域的检测技术和设备得到了长足的发展。如应用核酸扩增原理的PCR仪、恒温扩增仪,在病原体、环境微生物检测领域正在逐渐取代传统的涂片或镜检的方法;自动化化学发光平台为生化指标、肿瘤标志物等检测项目提供了灵敏、快速、高通量的解决方案。
检测需求的扩大和检测场景丰富,使得POCT(point-of-care testing)式的检测成为近年来检测领域发展的主要方向之一。POCT检测是指在采样现场即刻进行分析,快速得到检验结果的一种检测形式。如POCT核酸检测仪,将核酸提取、扩增、荧光检测等功能全部整合在一台小型化的仪器上,可以在非实验室条件下进行快速、准确的核酸检测。
与传统的大型设备或标准实验室相比,POCT检测设备为广大基层单位,偏远地区或其他医疗条件不足的场景,提供了现场检测手段。同时,它也为对检测时间较为敏感的检测项目提供了便捷的快速方案。许多POCT产品如小型血糖仪,尿糖试纸装置等已经开始走进居家场景,由使用者以自检的形式完成检测。
许多情况下,人们希望能够通过自检的方式完成检测;而在一些野外环境或者缺乏专业人员、设备的情况下,人们更是迫切需要一种成本低廉,快速简单,结果准确,不需要专业培训即可使用的检测装置。该装置应具有广泛的场景适应性和使用安全性。
但是目前的小型检测装置依然存在着诸多的问题:1.目前小型化检测仪器对于老百姓来说,依然存在成本过高的问题;2.由于核酸检测往往需要进行核酸扩增或荧光信号的采集和分析,需要较为复杂的设备和专业技巧,目前国内居家自检的设备,仍不能实现核酸检测;3.目前的试纸类自检产品虽然满足了一定的要求,但是依然存在加样不精确,难以进行定量和多重检测困难等问题;4.目前自检装置检测灵敏度低;5.目前自检装置检测所需时间较长;6.目前的家庭检测装置缺乏灵活性,存在重复开发和资源浪费的问题。
CN113512490A提供了一种自驱动微流控检测装置,通过微流控导流组件实现样品的加样、扩增和检测,但微流控导流过程复杂,且容易受到环境温度、湿度的影响,容易出现检测误差。WO2022/043697A1提供了一种分析生物样品的装置,但其需要通过拉杆、活塞等控制手段选择性地打开不同区域,从而实现样品从一个区域到另一个区域的转移,操作过程繁琐,容易出错,且结构复杂。
因此市场需要一种成本低廉,结构简单、快速简便,能够实现加样和检测过程的精确控制,检测灵敏度高、检测时间短、安全可靠、无需经过专业培训即可使用的一次性检测装置。
发明内容
为弥补已有技术的缺陷,本发明提供了一种核酸检测装置,将加样、核酸提纯、恒温扩增、免疫层析法读取检测结果功能集成在一种装置上,先通过核酸吸附膜吸附核酸,多余样品进入滤纸储存槽,并通过两次旋转的方式完成核酸的扩增和检测,第一次旋转使核酸吸附膜上的核酸转移到扩增反应腔,第二次旋转将扩增反应槽连同扩增产物一起转移到试纸条上进行检测;本发明制备的核酸检测装置简单小巧,通过两次旋转的方式,确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式到达目标区域,无需额外的引流设施,用于核酸检测时成本更低,操作更简便,检测灵敏度高,所需时间短,并可用于人、动物等各类样本的核酸检测。
一方面,本发明提供了一种检测装置,其特征在于,包括:
用于处理样品的腔体;用于样品反应的腔体,在该腔体中获得样品的反应产物;和用于检测反应产物的检测腔;
所述处理样品腔体具有第一位置、第二位置和第三位置;样品反应腔体具有第一位置和第二位置;
当处理样品腔体和样品反应腔体位于第一位置时,处理样品腔体、样品反应腔体以及和检测腔互不流体连通。
在一些方式中,当处理样品腔体位于第二位置的时候,处理样品腔体与样品反应腔体处于流体连通,而样品反应腔体不与检测腔流体连通。
在一些方式中,当处理样品腔体位于第三位置时,样品反应腔体与检测腔处于流体连通。
在一些方式中,当处理样品腔体从第一位置移动到第二位置的时候,样品反应腔体处于第一位置;当处理样品腔体从第二位置移动到第三位置的时候,样品反应腔体位于第二位置,或者样品反应腔体从第一位置移动到第二位置。
在一些方式中,当样品反应腔体位于第二位置的时候,样品反应腔体与检测腔处于流体连通。
在一些方式中,处理样品腔体从第二位置移动到第三位置的同时,样品反应腔体从第一位置移动到第二位置,或者,处理样品腔体与样品反应腔体同时移动,从而带动处理样品腔体从第二位置移动到第三位置,带动样品反应腔体从第一位置移动到第二位置。
在一些方式中,所述处理样品的腔体、样品反应的腔体和检测腔由上至下依次设置。
在一些方式中,所述处理样品腔体、样品反应腔体通过旋转实现不同位置的转变。
在一些方式中,所述旋转包括两次旋转;第一次旋转使处理样品腔体从第一位置移动到第二位置,样品反应腔体和检测腔保持静止;完成第一次旋转后,处理样品腔体与样品反应腔体处于流体连通,而样品反应腔体不与检测腔流体连通。
在一些方式中,第一次旋转为处理样品腔体独自旋转,样品反应腔体和检测腔静止不动。
在一些方式中,第二次旋转使处理样品腔体从第二位置移动到第三位置,同时,样品反应腔体从第一位置移动到第二位置;完成第二次旋转后,处理样品腔体、样品反应腔体与检测腔处于流体连通。
在一些方式中,第二次旋转为处理样品腔体和样品反应腔体共同旋转,检测腔保持静止。
在一些方式中,所述处理样品腔体用于从样品中提取核酸物质。
在一些方式中,所述样品反应腔体用于核酸物质的扩增从而产生扩增产物。
在一些方式中,所述目标待测物为核酸;处理样品腔体用于吸附提纯样品中的核酸;样品反应腔体用于提供核酸扩增试剂,进行核酸扩增反应。
在一些方式中,所述检测腔用于检测扩增产物的数量或者是否有扩增产物。
在一些方式中,所述样品反应腔体包括用于核酸扩增的试剂,其中,所述试剂以干的状态存在。
在一些方式中,所述检测腔包括横向流动试纸条,该横向流动试纸条被用于检测扩增产物的数量或者是否有扩增产物。
在一些方式中,本发明提供了一种核酸检测装置,所述处理样品腔体用于吸附样本中的核酸;所述样品反应腔体用于完成核酸扩增反应;所述检测腔用于检测扩增产物中的核酸。
在一些方式中,第一次旋转后,处理样品腔体与样品反应腔体连通,将提取的核酸转移至样品反应腔体进行核酸扩增;第二次旋转后,样品反应腔体与检测腔连通,将扩增产物转移至检测腔内的横向流动试纸条上进行检测。
在一些方式中,所述处理样品腔体设有进样口,进样口下面连接进样通道,进样通道底部固定有核酸吸附膜,所述核酸吸附膜用于吸附样本中的核酸。
在一些方式中,所述样品反应腔体设有反应腔和滤纸储存槽;滤纸储存槽内装有滤纸,用于吸附多余样品;反应腔内装有核酸扩增反应膜或固定有核酸扩增反应干燥试剂;所述检测腔设有加样孔,反应产物从加样孔进入横向流动试纸条后开始检测。
进一步地,当处理样品腔体、样品反应腔体和检测腔都不连通时,处理样品腔体的进样口与滤纸储存槽竖直连通;当处理样品腔体和样品反应腔体连通时,处理样品腔体的进样口与样品反应腔体的反应腔竖直连通;当处理样品腔体、样品反应腔体和检测腔都连通时,处理样品腔体的进样口、样品反应腔体的反应腔,以及检测腔的加样孔都竖直连通。
本发明通过两次旋转的方式完成核酸的扩增和检测,处理样品腔体先通过核酸吸附膜吸附核酸,第一次旋转使吸附有核酸的核酸吸附膜转移到扩增反应腔上方,并用洗脱液以自由落体方式通过最短距离冲洗核酸吸附膜上的核酸至反应腔内,进行恒温扩增;第二次旋转将反应腔连同扩增产物一起转移到横向流动试纸条上,扩增产物自由落体方式滴入试纸条进行检测,使用时更加方便灵活而且不会出错。
因此本发明通过设计两次旋转的方式,确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式到达目标区域,且结构设计紧凑小巧,无需额外的引流设施,就能提升效率,提高检测灵敏度。
在一些方式中,处理样品腔体和样品反应腔体外形都为圆柱体型,可以方便手持和旋转。
在一些方式中,所述处理样品腔体包括上盖和下盖,上盖上设有进样口,进样口下面连接进样通道,进样通道底部固定有核酸吸附膜,所述核酸吸附膜用于吸附样本中的核酸;下盖包括外壁和底面,底面设有贯通口;所述上盖和下盖固定在一起,贯通口始终对准进样通道。
在一些方式中,所述进样口直径为5~10mm,进样口通道为圆柱型,底面直径与进样口一致,高15~25mm,从进样口直接向下延伸,样品从进样口经进样通道到达核酸吸附膜。
样品从进样口进入,经一定高度的进样通道加速后,能以更大的力冲击核酸吸附膜,从而促进核酸吸附膜更充分吸附样品中的核酸,提高核酸检测灵敏度。
在一些方式中,所述核酸吸附膜为圆形薄膜,可以采用二氧化硅或者聚硅氧烷(硅胶)膜;其直径与进样口直径一致或稍大于进样口直径。核酸吸附膜固定在进样通道底部,并且需完全覆盖进样通道底部出口,样品从进样口进入后,必须全部经过核酸吸附膜,样品中的核酸几乎都被核酸吸附膜吸附。
在一些方式中,上盖侧壁外围设有凸块,下盖通过侧壁内设有与凸块相配套的凹槽,上盖和下盖分别通过凸块和凹槽固定在一起,也就是说上盖和下盖的位置是固定的,下盖底面的贯通口始终对准进样通道,要转动只能一起转动,而不能单独转动上盖或下盖。
在一些方式中,上盖侧壁直径稍小于下盖侧壁直径,使上盖可以套入下盖侧壁内,并通过在下盖侧壁内设置凸环,使上盖与下盖组合后,上盖上平面正好与下盖侧壁最高段齐平。
在初始位置时,也就是尚未旋转前,处理样品腔体上盖的进样通道,下盖的贯通口都位于滤纸储存槽上方,进样通道、贯通口和滤纸储存槽呈一条直线竖直分布。因此初始加样时,样品中的核酸被核酸吸附膜吸附,而剩余的液体透过核酸吸附膜进入滤纸储存槽,被槽内的滤纸吸附。
反应腔用于核酸扩增反应,为了使检测过程更加方便灵活,本发明需要在反应腔内提前放置固定干燥的核酸扩增反应试剂,从而避免在检测过程中需要多次从加样口加多种试剂,防止试剂被加样口的核酸吸附膜吸附影响恒温扩增反应,导致检测误差。
进一步地,所述处理样品腔体的外壁设有第一旋转卡扣,样品反应腔体的侧壁设有镂空的第一旋转卡槽,当第一次旋转时,第一旋转卡扣从第一旋转卡槽的一端移动到另一端,第一旋转卡扣和第一旋转卡槽数量都为1个以上。
在一些方式中,处理样品腔体下盖的侧壁下端直径缩小,使下盖侧壁能够套入样品反应腔体的侧壁内,从而使处理样品腔体和样品反应腔体组合在一起后,外形为规整的圆柱形,外形更美观也更方便旋转。
在一些方式中,处理样品腔体下盖的侧壁下端的外围设有凸起的1个以上第一旋转卡扣,如2个第一旋转卡扣,对称分布在外壁下端;样品反应腔体的外壁上部设有1个以上第一旋转卡槽,如2个第一旋转卡槽,对称分布在外壁上部;第一旋转卡槽为外壁上设置的长条形横向镂空槽,当下盖的侧壁下端套入样品反应腔体的侧壁内时,凸起第一旋转卡扣正好位于镂空的第一旋转卡槽内。
在一些方式中,第一旋转卡槽的左端和右端都分别设有凸起的限位块。在初始位置时,第一旋转卡扣位于第一旋转卡槽的最左端,并被限位块阻挡固定;完成核酸提取后(加样,并且样品中的核酸被核酸吸附膜吸附后),开始第一次旋转,第一旋转卡扣需克服左端限位块的阻挡,沿第一旋转卡槽向右滑动,直到第一旋转卡扣克服右端限位块进入最右端,并被限位块阻挡固定,无法再继续向右转动,此时进样通道和核酸吸附膜正好转移到扩增反应腔上方,准备进行核酸的冲洗和恒温扩增反应。
第一次旋转是通过一只手固定住核酸检测装置,另一只手握在核酸检测装置的上端进行旋转,是处理样品腔体相对于样品反应腔体的旋转。
所述核酸吸附膜具有第一位置和第二位置,第一位置为核酸吸附膜位于滤纸储存槽上方,第二位置为核酸吸附膜位于反应腔上方;当第一旋转卡扣位于第一旋转卡槽的一端时,核酸吸附膜位于第一位置,当第一旋转卡扣移动到第一旋转卡槽的另一端时,核酸吸附膜位于第二位置。
核酸吸附膜处于第一位置时,核酸检测装置位于初始位置,可以开始加样;完成一次旋转后,核酸吸附膜处于第二位置,此时进样通道、贯通口和反应腔呈一条直线竖直分布,可以开始加洗脱液并开始核酸恒温扩增反应。
可以理解的是,核酸吸附膜的第一位置和第二位置是相对于样品反应腔体而言的,当进行第二次旋转时,核酸吸附膜和样品反应腔体一起移动,因此核酸吸附膜相对于样品反应腔体的位置没有变化,但相对于检测腔来说,核酸吸附膜还具有第三位置,因为第二次旋转后,核酸吸附膜和反应腔共同转移到了横向流动试纸条的加样孔上方。
在一些方式中,所述检测腔包括试纸条上盖和试纸条下盖,横向流动试纸条置固定于试纸条上盖和试纸条下盖中,用于检测扩增产物中的核酸。
试纸条上盖设有加样孔和检测结果观察窗,加样孔对准试纸条的加样检测位置,检测结果观察窗对准试纸条的检测结果读取窗口,用于读取检测结果。
进一步地,所述检测腔侧壁设有镂空的第二旋转卡槽;样品反应腔体的外壁设有第二旋转卡扣,当第二次旋转时,第二旋转卡扣从第二旋转卡槽的一端移动到另一端,第二旋转卡扣和第二旋转卡槽数量都为1个以上。
在一些方式中,所述试纸条上盖设有圆柱型槽,槽壁上设有第二旋转卡槽;样品反应腔体外壁的下部设有第二旋转卡扣,当样品反应腔体相对于检测腔旋转时,第二旋转卡扣从第二旋转卡槽的一端移动到另一端。
在一些方式中,样品反应腔体外壁的下部直径缩小,使样品反应腔体外壁的下部能够套入试纸条上盖的圆柱型槽内,从而使样品反应腔体和检测腔组合在一起后,从处理样品腔体到样品反应腔体,再到圆柱型槽,一起构成规整的圆柱形。
在一些方式中,样品反应腔体外壁的下部设有凸起的1个以上第二旋转卡扣,如2个第二旋转卡扣,对称分布在外壁下端;圆柱型槽的槽壁的上部设有1个以上第二旋转卡槽,如2个第二旋转卡槽,对称分布在槽壁;第二旋转卡槽为槽壁上设置的长条形横向镂空槽,当样品反应腔体外壁的下部套入圆柱型槽时,凸起第二旋转卡扣正好位于镂空的第二旋转卡槽内。
在一些方式中,第二旋转卡槽的左端和右端都分别设有凸起的限位块。在第一次旋转过程中,第二旋转卡扣和第二旋转卡槽的位置始终保持不变,第二旋转卡扣位于第二旋转卡槽的最左端,并被左端的限位块阻挡固定;完成核酸扩增反应后,开始第二次旋转,第二旋转卡扣需克服左端限位块的阻挡,沿第二旋转卡槽向右滑动,直到第二旋转卡扣克服右端限位块进入最右端,并被限位块阻挡固定,此时核酸吸附膜和反应腔共同转移到了检测试剂条的加样孔上方。
第二次旋转是通过一只手固定住核酸检测装置,另一只手握在核酸检测装置的中部或上部进行旋转,是样品反应腔体相对于检测腔的旋转。
在一些方式中,当样品反应腔体相对于检测腔旋转时,处理样品腔体随着样品反应腔体一起旋转,且核酸吸附膜一直位于反应腔上方。
进一步地,所述第一旋转卡扣、第一旋转卡槽、第二旋转卡扣、第二旋转卡槽的数量都为2个,并对称分布。
进一步地,所述反应腔为圆柱腔体,上下贯通;圆柱腔体的下端外围设有垫圈,当反应腔在圆柱型槽的底面上旋转滑动时,反应腔内的液体在垫圈保护下不会漏出至反应腔外;所述圆柱型槽的底面设有加样孔,当反应腔旋转至加样孔上方时,扩增产物由加样孔以自由落体方式滴入试纸条进行核酸检测。
反应腔为上下贯通的圆柱体型,没有上底面也没有下底面。没有上底面是便于从上方的核酸吸附膜中直接将样品冲洗至反应腔内;没有下底面是为了方便将反应腔内的扩增反应产物移动至核酸检测装置内部底板的加样孔上,此时反应腔内的液体由于没有底板支撑可顺利滴入核酸检测试剂条上。
反应腔没有下底面,但是反应腔置于试纸条下盖上,并且反应腔下端外围设有垫圈,使反应腔内的液体不会从反应腔侧壁和试纸条下盖表面的缝隙中漏出,并且在完成扩增反应进行第二次旋转时,反应腔将会在试纸条下盖表面滑动,有了垫圈的保护,即使滑动也不会使反应液漏出至反应腔外。
在一些方式中,反应腔下端外围设有垫圈槽,用于固定垫圈位置。
进一步地,反应腔的内壁上设有一层引流槽;所述引流槽由内壁上设置的多根梯形柱等距离排列构成;相邻两根梯形柱之间构成一条引流渠。
由于用于核酸扩增的样品非常微量,如何保证样品全部导流至反应腔是保证核酸检测灵敏度的非常关键的一步。通过在反应腔内壁四周全部设置引流槽,能最大程度地将待测样品引流至反应腔内,避免遗漏。
在一些方式中,梯形柱由反应腔上端直达下端。
梯形柱由反应腔上端直达下端,可以把样品从反应腔上端一直引流至下端,这主要是因为反应腔下端摆放有核酸扩增反应的固定化反应膜或干燥试剂,只有把样品从反应腔上端一直引流至下端,才能保证样品充分与固定化反应膜或干燥试剂接触,从而提高扩增反应效率。
在一些方式中,所述梯形柱的上端设有向上收窄的梯台;所述引流渠的宽度为0.1~0.5mm。
梯形柱的上端向上收窄的梯台可以与上方的核酸吸附膜接触,从而帮助吸收来自上方的样品进入引流渠,充分引流。
在一些方式中,向上收窄的梯台高0.2mm。
每根梯形柱之间形成的引流渠宽度一致,引流渠宽度越窄,引流效果越好,但是引流渠过窄会使制造过程难度升级,因此需选择合适的引流渠宽度。
在一些方式中,所述梯形柱的数量为13根,所述引流渠的数量为13条,沿着反应腔内壁均匀排布。
在一些方式中,所述引流渠的宽度为0.5mm。
在一些方式中,所述梯形柱底宽0.9mm,由反应腔内壁向外凸出距离为1.25mm,高3.7mm。
引流渠宽度的设置和引流渠的数量(引流渠的数量决定了梯形柱的数量和排布,从而决定了梯形柱底宽),决定了能否最大程度地提高引流效果。本发明提供的反应腔的圆柱体横截面直径为6mm,经大量研究证明,当引流渠的宽度为0.5mm,梯形柱底宽0.9mm,由反应腔内壁向外凸出距离为1.25mm时,能达到更好的引流效果。
进一步地,所述检测腔底部设有加热孔,所述加热孔用于为样品反应腔体进行核酸扩增反应提供热源。
在一些方式中,所述加热孔位于试纸条下盖上,加热孔的位置正对着反应腔下方,用于为核酸扩增反应提供热源。
在一些方式中,核酸恒温扩增反应的热源,可以采用设置加热孔,该加热孔与恒温加热设备相配套,恒温加热设备通过加热孔,为反应腔提供热源,从而进行恒温扩增反应。
在一些方式中,核酸恒温扩增反应的热源也可以直接设置在核酸检测装置内部,这样就无需另外提供恒温加热设备。
可以理解的是,所述反应腔具有第一位置和第二位置,所述第一位置为反应腔位于加热孔上方,第二位置为反应腔位于加样孔上方;当第二旋转卡扣位于第二旋转卡槽的一端时,反应腔位于第一位置,当第二旋转卡扣移动到第二旋转卡槽的另一端时,反应腔位于第二位置。
从核酸检测装置位于初始位置时开始,一直到完成第一次旋转后,反应腔一直处于第一位置没有改变,因为第一次旋转只是处理样品腔体的旋转,样品反应腔体未曾移动。
当进行第二次旋转时,核酸吸附膜和样品反应腔体一起旋转,使反应腔从加热孔上方转到了加样孔上方,从而进行加样检测。
进一步地,所述核酸扩增反应膜包括第一反应膜和第二反应膜;第一反应膜平铺在反应腔下端,第二反应膜与第一反应膜水平摆放,或第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方,或第二反应膜与第一反应膜竖直摆放。
在一些方式中,所述第一反应膜为核酸扩增反应所需的重组酶试剂的固定化反应膜;所述第二反应膜为核酸扩增反应所需的PEG缓冲液试剂的固定化反应膜;研究证明,重组酶试剂和PEG缓冲液试剂在扩增反应前必须分开放置,否则在扩增反应中重组酶容易被PEG包裹,从而影响扩增反应效率,因此需要设置两层固定化试剂反应膜。
进一步地,所述第一反应膜平铺在反应腔下端,第二反应膜位于反应腔的圆柱体中心位置,竖直摆放在第一反应膜上方。
实验证明,两层反应膜的摆放位置也会影响样品的引流效果,当第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方,且位于中间位置时,能够帮助提高引流效果,从而提高扩增反应效率,提高核酸检测灵敏度。
进一步地,反应腔内固定有两种核酸扩增反应干燥试剂,分别为第一干燥试剂和第二干燥试剂;所述第一干燥试剂和第二干燥试剂由反应腔底面设有的隔条隔开。
所述第一干燥试剂为核酸扩增反应所需的重组酶试剂;所述第二干燥试剂为核酸扩增反应所需的PEG缓冲液试剂;先分别装在隔条的两侧,烘干或冻干成干燥试剂;检测时,通过加入洗脱剂使两种试剂复溶后混合开始核酸扩增反应,因此隔条也不能过高,导致复溶后难以混合。
另一方面,本发明提供了一种核酸检测系统,所述系统包括核酸检测装置和试剂,所述试剂包括裂解液、洗脱液和核酸扩增反应试剂;所述核酸扩增反应试剂为干燥固定化后的试剂,包括第一固定化试剂和第二固定化试剂,第一固定化试剂中含有酶,第二固定化试剂中含有PEG。
核酸扩增反应试剂中至少需含有重组酶、引物探针组合、DNTP、ATP、二硫苏糖醇、PEG和Mg
为了使检测过程更加方便灵活,本发明在核酸检测装置内提前放置固定干燥的核酸扩增反应试剂,从而避免在检测过程中需要多次从加样口加多种试剂,防止试剂被加样口的核酸吸附膜吸附影响恒温扩增反应,导致检测误差。
由于核酸扩增反应试剂包含的成分较复杂,提取固定干燥处理后,还需要考虑该固定化试剂能否在反应腔中长期保存,经复溶后对核酸扩增反应会不会有影响。为达到良好的扩增效果,在核酸扩增反应试剂中需添加PEG,PEG分子量优选20000-40000,本发明经大量研究证明,核酸扩增反应试剂中的PEG和其他试剂,如重组酶等,必须分开进行干燥固定,否则会严重影响核酸的恒温扩增反应,从而影响检测灵敏度,其原因可能是PEG在干燥过程中会收缩包裹住酶,后期复溶后也难以恢复酶活性,从而使核酸恒温扩增反应无法正常进行。
进一步地,所述第一固定化试剂中还含有引物探针、单链结合蛋白、蛋白辅助因子,DNTP。
在一些方式中,第二固定化试剂中还可以含有醋酸镁。
引物探针可以与酶共同干燥固化,但不能与PEG在一起干燥,其原因可能是PEG也会影响引物探针的浓度。
进一步地,所述核酸检测装置包括由上之下依次设置的处理样品腔体、样品反应腔体和检测腔;处理样品腔体用于吸附样本中的核酸;样品反应腔体用于完成核酸扩增反应;检测腔用于检测扩增产物中的核酸。
进一步地,所述样品反应腔体包括用于进行核酸扩增反应的反应腔;核酸扩增反应试剂预先置于样品反应腔体的反应腔内。
进一步地,所述核酸扩增反应试剂为固定化反应膜或干燥试剂。
本发明所述固定化反应膜,采用硅胶、玻璃微纤维滤纸滤膜等材质的膜,膜厚度约1mm,形状为圆形或其他任意形状,优选为直径6mm的圆形膜,核酸扩增反应试剂可以通过烘干、冻干等方式固定在膜上,烘干时温度不能超过50℃。
进一步地,当核酸扩增反应试剂为固定化反应膜时,所述固定化反应膜包括第一反应膜和第二反应膜,第一反应膜上含有第一固定化试剂,第二反应膜上含有第二固定化试剂;当核酸扩增反应试剂为干燥试剂时,所述干燥试剂包括第一干燥试剂和第二干燥试剂,第一干燥试剂含有第一固定化试剂,第二干燥试剂含有第二固定化试剂;当核酸扩增反应试剂为干燥试剂时,反应腔底部需设置隔条,所述第一干燥试剂和第二干燥试剂通过隔条隔开。
在一些方式中,所述干燥试剂可以通过烘干、冻干制备,烘干时温度不能超过50℃。
在一些方式中,反应腔底部的隔条可以采用如同鸳鸯火锅中间的隔断片的形式,只要能起到分隔两种试剂的效果即可,两种试剂可以先分别加入反应腔中隔条的两边,然后进行冻干或烘干,即可制得预选装有核酸扩增反应试剂的核酸检测装置。
在一些方式中,反应腔底部的隔条高度不能过高,一般为2mm,只需能预先分隔两种试剂即可,待复溶后进行等温扩增时,两种试剂依然需要混合在一起进行反应,防止因隔条过高导致难以混合的情况。
进一步地,所述裂解液包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍和曲拉通100。
经裂解液裂解后的核酸样品被核酸吸附膜吸附后,虽然多余样品进入了滤纸储存槽,但仍有裂解液会残留在核酸吸附膜上,随后被洗脱液一起冲洗至反应腔内进行核酸恒温扩增反应。因此裂解液中的成分不能对核酸恒温扩增反应产生影响,也不能对核酸检测过程产生影响,否则将影响核酸的检测灵敏度,导致漏检或错检。
采用本发明提供的裂解液,不会对核酸扩增反应产生不利影响,因此经核酸吸附膜吸附样品中的核酸后,都无需添加清洗剂冲洗,即可用洗脱液洗脱目标核酸并进入恒温扩增反应,特别适用于本发明提供的核酸检测装置。
进一步地,所述处理样品腔体包括核酸吸附膜,所述核酸吸附膜为二氧化硅GF/C膜或者硅胶膜。
进一步地,所述洗脱液包括醋酸镁、乙二胺四乙酸和三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
洗脱液从加样口加入后,能将核酸吸附膜吸附的核酸洗脱至反应腔中进行等温扩增反应。
Mg
采用本发明提供的洗脱液能高效洗脱核酸至反应腔,并启动核酸恒温扩增反应,并能有效提高核酸检测灵敏度。
进一步地,所述处理样品腔体设有进样口,进样口不设盖子;所述裂解液或洗脱液置于试剂瓶中,试剂瓶口与进样口可密封配合。
本发明提供的核酸检测装置的进样口无需设置盖子,即使有灰尘进入也能被核酸吸附膜拦截。
核酸恒温扩增后,因待测核酸含量大幅上升,存在生物污染的风险,因此采用试剂瓶添加洗脱液时,试剂瓶的瓶口可直接与进样口旋紧,起到密封防污染的效果。
再一方面,本发明提供了一种采用核酸检测系统进行核酸检测的方法,包括以下步骤:
(1)样品中添加裂解液完成样品裂解;
(2)从加样口加入裂解后的样品;
(3)完成第一次旋转;
(4)从加样口加入洗脱液;
(5)启动恒温加热装置,进行核酸扩增;
(6)完成第二次旋转;
(5)从试剂条上盖的观察窗读取检测结果。
本发明提供的核酸检测系统具有简单,方便,集成等等特点,降低了常规核酸检测对实验室,设备和人员技能的要求,使其可用于现场,小诊所和宠物店等场所。
在一些方式中,本发明提供的核酸检测系统可用于病原体的核酸检测。
在一些方式中,本发明提供的核酸检测系统可用于宠物病原体(如猫疱疹病毒)、大牲畜病原体、植物病原体或食品病原体的核酸检测。
本发明的有益效果为:
1.改进核酸检测装置的结构,通过两次旋转的方式即可完成核酸检测,而且能确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式到达目标区域,无需额外的引流设施,就能提升效率,提高检测灵敏度;
2.通过设置一定高度的进样通道,样品从进样口进入,经一定高度的进样通道加速后,能以更大的力冲击核酸吸附膜,从而促进核酸吸附膜更充分吸附样品中的核酸,提高核酸检测灵敏度;
3.通过在反应腔设置引流槽,筛选合适的引流渠宽度和引流渠的数量,提高核酸扩增反应效率;
4.通过设计第一反应膜和第二反应膜的摆放方式,进一步提高引流效果,提高核酸扩增反应效率;
5.简单小巧,成本低,操作简便;
6.检测灵敏度高;
7.检测时间快;
8.可用于人、动物等,应用范围广。
附图说明
图1为实施例1中的核酸检测装置结构示意图;
图2为实施例1中的核酸检测装置的剖面图;
图3为实施例1中的核酸检测装置结构拆分示意图;
图4为实施例1中的处理样品腔体的上盖结构示意图;
图5为实施例1中的处理样品腔体的下盖结构示意图;
图6为实施例1中的处理样品腔体的结构示意图;
图7为实施例1中的处理样品腔体的剖面图;
图8为实施例1中的样品反应腔体的结构示意图;
图9为实施例1中的检测腔的结构拆分示意图;
图10为实施例1中的横向流动试纸条结构示意图;
图11为实施例1中的样品反应腔体的反应腔结构示意图(由下向上看);
图12为实施例1中的样品反应腔体的反应腔结构拆分示意图(由下向上看);
图13为实施例1中的样品反应腔体的反应腔结构示意图(由上向下看),反应腔中摆放着第一反应膜和第二反应膜,第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方;
图14为实施例1中的样品反应腔体的反应腔结构示意图(由上向下看),反应腔中间设有隔条;
图15为实施例2中的核酸检测装置旋转与各状态变化示意图;
图16为实施例3中的核酸检测装置与试剂瓶结合密封后的结构示意图;
图17为实施例4中的横向流动试纸条检测结果标准比色卡。
详细说明
下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明,如果没有特备指明,按照本领域的通用的一般术语进行理解和解释。
检测
检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在,比如,但并不限于此,化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外,检测表示测试物质或材料的数量。进一步说,化验还表示免疫检测,化学检测、酶检测等。
样本
本发明的检测装置可以检测的样本或者收集器能够收集的样本或者样品包括生物液体(例如病例液体或者临床样品)。液体样品或者流体样本,可以来源于固态或者半固态的样品,包括排泄物,生物组织和食品样品。利用任何适当的方法可以将固态或半固态的样品转化成液体样品,例如混合、捣碎、浸软、孵育、溶解或在合适的溶液中(例如水,磷酸盐溶液或其他缓冲溶液)利用酶解作用消化固体样品。“生物样品”包括来源于动物,植物和食品样品,例如包括来源于人或动物的尿液,唾液,血及其成分,脊髓液、阴道分泌物,精子,粪便,汗液,分泌物,组织,器官,瘤,组织和器官的培养物,细胞培养物和介质。优选生物样品是尿,优选的,生物样品是唾液,痰液、鼻腔分泌物等。食品样品包括食品加工的物质,最终产品,肉,干酪,酒,牛奶和饮用水。植物样品包括源于任何植物,植物组织,植物细胞培养物和介质。“环境样品”来源于环境(例如,来自于湖或者其他水体的液体样品,污水样品,土质样品,地下水,海水和废液样品)。环境样品还可包括污水或者其他废水。
利用本发明合适的检测元件或者测试元件,可以检测任何被分析物。优选利用本发明检测血液、唾液、尿液中的核酸。利用本发明的处理样品腔体2,可以收集以上任何形式的样本,无论开始是固态的,还是液态的,只要这些液体或者液体样本能够被处理样品腔体2中的核酸吸附元件吸附,核酸吸收元件位于处理样品腔体2内,能够吸收液体样本或者流体样本中的核酸,让流体样本中的核酸保持在吸收元件中。核酸吸附元件可以是任何能够吸收液体中的核酸的材质,例如海绵、滤纸,聚酯纤维、凝胶、无纺布、棉、聚酯薄膜、纱线、植绒等等。本发明优选采用核酸吸附膜9作为核酸吸附元件。
下游和上游
下游或者上游是对于液体流动方向来划分的,一般液体或者流体从上游流到下游区域。位于下游区域接受来自上游区域的液体,液体也可以沿着上游区域流到下游区域。这里一般是按照液体流动的方向还划分的,例如,利用毛细力促使液体流动的一些材料上,液体可以克服重力而向重力相反的方向流动,这个时候,还是按照液体的流动方向来划分上游和下游。例如如图10所示,本发明提到的核酸检测装置1具有施加样本的进样口7,处理样本腔体2,样本反应腔体3和检测腔4,样本从进样口7施加后进入处理样本腔体2,处理样品腔体2先通过核酸吸附膜9吸附样本中的核酸,第一次旋转使吸附有核酸的核酸吸附膜9转移到样本反应腔体3的扩增反应腔15上方,并用洗脱液以自由落体方式通过最短距离冲洗核酸吸附膜9上的核酸至反应腔15内,进行恒温扩增;处理样本腔体2处于样本反应腔体3的上游,样本反应腔体3处于下游;第二次旋转将样本反应腔体3的反应腔15连同扩增产物一起转移到检测腔4的横向流动试纸条25上,扩增产物自由落体方式滴入试纸条25进行检测,使用时更加方便灵活而且不会出错,样本反应腔体3位于检测腔4的上游,检测腔4处于下游。本发明通过设计两次旋转的方式,确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式从上游到达下游目标区域,且结构设计紧凑小巧,无需额外的引流设施,就能提升效率,提高检测灵敏度。
流体连通
流体连通是指液体能够从一个地方流动到另一个地方,流动的过程中可能经过一些物理的结构起到引导作用。所谓经过物理的结构一般是指液体经过这些物理的结构的表面,或者这些结构的内部的空间而被动或者主动流到另外一个地方,被动一般是收到外力而引起的流动,例如毛细作用下的流动,气压作用等。这里的流动也可以是液体因为自身作用(重力或者压力),也可以是被动的流动,气压作用的流体可以是顺势的流动,也可以是反方向的流动,也可以是气压的作用下促使流体从一个位置流到另一个位置。这里的连通并不表示一定需要液体存在,仅仅在一些情况下表明两个物体之间的连接关系或者状态,如果有液体存在,可以从一个物体流动到另一个物体上。这里是指两个物体连接的状态,相反,如果两个物体之间没有液体连通状态,如果有液体在一个物体中或者上,液体不能流动到另外一个物体中或者上,这样的状态为非连通,非液体连通的状态。
测试元件
这里所谓的“测试元件”是指可以检测样本或者样品是否含有感兴趣的被分析物质的元件都可以称之为测试元件,这种检测无论是基于何种技术原理,免疫学、化学、电学、光学,分子学,核酸、物理学等都可以。测试元件可以选用横向流动的检测试纸条,它可检测多种被分析物。当然,其他合适的测试元件也可以运用在本发明中。
各种测试元件可以被组合在一起运用到本发明中。一种形式是检测试纸或者横向流动的测试试纸。用于分析样本中的被分析物(如核酸等)的检测试纸可以是各种形式,如免疫测定或化学分析的形式。检测试纸可以采用非竞争法或竞争法的分析模式。检测试纸一般包含一具有样本加样区的吸水材料,试剂区和测试区。加流体或者液体样本至样本加样区,通过毛细管作用流到试剂区。在试剂区,如果存在被分析物,样本与试剂结合。然后样本继续流动到检测区。另一些试剂,如与被分析物特异性结合的分子被固定在检测区。这些试剂与样本中的被分析物(如果存在)反应并将被分析物结合在该区,或者与试剂区的某一个试剂结合。用于显示检测信号的标记物存在与试剂区或分离的标记区。
典型的非竞争法分析模式是如果样本中含有被分析物,信号就会产生,如果不包含被分析物,就不产生信号。在竞争法中,如果被分析物不存在于样本中,信号产生,如果存在被分析物,则不产生信号。
测试元件可以是检测试纸,可以选用吸水或不吸水的材料。检测试纸可包括多种材料用于液体样本传递。其中一种检测试纸的材料可覆盖在另一种材料上,如滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上。检测试纸的一个区可以选用一种或多种材料,而另一区选用其他不同的一种或多种材料。检测试纸可以被黏附在某种支持物或者硬质表面用于提高拿捏检测试纸的强度。
被分析物通过信号发生系统而被检测到,如利用与本分析物发生特异性反应的一种或多种酶,利用如前述将特异结合物质固定在检测试纸上的方法,将一种或多种信号发生系统的组合物固定在检测试纸的被分析物检测区。产生信号的物质可在加样区,试剂区,或检测区,或整个检测试纸上,该物质可以充满检测试纸的一种或多种材料上。将含有信号物的溶液加到试纸的表面或将试纸的一种或多种材料浸没在含信号物的溶液中。使加入含信号物溶液的试纸干燥。
检测试纸的各个区可以按以下方式排列:加样区,试剂区,检测区,控制区,确定样本是否掺假区,液体样本吸收区。控制区位于检测区之后。所有的区可以被安排在只用一种材料的一条试纸上。也可是不同区采用不同的材料。各个区可以直接和液体样本接触,或不同的区依据液体样本流动的方向排列,将各区的末端与另一区的前端相连并交叠。所用的材料可以是吸水性较好的材料如滤纸,玻纤或者硝酸纤维素膜等。检测试纸也可以采用其他形式。
一般常用的试剂条为硝酸纤维素膜试剂条,即检测区域包括硝酸纤维素膜(NC),在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果;还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等。例如如下一些专利描述的试剂条或含有试剂条的装置:US 4857453;US 5073484;US5119831;US 5185127;US 5275785;US 5416000;US 5504013;US 5602040;US 5622871;US5654162;US 5656503;US 5686315;US 5766961;US 5770460;US 5916815;US 5976895;US6248598;US 6140136;US 6187269;US 6187598;US 6228660;US 6235241;US 6306642;US6352862;US 6372515;US 6379620;和US 6403383。以上专利文献所公开的测试条以及带有测试条的类似装置都可以被运用到本发明的测试元件或者检测装置中进行被分析物质的检测,例如样本中被分析物质的检测。
运用到本发明的检测试剂条可以是通常所说的横向侧流试剂条(Lateral flowtest strip),这些检测试剂条的具体结构和检测原理在现有技术中是本领域一般技术人员公知的技术。普通的检测试剂条,包括样本收集区域或者是加样区51,标记区域52,检测区域53和吸水区域54,样本收集区域包括样本接受垫,标记区域包括标记垫,吸水区域可以包括吸水垫,其中检测区域上包括能检测是否含有被分析物质的必要化学物质,例如免疫试剂或者酶化学试剂。一般常用的检测试剂条为硝酸纤维素膜试剂条,即检测区域52包括硝酸纤维素膜,在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果区域;还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等;当然,在检测区域的下游还可以包括检测结果控制区域,通常,控制区域和检测区域上以横线的形式出现,为检测线55或者控制线56。这样的检测试剂条是传统的试剂条,当然,也可是其它利用毛细作用进行检测的其它类型的试剂条。另外,一般检测试剂条上带有干化学试剂成分,例如固定的抗体或者其他试剂,当遇到液体后,液体随着毛细作用沿着试剂条流动,随着流动,让干的试剂成分溶解于液体,从而到下一个区域处理在该区的干试剂发生反应,从而进行必要的检测。液体流动主要通过毛细作用进行的。在这里都可以被运用到本发明的检测装置中,或者被设置在检测腔中与液体样本接触,或者用来检测进入检测腔中的液体样本中被分析物质是否存在或者存在的数量。
除了上述测试条或者横向流动测试条本身被用来与液体样本接触来测试液体样本中是否含有被分析物质外。本发明的测试元件本身就可以作为检测装置来检测样本中被分析物质,所以,这里检测装置本身就等同于测试元件。例如流体样本被处理液混合后,直接用测试元件进行检测。下面会有具体的描述,当在描述接收装置来处理流体样本的时候,测试元件可以单独用来检测。
核酸
本发明的被分析检测物质为核酸。
术语“核酸”包括任何可以掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。根据本申请使用的示例性核酸包括但不限于DNA,RNA包括信使RNA(mRNA)、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等,在本申请中详细描述。
术语“脱氧核糖核酸”、“DNA”或“DNA分子”是指由两条链(多核苷酸)组成的分子,每条链包含单体单元核苷酸。核苷酸通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸基之间的共价键在链中彼此连接,产生交替的糖-磷酸基骨架。两条分开的多核苷酸链的含氮碱基与氢键结合在一起以制备双链DNA。
术语“核糖核酸”、“RNA”或“RNA分子”是指至少2个碱基-糖基-磷酸基组合串成的链。在一个实施例中,术语包括由核苷酸组成的化合物,其中糖部分是核糖。在另一个实施例中,末端包括其中主链被改性的RNA和RNA衍生物。在一个实施例中,RNA可能是以tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小抑制RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和核酶的形式存在。siRNA和miRNA的用途已有描述(Caudy A A et al,Genes&Devel16:2491-96andreferencescitedtherein)。另外,这些形式的RNA可以是单链、双链、三链或四链的绞合。在另一实施例中,术语也包括其他类型的主链但具有相同碱基的人造核酸。在另一实施例中,人造核酸为PNA(肽核酸)。PNA含有肽主链和核苷酸碱基,并且能够在另一实施例中与DNA和RNA分子结合。在另一实施例中,核苷酸为改性氧杂环丁烷。在另一实施例中,通过用硫代磷酸基键取代一个或以上磷酸二酯键来改性核苷酸。在另一实施例中,改性核酸包括本领域已知的天然核酸的磷酸基主链的任何其他变体。本领域普通技术人员熟悉硫代磷酸基核酸和PNA的用途,其描述,例如,Neilsen P E,CurrOpin StructBiol 9:353-57;[0280]and Raz N Ket al BiochemBiophys Res Commun.297:1075-84。核酸的生产和使用是本领域技术人员熟知的,其描述,Molecular Cloning,(2001),Sambrookand Russell,eds.And Methods in Enzymology:Methods for molecular cloningineukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed每个核酸衍生物代表本发明的单独实施例。
用于本文时,术语“核酸”包括以下的一种或多种类型:多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及任何其他类型的多核苷酸,其是嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。术语“核酸”,用于本文时,也包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的共价键合的聚合物,所述共价键合通常通过亚基之间的磷酸二酯键,但在有些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。示例性核酸包括但不限于gDNA;hnRNA;mRNA;rRNA,tRNA,微小RNA(miRNA),小干扰RNA(siRNA),小核仁RNA(snoRNA),小核RNA(snRNA)和小时序RNA(stRNA)等,及其任何组合。
经过修饰的核苷酸
在一些方式中,所述的所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸,其中修饰的核苷酸选择如下一种或者几种核苷酸:2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷;甲基化碱基;插入碱基;2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖;硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。以及PCT/CN2020/074825,PCT/CN2020/106696中所描述的改性核苷酸进行修饰。
检测装置
检测装置是指用于检测样本中是否含有被分析物质的装置,本发明提供的核酸检测装置由上至下依次包括处理样品腔体2、样品反应腔体3和检测腔4。处理样本腔体2是指接收检测装置的样本,来进行样本的混合或者处理,如核酸吸附膜9的吸附、洗脱和液体或者液体样本的处理。处理样本腔体2并不是专门为了接收检测装置而存在的,其可以单独存在,单独具有处理流体样本的功能。处理样品腔体2用于提取样本中的核酸,当处理样品腔体2相对于样品反应腔体3旋转,可将核酸转移至样品反应腔体3进行核酸扩增;样品反应腔体3用于完成核酸扩增反应,当样品反应腔体3相对于检测腔4旋转,可将扩增产物转移至检测腔4;检测腔4用于检测扩增产物中的核酸。
两次旋转
由于核酸检测步骤较多,而检测装置又需要体积尽量精巧简便,因此需要随着检测流程的进行,对处理样品腔体2、样品反应腔体3和检测腔4的相互位置关系的变换进行精巧的设计,使其在有限空间内相互配合完成核酸的提取、扩增和检测,实现加样、核酸提纯、恒温扩增、免疫层析法读取检测结果功能集成在一种装置上,制得一种简单小巧的核酸检测装置,通过两次旋转的方式即可完成核酸检测,并能确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式到达目标区域,无需额外的引流设施。
本发明提供的检测装置1中的处理样品腔体2用于从样品中提取核酸物质,样品反应腔体3用于核酸物质的扩增从而产生扩增产物。检测腔4用于检测扩增产物的数量或者是否有扩增产物。
处理样品的腔体2具有第一位置201、第二位置202和第三位置203(图15),同时,处理样品腔体2内部的核酸吸附膜9也同样具有第一位置901、第二位置902和第三位置903;样品反应腔体3具有第一位置301和第二位置302,同时样品反应腔体3中的反应腔15也同样具有第一位置1501和第二位置1502。
当处理样品腔体2和样品反应腔体3位于第一位置201时,处理样品腔体2、样品反应腔体3以及和检测腔4互不流体连通。
当处理样品腔体2位于第二位置202的时候,处理样品腔体2与样品反应腔体3处于流体连通,而样品反应腔体3不与检测腔4流体连通。
当处理样品腔体2位于第三位置203时,样品反应腔体3与检测腔4处于流体连通。
当处理样品腔体2从第一位置201移动到第二位置202的时候,样品反应腔体3处于第一位置301;当处理样品腔体2从第二位置202移动到第三位置203的时候,样品反应腔体3位于第二位置302,或者样品反应腔体3从第一位置301移动到第二位置302。
当样品反应腔体3位于第二位置302的时候,样品反应腔体3与检测腔4处于流体连通。
当处理样品腔体2从第二位置202移动到第三位置203的同时,样品反应腔体3从第一位置301移动到第二位置302,或者,处理样品腔体2与样品反应腔体3同时移动,从而带动处理样品腔体2从第二位置202移动到第三位置203,带动样品反应腔体3从第一位置301移动到第二位置302。
处理样品的腔体2、样品反应的腔体3和检测腔4由上至下依次设置,整体外观为圆柱体型。处理样品腔体2、样品反应腔体3都分别通过旋转来实现不同位置的转变。所述旋转包括两次旋转;第一次旋转使处理样品腔体2从第一位置201移动到第二位置202,样品反应腔体3和检测腔4保持静止;完成第一次旋转后,处理样品腔体2与样品反应腔体3处于流体连通,而样品反应腔体3不与检测腔4流体连通。因此第一次旋转为处理样品腔体2独自旋转,样品反应腔体3和检测腔4静止不动。第二次旋转使处理样品腔体2从第二位置202移动到第三位置203,同时,样品反应腔体3从第一位置301移动到第二位置302;完成第二次旋转后,处理样品腔体2、样品反应腔体3与检测腔4处于流体连通。因此,第二次旋转为处理样品腔体2和样品反应腔体3共同旋转,检测腔4保持静止。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述,需要指出的是,以下所述实施例旨在便于对本发明的理解,而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品,通过购买市售产品获得。
实施例1本发明提供的核酸检测装置
本实施例提供的核酸检测装置如图1-14所示。
如图1~3,本实施例提供的核酸检测装置1,由上至下依次包括处理样品腔体2、样品反应腔体3和检测腔4。处理样品腔体2用于提取样本中的核酸,当处理样品腔体2相对于样品反应腔体3旋转,可将核酸转移至样品反应腔体3进行核酸扩增;样品反应腔体3用于完成核酸扩增反应,当样品反应腔体3相对于检测腔4旋转,可将扩增产物转移至检测腔4;检测腔4用于检测扩增产物中的核酸。
如图4和5,处理样品腔体2用于提取样本中的核酸,包括上盖5和下盖6,上盖5上设有进样口7,进样口7下面连接进样通道8,进样通道8底部固定有核酸吸附膜9,核酸吸附膜9用于吸附样本中的核酸;下盖6包括外壁10和底面11,底面11设有贯通口12;上盖5和下盖6固定在一起,贯通口12始终对准进样通道8。
优选的,如图4~7,上盖5侧壁外围设有凸块13,下盖6通过侧壁内设有与凸块13相配套的凹槽14,上盖5和下盖6分别通过凸块13和凹槽14固定在一起,也就是说上盖5和下盖6的位置是固定的,下盖6底面的贯通口12始终对准进样通道8,要转动就一起转动,而不能单独转动上盖5或下盖6。
上盖5侧壁直径稍小于下盖6侧壁直径,使上盖5可以套入下盖6侧壁内,并通过在下盖6侧壁内设置凸环20,使上盖5与下盖6组合后,上盖上平面39正好与下盖侧壁最高段38齐平。
优选的,进样口7直径为8mm,进样通道8为圆柱型,底面直径与进样口7一致,高19mm,从进样口7直接向下延伸,样品从进样口7经进样通道8到达核酸吸附膜9。核酸吸附膜9为圆形薄膜,可以采用二氧化硅或者聚硅氧烷(硅胶)膜;其直径与进样口7直径一致或稍大于进样口直径。核酸吸附膜9固定在进样通道8底部,并且需完全覆盖进样通道8底部出口;样品从进样口7进入,经一定高度的进样通道8加速后,能以更大的力冲击核酸吸附膜9,从而促进核酸吸附膜9更充分吸附样品中的核酸,提高核酸检测灵敏度。因此样品从进样口7进入后,全部经过核酸吸附膜9,样品中的核酸几乎都被核酸吸附膜9吸附。
如图8,样品反应腔体3的底部设有反应腔15和滤纸储存槽16;滤纸储存槽16内装有滤纸,用于吸附多余样品;反应腔15内设有核酸扩增反应膜或固定有核酸扩增反应干燥试剂,这是为了使检测过程更加方便灵活,避免在检测过程中需要多次从加样口7加多种试剂,防止试剂被加样口7的核酸吸附膜9吸附影响恒温扩增反应,导致检测误差。
如图9,处理样品腔体2的下盖6的外壁10设有第一旋转卡扣17,样品反应腔体3的侧壁的上部设有第一旋转卡槽18,当处理样品腔体2相对于样品反应腔体3旋转时,第一旋转卡扣17从第一旋转卡槽18的一端移动到另一端,第一旋转卡扣17和第一旋转卡槽18数量都为1个以上。
如图5,处理样品腔体2是下盖6的侧壁下端19直径缩小,使下盖6侧壁能够套入样品反应腔体3的侧壁内(图8),从而使处理样品腔体2和样品反应腔体3组合在一起后,外形为规整的圆柱形,外形更美观也更方便旋转。
优选的,下盖6的侧壁下端19的外围设有凸起的2个第一旋转卡扣17,对称分布在侧壁下端19;样品反应腔体3的外壁的上部设有2个第一旋转卡槽18,对称分布在外壁上部;第一旋转卡槽18为外壁上设置的长条形横向镂空槽,当下盖的侧壁下端19套入样品反应腔体3的侧壁内时,凸起第一旋转卡扣17正好位于镂空的第一旋转卡槽18内。
如图8,第一旋转卡槽18的左端和右端都分别设有凸起的限位块。在初始位置时,第一旋转卡扣17位于第一旋转卡槽18的最左端,并被限位块21阻挡固定;完成核酸提取后(加样,并且样品中的核酸被核酸吸附膜吸附后),开始第一次旋转,第一旋转卡扣17需克服左端限位块21的阻挡,沿第一旋转卡槽18向右滑动,直到第一旋转卡扣17克服右端限位块22进入最右端,并被限位块22阻挡固定,无法再继续向右转动,此时进样通道8和核酸吸附膜9正好转移到扩增反应腔15上方,准备进行核酸的冲洗和恒温扩增反应。
如图9,检测腔4包括试纸条上盖23和试纸条下盖24,横向流动试纸条25置于试纸条上盖23和试纸条下盖24中,其位置固定,用于检测扩增产物中的核酸。试纸条上盖24设有加样孔32和检测结果观察窗41,加样孔32对准试纸条的加样检测位置,检测结果观察窗41对准试纸条的检测结果读取窗口,用于读取检测结果。试纸条上盖23设有圆柱型槽26,加样孔32位于圆柱型槽26的底面,槽壁上设有第二旋转卡槽27;样品反应腔体3外壁的下部28设有第二旋转卡扣29,当样品反应腔体3相对于检测腔4旋转时,第二旋转卡扣29从第二旋转卡槽27的一端移动到另一端。第二旋转卡扣29和第二旋转卡槽27数量都为2个以上。2个第二旋转卡扣29对称分布在样品反应腔体3外壁下端28,2个第二旋转卡槽27对称分布在圆柱型槽26的槽壁上。第二旋转卡槽27为槽壁上设置的长条形横向镂空槽,当样品反应腔体3外壁的下部28套入圆柱型槽26时,凸起第二旋转卡扣29正好位于镂空的第二旋转卡槽27内。第二旋转卡槽27的左端和右端都分别设有凸起的限位块。在第一次旋转过程中,第二旋转卡扣29和第二旋转卡槽27的位置始终保持不变,第二旋转卡扣29位于第二旋转卡槽27的最左端,并被左端的限位块30阻挡固定;完成核酸扩增反应后,开始第二次旋转,第二旋转卡扣29需克服左端限位块30的阻挡,沿第二旋转卡槽27向右滑动,直到第二旋转卡扣29克服右端限位块31进入最右端,并被限位块31阻挡固定,此时核酸吸附膜9和反应腔15共同转移到了检测试剂条25的加样孔32上方。
优选的,如图9,试纸条下盖24设有加热孔33,加热孔33位于反应腔15下方,用于为核酸扩增反应提供热源。核酸恒温扩增反应的热源,可以采用设置加热孔33,该加热孔33与恒温加热设备相配套,可安放于任何恒温热源的圆形金属凸起上,恒温加热设备通过加热孔33,为反应腔15提供热源,启动并维持恒温扩增反应。当然,核酸恒温扩增反应的热源也可以直接设置在核酸检测装置1内部,这样就无需另外提供恒温加热设备。
横向流动试纸条25的结构见图10,包括加样区51、标记区域52、检测区域53、吸水区域54,检测区域53含有检测线55或者控制线56。在本实施例中,所述标记区域52包被有抗FAM抗体标记胶体金,检测线55处包被有链亲和素,控制线56处包被有羊抗鼠抗体(羊抗鼠IgG的抗体),其核酸检测的原理为:扩增引物中含有生物素修饰,探针中5’端修饰FAM荧光基团,经该引物探针扩增后,扩增产物5’端便携带有FAM荧光基团,3’端携带生物素基团,经横向流动试纸条25可顺利检测到目标序列。
如图11,反应腔15为圆柱腔体,上下贯通,没有上底面也没有下底面。没有上底面是便于从上方的核酸吸附膜9中直接将样品冲洗至反应腔15内;没有下底面是为了方便将反应腔15内的扩增反应产物移动至加样孔32上,此时反应腔15内的液体由于没有底板支撑可顺利滴入核酸检测试剂条25上。反应腔15的下端151外围设有垫圈152,当反应腔15在圆柱型槽26的底面上旋转滑动时,反应腔15内的液体在垫圈152保护下不会漏出至反应腔15外;当反应腔15旋转至加样孔32上方时,扩增产物由加样孔32滴入试纸条进行核酸检测。
反应腔15没有下底面,但是反应腔15置于试纸条下盖24上,并且垫圈152能使反应腔15内的液体不会从反应腔侧壁下端151和试纸条下盖24表面的缝隙中漏出,并且在完成扩增反应进行第二次旋转时,反应腔15将会在试纸条下盖24表面滑动,有了垫圈152的保护,即使滑动也不会使反应液漏出至反应腔15外。
如图12,反应腔下端151外围设有垫圈槽153,用于固定垫圈152的位置。
如图11,反应腔15的内壁上设有一层引流槽154;引流槽154由内壁上设置的多根梯形柱155等距离排列构成;相邻两根梯形柱155之间构成一条引流渠156。由于用于核酸扩增的样品非常微量,如何保证样品全部导流至反应腔15是保证核酸检测灵敏度的非常关键的一步。通过在反应腔15内壁四周全部设置引流槽154,能最大程度地将待测样品引流至反应腔15内,避免遗漏。优选的,梯形柱155由反应腔15上端直达下端,可以把样品从反应腔15上端一直引流至下端,这主要是因为反应腔15下端摆放有核酸扩增反应的固定化反应膜或干燥试剂,只有把样品从反应腔15上端一直引流至下端,才能保证样品充分与固定化反应膜或干燥试剂接触,从而提高扩增反应效率。
优选的,如图13,梯形柱155的上端设有向上收窄的梯台157;引流渠156的宽度为0.1~0.5mm。梯形柱155的上端向上收窄的梯台157可以与上方的核酸吸附膜9接触,从而帮助吸收来自上方的样品进入引流渠156,充分引流。本实施例中,向上收窄的梯台157高0.2mm。每根梯形柱155之间形成的引流渠156宽度一致,引流渠156宽度越窄,引流效果越好,但是引流渠156过窄会使制造过程难度升级,因此需选择合适的引流渠宽度。
优选的,梯形柱155的数量为13根,引流渠156的数量为13条,沿着反应腔15内壁均匀排布,引流渠的宽度为0.5mm,梯形柱155底宽0.9mm,由反应腔15内壁向外凸出距离为1.25mm,高3.7mm。引流渠156宽度的设置和引流渠156的数量(引流渠的数量决定了梯形柱的数量和排布,从而决定了梯形柱底宽),决定了能否最大程度地提高引流效果。本实施例中反应腔15的圆柱体横截面直径为6mm,经大量研究证明,当引流渠156的宽度为0.5mm,梯形柱155底宽0.9mm,由反应腔15内壁向外凸出距离为1.25mm时,能达到更好的引流效果。
如图13,当反应腔15内预先摆放的是核酸扩增反应膜,所述核酸扩增反应膜包括第一反应膜35和第二反应膜36,因为扩增反应试剂中的重组酶试剂和PEG缓冲液试剂在扩增反应前必须分开放置,否则在扩增反应中重组酶容易被PEG包裹,从而影响扩增反应效率,因此需要设置第一反应膜35和第二反应膜36两层固定化试剂反应膜。第一反应膜35和第二反应膜36的摆放方式有三种:1、第一反应膜35平铺在反应腔15下端,第二反应膜36与第一反应膜35水平摆放;2、第二反应膜36竖直摆放在第一反应膜35上方;3、第二反应膜36与第一反应膜35竖直摆放。本实施例中优选采用第2种,第一反应膜35平铺在反应腔15下端,第二反应膜36位于反应腔15的圆柱体中心位置,竖直摆放在第一反应膜35上方。优选采用第2种摆放方式是因为:实验证明,两层反应膜的摆放位置也会影响样品的引流效果,当第二反应膜36竖直摆放在第一反应膜35上方,且位于中间位置时,能够帮助提高引流效果,从而提高扩增反应效率,提高核酸检测灵敏度。
当然,也可以采用反应腔15内固定核酸扩增反应干燥试剂,分别为第一干燥试剂和第二干燥试剂;第一干燥试剂和第二干燥试剂需要由反应腔底面设有的隔条37隔开(图14)。第一干燥试剂为核酸扩增反应所需的重组酶试剂;第二干燥试剂为核酸扩增反应所需的PEG缓冲液试剂;先分别装在隔条37的两侧,烘干或冻干成干燥试剂;检测时,通过加入洗脱剂使两种试剂复溶后混合开始核酸扩增反应,因此隔条37也不能过高,过高会导致复溶后难以混合,本实施例中,隔条37高度为2mm。
实施例2本发明提供的核酸检测装置的旋转及状态变化过程
本实施例提供的核酸检测装置1,可以通过两次旋转的方式完成核酸的扩增和检测,其旋转及状态变化过程如图15所示,其中图15(1)为初始状态;图15(2)为第一次旋转后的状态;图15(3)第二次旋转后的状态。
由图15可以看出,处理样品腔体2具有第一位置201、第二位置202和第三位置203,同时,处理样品腔体2内部的核酸吸附膜9也同样具有第一位置901、第二位置902和第三位置903;样品反应腔体3具有第一位置301和第二位置302,同时样品反应腔体3中的反应腔15也同样具有第一位置1501和第二位置1502。
核酸检测装置1在未使用前(图15(1)),是处于初始位置,也就是尚未旋转前,处理样品腔体2处于第一位置201,核酸吸附膜9也处于第一位置901;样品反应腔体3处于第一位置301,反应腔15也处于第一位置1501。此时,处理样品腔体2、样品反应腔体3以及检测腔4都互不流体连通,也就是说处理样品腔体2的进样通道8、样品反应腔体3的反应腔15、检测腔4的加样孔32尚未流体连通;但此时进样通道8位于滤纸储存槽16上方,进样通道8、贯通口12和滤纸储存槽16由上至下呈一条直线竖直分布,因此初始位置可以开始加样,样品从进样口7竖直加入,首先经进样通道8后接触到核酸吸附膜9,样品中的核酸被核酸吸附膜9吸附,而剩余的液体透过核酸吸附膜9进入滤纸储存槽16,被滤纸储存槽16内的滤纸吸附。
经第一次旋转后(图15(2)),处理样品腔体2从第一位置201旋转到第二位置202,处理样品腔体2内部的核酸吸附膜9也同样从第一位置901旋转到第二位置902,而样品反应腔体3依然处于第一位置301,反应腔15也依然处于第一位置1501。此时,处理样品腔体2与样品反应腔体3处于流体连通,而样品反应腔体3不与检测腔4流体连通,也就是说处理样品腔体2的进样通道8转到了样品反应腔体3的反应腔15上方,使进样通道8与反应腔15流体连通,当反应腔15并未发生移动,反应腔15与检测腔4的加样孔32尚未流体连通。
核酸吸附膜9的第一位置901为核酸吸附膜9位于滤纸储存槽16上方,第二位置902为核酸吸附膜9位于反应腔15上方;当第一旋转卡扣17位于第一旋转卡槽18的一端时,核酸吸附膜9位于第一位置901,第一次旋转时,第一旋转卡扣17移动到第一旋转卡槽18的另一端,核酸吸附膜9转移到第二位置902。第一次旋转后,核酸吸附膜9处于第二位置902,此时进样通道8、贯通口12和反应腔15呈一条直线竖直分布,可以开始加洗脱液并开始核酸恒温扩增反应。
第一次旋转使吸附有核酸的核酸吸附膜9转移到扩增反应腔15上方,此时可以从进样口7加入洗脱液,洗脱液以自由落体方式经进样通道8,通过最短距离洗脱核酸吸附膜9上的核酸至反应腔15内,然后可以在反应腔15内进行恒温扩增。
经第二次旋转后(图15(3)),处理样品腔体2从第二位置202移动到第三位置203,处理样品腔体2内部的核酸吸附膜9也同样从第二位置902旋转到第三位置903,而样品反应腔体3则从第一位置301移动到第二位置302,反应腔15也从第一位置1501移动到第二位置1502。此时,样品反应腔体3与检测腔4处于流体连通,也就是说样品反应腔体3的反应腔15位于检测腔4的加样孔32上方,同时处理样品腔体2也与样品反应腔体3、检测腔4处于流体连通,也就是说处理样品腔体2的进样通道8位于反应腔15上方,进样通道8、贯通口12、反应腔15、加热孔32呈一条直线竖直分布。
可以理解的是,第二次旋转是处理样品腔体2和样品反应腔体3共同旋转的过程,样品反应腔体3从第一位置301旋转到第二位置302的同时,带动处理样品腔体2从第二位置202旋转到第三位置203。核酸吸附膜9的第一位置901和第二位置902是相对于样品反应腔体3而言的,当进行第二次旋转时,核酸吸附膜9和样品反应腔体3一起移动,因此核酸吸附膜9相对于样品反应腔体3的位置没有变化;也就是说,当样品反应腔体3相对于检测腔4旋转时,处理样品腔体2随着样品反应腔体3一起旋转,且核酸吸附膜9一直位于反应腔15上方。但相对于检测腔4来说,核酸吸附膜9还具有第三位置903,因为第二次旋转后,核酸吸附膜9和反应腔15共同转移到了检测腔4的加样孔32上方。
第二次旋转使反应腔15具有第一位置1501和第二位置1502,第一位置为反应腔15位于加热孔33上方,第二位置为反应腔15位于加样孔32上方;当第二旋转卡扣29位于第二旋转卡槽27的一端时,反应腔15位于第一位置1501,当第二旋转卡扣29移动到第二旋转卡槽27的另一端时,反应腔15位于第二位置1502。
从核酸检测装置1位于初始位置时开始,一直到完成第一次旋转后,反应腔15一直处于第一位置1501没有改变,因为第一次旋转只是处理样品腔体2的旋转,样品反应腔体3未曾移动。当进行第二次旋转时,处理样品腔体2和样品反应腔体3一起旋转,使反应腔15从加热孔33上方转到了加样孔32上方,从而进行加样检测。
第二次旋转将反应腔15连同扩增产物一起通过加样孔32滴入试纸条25,扩增产物自由落体方式滴入试纸条25进行检测,使用时更加方便灵活而且不会出错。因此通过设计两次旋转的方式,确保每次的加样或加试剂都能以自由落体方式到达目标区域,且结构设计紧凑小巧,无需额外的引流设施,就能提升效率,提高检测灵敏度。
本实施例提供的核酸检测装置1,通过两次简单的选择操作即可完成核酸样品的检测,第一次旋转是通过一只手固定住核酸检测装置1,另一只手握在核酸检测装置1的上端(如处理样品腔体2的外壁)进行旋转,是处理样品腔体2相对于样品反应腔体3的旋转,为处理样品腔体2独自旋转,样品反应腔体3和检测腔4静止不动。第二次旋转是通过一只手固定住核酸检测装置1,另一只手握在核酸检测装置1的中部(如样品反应腔体3的外壁)或上部进行旋转,是样品反应腔体3相对于检测腔4的旋转,为处理样品腔体2和样品反应腔体3共同旋转,检测腔4保持静止。由于旋转过一次后是无法继续旋转的,因此两次旋转不会搞错顺序,不会导致操作失误。
实施例3本发明提供的核酸检测系统
本实施例提供的核酸检测系统包括如实施例1提供的核酸检测装置和与其配套使用的核酸检测试剂。其中,核酸检测试剂包括裂解液、洗脱液和核酸扩增反应试剂;核酸检测装置中的核酸吸附膜采用聚硅氧烷硅胶膜(深圳逗点生物技术有限公司,Y-SM-BC-1)。
1、裂解液的配制
裂解液配方:0.1M三羟甲基氨基甲烷,0.2M乙二胺四乙酸,3M异硫氰酸胍,5%曲拉通100。
Triton-100(曲拉通100)5%Tris-HCL 50mmol NaOH 50mmol
取2ml裂解液,预先装入试剂瓶,试剂瓶口尺寸与核酸检测装置的进样口(进样口不设盖子)尺寸相配套,可密封配合。
2、核酸扩增反应试剂的配制
本实施例在核酸检测装置内预先放置固定干燥的核酸扩增反应试剂,主要有(1)固定化反应膜或(2)干燥试剂两种类型。
(1)固定化反应膜:玻纤纤维膜(型号8860),包括第一反应膜和第二反应膜,尺寸为6mm直径,厚度1mm。
第一反应膜的制备:
配制第一反应液:30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0,50mM醋酸钾,3mM二硫苏糖醇,2mM ATP,20mM磷酸肌酸,100ng/μl肌酸激酶,600ng/μl大肠杆菌SSB蛋白,150ng/μl噬菌体uvsX蛋白,25ng/μl噬菌体uvsY蛋白,80ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-),50ng/μl核酸外切酶III,200U逆转录酶,450μM dNTP,420nM每条上游引物,420nM每条下游引物,120nM每条荧光探针。
取第一反应液0.02ml,固定于第一反应膜,50℃烘干。
第二反应膜的制备:
配制第二反应液:5%聚乙二醇(分子量20000),0.28M醋酸镁。
取第二反应液0.02ml,固定于第二反应膜,50℃烘干。
(2)干燥试剂:包括第一干燥试剂和第二干燥试剂
第一干燥试剂含有成分;第二干燥试剂含有成分。
在反应腔中预制第一干燥试剂和第二干燥试剂的方法:在反应腔底的隔条两侧分别装入含有的试剂,和含有的试剂,经烘干或冻干,制得预先装有第一干燥试剂(第一反应液)和第二干燥试剂(第二反应液)的核酸检测装置。
3、洗脱液的配制
洗脱液配方:0.01M三羟甲基氨基甲烷,0.001M乙二胺四乙酸,0.28M醋酸镁。
取0.06ml洗脱液,预先装入试剂瓶。核酸检测装置的进样口不设盖子,试剂瓶口与进样口可密封配合,用试剂瓶添加洗脱液时,试剂瓶的瓶口可直接与进样口旋紧,并不再取出(图16),在核酸扩增和检测过程中起到密封防污染的效果,检测完也一起进行生物垃圾处理,防止生物污染。
本实施例采用核酸检测系统进行核酸检测,其中固定干燥的核酸扩增反应试剂采用第一反应膜和第二反应膜,并且第一反应膜平铺在反应腔下端,第二反应膜位于反应腔中心位置,竖直摆放在第一反应膜上方。检测过程包括以下步骤:
(1)0.2ml样品中添加2ml裂解液完成样品裂解;
(2)从加样口加入0.5ml裂解后的样品;
(3)完成核酸检测装置的第一次旋转;
(4)从加样口加入0.06ml洗脱液;
(5)启动恒温加热装置,进行核酸恒温扩增,温度,时间;
(6)完成核酸检测装置的第二次旋转;
(7)从试剂条上盖的观察窗读取检测结果。
实施例4固化或风干工艺对检测结果的影响
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统进行检测,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,判读检测结果时使用标准比色卡(见图17)进行比对。
本实施例中的引物为:
上游引物FHV-F:CTATGTTTCTTATGGATATGAGACTTTGTGAT
下游引物FHV-R:BIO-ATAGTTTTAACATTTCGACACCATTCATGTAG
探针FHV-P2:
FAM-CGGTCGCCTTCATATTGGTTGGAACCTTTAAC(THF)AAGTATATGTTCCTAACAG-C3spacer
1、固化工艺及效果验证
为方便保存和生产操作,将液体试剂(如实施例3所述的第一反应液和第二反应液,0.02ml)分别用移液器加到6mm直径的玻纤圆片上,于温度37℃、湿度10%条件下干燥2小时,制得固化试剂。液体试剂与固化试剂同步比较测试结果,检测结果见表1。
表1、固化工艺效果验证
由表1可以看出,采用固化试剂和液体试剂进行检测,检测结果类似,无明显差异,甚至固化试剂的平均检测灵敏度还稍高于普通的液体试剂。
2、风干工艺及效果验证
风干试剂的制备方法为:将液体试剂加到特定容器上,没有其他载体,于温度37℃、湿度10%条件下干燥4小时,之后从容器中取出,呈片状。液体试剂、固化试剂与风干试剂同步比较测试结果,检测结果见表2。
表2、风干工艺效果验证
由表2可以看出,采用风干试剂、固化试剂和液体试剂进行检测,检测结果无明显差异,甚至固化试剂和风干试剂的平均检测灵敏度还稍高于普通的液体试剂。
综上,核酸检测系统中完全可以采用预先放置固化试剂或风干试剂的方式,来代替临时添加液体试剂的方式,使检测过程更加便利。
实施例5核酸扩增反应试剂中PEG和其他试剂的固化方式对检测结果的影响
为达到良好的扩增效果,在反应试剂中需添加PEG,PEG分子量优选20000-40000。本实施例中采用的PEG分子量为20000(Order NO.A601790CAS:[25322-68-3],生工生物工程(上海)股份有限公司)。固化工艺为:将液体试剂0.02ml用移液器加到6mm直径,厚度1mm的玻纤圆片上,于温度37℃、湿度10%条件下干燥2小时,制得固化试剂。本实施例在固化核酸扩增反应试剂的过程中,分别采用以下4种固化方式:1、全混合固化(仅一张反应膜);2、引物探针和酶共同固化(第一反应膜),PEG单独固化(第二反应膜);3、引物探针和PEG共同固化(第一反应膜),酶单独固化(第二反应膜);4、酶和PEG共同固化(第一反应膜),引物探针单独固化(第二反应膜)。采用实施例3提供的核酸检测系统进行检测,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,判读检测结果时使用标准比色卡(见图17)进行比对,比较采用4种固化方式对检测结果的影响。结果如表3所示。
表3、PEG和其他试剂的固化方式对检测结果的影响
由表3可见,在试剂固化或干燥过程中,需要将PEG与其他反应试剂分开,其原因可能是PEG在固化过程中会收缩包裹住酶或引物探针,后期复溶后也难以恢复活性,从而使核酸恒温扩增反应无法正常进行。因此PEG需要单独固化。
实施例6核酸吸附膜的选择
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统进行检测,核酸检测装置中的核酸吸附膜分别采用如表4中的不同膜材制成,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,判读检测结果时使用标准比色卡(见图17)进行比对。分别考察不同核酸吸附膜的透膜时间、含水量、吸附能力等,其中透膜时间的检测方法为;含水量的检测方法为;吸附能力的检测方法为;检测结果如表4所示。
表4、核酸吸附膜的选择
由表4可以看出,不同膜材的透膜时间存在较大差别,由于采用本发明提供的核酸检测装置进行检测时,样品是从上方直接透过核酸吸附膜的,透膜时间越短的膜材,越能快速吸收样品中的核酸,因此优选采用GF/C的二氧化硅膜或硅胶膜,因为这两种膜的孔径小,流速快,含水能力低,吸附效果好,特别适合作为核酸吸附膜,其中GF/C的二氧化硅膜的透膜时间更短,硅胶膜的吸附能力更好(吸附能力的值越低表示吸附能力越好)。
实施例7核酸吸附膜富集效率验证
本实施例选用硅胶膜作为核酸吸附膜,考察随着过膜样本量的增加,经核酸吸附膜吸附后的核酸检测结果,从而判断该核酸吸附膜的富集效率。待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测方法分别采用PCR荧光检测或产物试纸条检测,结果如表5。
表5、核酸吸附膜富集效率验证
由表5可以看出,随着过膜样本体积的增加,无论是荧光Ct值还是胶体金试纸条条带深度,都有较显著提升,说明硅胶膜存在较好的核酸富集作用。
实施例8不同裂解液对检测结果的影响
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统,其中的裂解液分别采用,考察不同裂解液对核酸检测结果的影响,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测结果见表6。
表6、不同裂解液对检测结果的影响
由表6可以看出,不同裂解液对检测结果存在显著影响,其原因是有些裂解液在进入核酸扩增反应腔后会对恒温扩增反应产生不利影响,而采用本发明提供的裂解液,不会对核酸扩增反应产生不利影响,因此经核酸吸附膜吸附样品中的核酸后,都无需添加清洗剂冲洗,即可用洗脱液洗脱目标核酸并进入恒温扩增反应,特别适用于本发明提供的核酸检测装置。
实施例9不同洗脱液对检测结果的影响
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统,其中的洗脱液分别采用,考察不同洗脱液对核酸检测结果的影响,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测结果见表7。
表7、不同洗脱液对检测结果的影响
由表7可以看出,不同洗脱液对检测结果存在显著影响,其原因是核酸吸附膜中的核酸经洗脱液洗脱后,需进入反应腔,与核酸扩增反应固定化试剂混合进行恒温扩增反应,需要挑选不会对核酸恒温扩增反应产生不利影响,甚至能有效促进核酸恒温扩增反应的洗脱液,用于本发明提供的核酸检测装置,因此优选采用第5组的洗脱液。
实施例10不同引流渠宽度和数量对核酸检测灵敏度的影响
本实施例采用实施例1提供的核酸检测装置,并结合核酸检测试剂进行核酸检测,其中构成引流槽的引流渠的宽度和数量分别如表8所示,检测不同设置情况下的核酸检测灵敏度,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测结果见表8。
表8、不同引流渠宽度和数量对核酸检测灵敏度的影响
由表8可以看出,随着引流渠宽度的缩小,核酸检测灵敏度显著提高,担当引流渠宽度缩小至0.3mm以后,灵敏度提高幅度明显变缓,可见通过进一步缩小引流渠宽度来提高灵敏度的效果已经非常有限,同时由于引流渠宽度越小,制作过程难度明显增大,成本提高,因此优选引流渠宽度为0.3-0.7mm,最优选为0.5mm。
同时,引流渠的数量对核酸检测灵敏度也有一定的影响,在引流渠宽度不小于0.5mm时,增加引流渠数量能进一步提升核酸检测灵敏度,但当引流渠宽度小于0.5mm以后,增加引流渠数量对于提升核酸检测灵敏度的效果并不明显,因此从制造难易程度和成本考虑,优选采用引流渠宽度为0.5mm,引流渠数量为13根。
实施例11进样通道的高度对检测结果的影响
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统,其中核酸检测装置中进样通道的高度分别选用,考察不同进样通道高度对检测结果的影响。待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测结果见表9。
表9、进样通道高度对检测结果的影响
由表9可以看出,不同进样通道高度会直接影响到样品中的核酸检测结果,其原因可能是因为不同进样通道高度会影响到样品被核酸吸附膜吸附的效果,样品从进样口进入,经一定高度的进样通道加速后,能以更大的力冲击核酸吸附膜,从而促进核酸吸附膜更充分吸附样品中的核酸,提高核酸检测灵敏度,因此优选采用高度为19mm的进样通道。
实施例12第一反应膜和第二反应膜的摆放方式对检测结果的影响
本实施例采用实施例3提供的核酸检测系统,其中的核酸扩增反应试剂采用预先摆放第一反应膜和第二反应膜的方式,第一反应膜和第二反应膜的摆放方式有3种,分别为:1、第二反应膜与第一反应膜水平摆放;2、第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方;3、第一反应膜与第二反应膜竖直摆放。检测反应膜的不同摆放方式下的核酸检测灵敏度,待测目标核酸为猫疱疹病毒FHV-R,待测样本为2copies/uL的咽拭子样本,扩增条件为42℃,12min,检测结果见表10。
表10、反应膜的不同摆放方式对核酸检测灵敏度的影响
由表10可以看出,采用第2种摆放方式,第一反应膜水平摆放,第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方的摆放方式,可以明显提升核酸检测灵敏度,其原因可能是第二反应膜也能起到一定的引流效果,同时还能提高第一反应膜和第二反应膜中试剂的混合效果,因此优选采用第二反应膜竖直摆放在第一反应膜上方的摆放方式。
本实施例提供的核酸检测系统可用于现场检测,小诊所和宠物店等场所的检测,可用于病原体的核酸检测;可用于宠物病原体、大牲畜病原体、植物病原体或食品病原体的核酸检测。
本发明未尽事宜为公知技术。虽然本发明披露如上,但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种更动与修改,因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
- 一种用于检测副猪嗜血杆菌的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法
- 核酸检测盒、利用核酸检测盒的核酸检测装置和利用核酸检测盒的核酸检测系统
- 核酸扩增检测装置以及使用了该核酸扩增检测装置的核酸检查装置