一种金属仿生复合骨修复材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，涉及一种金属仿生复合骨修复材料及其制备方法和应用，具体的涉及一种具备良好力学性能的用于大段骨缺损修复的新型金属仿生复合骨修复材料及其制备方法和应用。

背景技术

骨组织是支撑机体行动的硬组织，承担了重要的生命活动功能，同时也是容易引起损伤的组织，每年有数百万的骨损伤和缺损患者接受手术治疗，并且随着经济社会的发展和人口老龄化的加剧，骨损伤和缺损的病患正在逐年增加。目前骨科临床的“金标准”仍然是自体骨移植，然而自体骨移植存在可取骨量少，容易对自体造成二次创痛等问题，临床适用受限。因此目前应用最广泛的骨损伤和缺损修复材料首先是同种异体骨和异种骨，然后是其他各种人工骨移植替代物。异体、异种骨在临床上存在排异反应、传染病和伦理问题；传统的生物陶瓷以及高分子生物材料具有较好的生物相容性及一定骨诱导骨传导性能，但其性能难以满足临床需求，不能用于大段骨缺损修复。基于以上问题，临床上骨缺损、移植手术大部分仍然需要骨移植替代物。

目前常规的大段骨缺损替代物仍然是惰性金属材料，针对金属材料体内植入后，材料与周围的骨组织产生应力载荷的相互作用，骨的协同变形程度与材料和骨组织之间的弹性模量差异性相关。只有优化植入材料的弹性模量与人骨匹配程度，才能减少植入材料因应力遮蔽效应对原生骨组织的损伤，降低植入术区并发症风险，延长植入材料服役期限，防止植入失效。因此研发与人体骨组织弹性模量相匹配的植入材料同样具有重要的临床现实意义。大量研究者针对材料“应力遮蔽”的情况进行结构调整，拓扑优化，获得更为轻量的支架结构；但是单纯的金属支架材料仍然存在缺乏生物活性、难以与机体进行骨整合等问题，有研究者对材料表面进行涂层处理和表面活化处理，以优化骨整合。因此研发新型的大段骨缺损修复支架材料仍然是骨外科领域的重要研究课题之一。

细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)是主要由I型胶原构成的复杂的三维空间网络结构，具有一定的结构生物力学特性并且能够调节细胞生化活性。在骨组织中，ECM参与调节细胞粘附，增殖和对生长因子的反应，分化，并最终调节成熟骨的功能特征。骨ECM可诱导成骨细胞谱系细胞(如骨髓间充质干细胞、成骨细胞和骨细胞)产生新骨，并诱导破骨细胞进行骨吸收。随着骨再生医学的快速发展，ECM基支架的骨诱导、骨传导和成骨潜力日益受到重视。用于骨组织再生的ECM支架可分为两种类型，即ECM改性生物材料支架和脱细胞ECM支架。利用ECM的功能特性构建骨再生支架材料在诱导植入部位形成特定组织方面具有独特的优越性。

良好的组织工程支架材料有三个基本要素：支架材料支持组织细胞再生，具有细胞因子和可以进行种子细胞生长。理想情况下，支架材料应具有类天然骨骼的特征，为种子细胞的粘附，迁移，增殖，成骨分化和血管生成提供合适的生化环境和生物力学支持。其次，支架材料必须允许在骨组织愈合重建过程中逐渐整合到宿主组织中，使其能够承受正常的负荷。在骨再生过程中，间充质干细胞(MSCs)的归巢，成骨细胞，ECM和类骨质矿化以及终末分化骨细胞的形成在骨骼形成中起重要作用。

骨组织主要由无机物(60％)和有机物(40％)组成，无机相主要有磷灰石和少量微量元素组成，有机物主要由I型胶原蛋白(90％)和矿物质结合非胶原蛋白(10％)组成，特别是新生骨组织主要由I型胶原组成。ECM作为细胞分泌生成的非细胞三维空间网络结构，为组织提供了完整性和弹性，并且随机体生长因子和局部环境pH值的变化而不断进行改造，以调控组织和器官的发育，功能和稳态。因而ECM被认为是骨再生组织工程发展中的第四个元素。

ECM中的I型胶原纤维还通过与成骨细胞祖细胞的整合素结合来调节成骨，这导致通过Runx2转录激活启动成骨细胞分化级联反应。其他ECM分子，如OPN，OCN和DMP1，可以调节MSCs的增殖和成骨。参与骨形成和矿化的ECM也显着促进MSCs的生长，存活和分化。此外，成骨细胞需要一个表面来生成转化新基质。如果没有底物，成骨细胞仅在短距离内合成新基质，导致大缺损无法自然修复。I型胶原蛋白的变性形式抑制成骨细胞样细胞的增殖，并且可以刺激成骨细胞分化。因此，胶原蛋白充当组织支架，为锚定细胞和调节成骨细胞的生长和成骨特性提供三维空间网络基体。

ECM含有的蛋白成分不仅调节胶原纤维生成，而且也是促进成骨细胞谱系生长所必需，并且最终会影响新生骨组织的矿化。骨扩张素、角化聚糖、TSP1和TSP2对胶原纤维发生的贡献已被广泛报道。这些蛋白质通过调节胶原纤维发生来介导成骨细胞的矿化。因此，骨胶原蛋白的动态组装极大地促进了骨基质中细胞的封装和矿化。

中国专利CN 104368040 A中描述了一种脱钙骨基质材料填充于金属支架材料，但是构建后脱钙骨基质与金属材料结合不稳固，易脱落。化学交联剂的使用能够很好的解决组织与金属之间的结合力之外，带来了毒性风险，并且影响了降解性能。物理交联方法主要有真空热脱氢(DHT)和辐射交联等；中国专利CN109771101A公开了一种用于松质骨缺损修复的金属仿生骨小梁及其制备方法，利用快速熔丝制造法，将金属粉熔融后，通过静电拉丝，按预设的骨小梁模型沉积成型，获得金属仿生骨小梁，采用钽、钛钽合金或钛钽铌锆合金等，具有的促进组织再生的生物学活性，完全符合临床使用要求能代替自体或者同种异体骨，属于上述所述单纯的金属支架材料，其存在缺乏生物活性、难以与机体进行骨整合的问题，再者目前较为成熟的多种骨组织工程移植材料虽然能够在一定程度上满足移植需要，但在诱导骨组织再生的能力方面却并不能完全令人满意；中国专利201910725714.1公开了仿生骨复合材料及其制备方法和用途，该材料为由胶和/或胶原、羟基磷灰石和硅源制备而得的高度仿生化的具有纤维网络结构的复合材料，该材料可为细胞提供与天然骨相似的微环境，但羟基磷灰石并非烧结态固体，材料无承载性能，存在力学性能不足的问题。

良好的骨诱导材料应具备合适的降解能力、优异的生物功能(成骨、成血管能力)、合适的孔隙结构等，而应用于承重受力部位骨缺损的移植材料还应具备足够的力学强度，才能满足骨组织工程的要求，为一步为骨组织修复创造良好的微环境学，有学者进行了锶-铁羟基磷灰石/天然细胞外基质复合支架诱导骨再生及血管生成的研究，以冷冻干燥技术制备的Sr Fe HA/S IS复合支架具有较好的孔隙结构，且具有较为粗糙的微观表面结构，增加了表面积/体积之比，在有利于细胞粘附生长的同时，也能使掺杂的金属元素更好的释放，发挥其作用。但该支架的存在力学性能不足的问题，限制了其在承重部位骨缺损植入中的应用潜力。

当前临床中，通过针对植入支架的力学性能进行个性化调控及金属支架材料与细胞外基质材料的联合使用相对较少，上述个性化定制与细胞外基质材料的复合使用在大段骨缺损修复复合支架中具有较为理想的应用前景，针对上述构思，研发一种能与骨缺损部位力学性能相匹配，保持ECM良好的生物活性，具有良好的生物相容性，不引入有毒化学物质的复合细胞外基质的金属仿生骨支架材料，用于快速有效促进大段骨缺损的快速修复与骨组织的再生，有效改善患者愈后的生活质量，具有深远的临床意义及巨大的潜在应用价值。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供了一种金属仿生复合骨修复材料及其制备方法和应用，通过由增材制造制备得的仿生骨结构的多孔金属支架内填充细胞外基质，在配合添加少量无机相以及生物活性物质，对骨修复进程进一步调控，促进大段骨缺损的快速修复与骨组织的再生。

具体技术方案如下：

一种金属仿生复合骨修复材料，向由增材制造打印的金属仿生骨内填充混合浆料制得，所述混合浆料包括：细胞外基质与生理盐水，或者细胞外基质+无机相与生理盐水，或者细胞外基质+无机相+生物活性物质与生理盐水；其中，细胞外基质与生理盐水的质量比为1:1，细胞外基质+无机相与生理盐水的质量比为50:3：50，细胞外基质：细胞外基质+无机相+生物活性物质与生理盐水的质量比为50:2:40：50；所述混合浆料与金属仿生骨之间的质量比为7:3～63。

进一步地，所述细胞外基质源于哺乳动物软组织。

进一步地，所述无机相包括钙盐、含锶、锌、镁、或硅的无机物的一种或多种，无机相的粒径小于500μm。

进一步地，所述生物活性物质包括骨形态发生蛋白、转化生长因子、丝素蛋白、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠中的一种或多种。

5、一种金属仿生复合骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

S1、建模，采用建模软件进行仿生骨结构建模，有限元模拟计算，调整支架的形状尺寸；

S2、打印仿生金属支架材料，采用增材制造的方法打印仿生金属支架材料，对打印的支架材料进行表面处理，去除粘结和未熔融的粉料，生理盐水或PBS超声清洗后，呈仿生多孔金属支架，高温灭菌后备用；

S3、填充，将细胞外基质和/或无机相和/或生物活性物质与生理盐水均匀混合，将混合浆料加入到装有仿生多孔金属支架的模具中，超声均质化，脱气，使浆料充分填充到多孔结构中；

S4、预冻，将装有细胞外基质的浆料和金属支架的模具进行预冻，预冻条件为-80℃冰箱预冻或真空冷冻干燥机预冻；-80℃冰箱预冻3～6h，冷冻干燥机预冻则以1℃/min的降温速率降至-40℃，维持时间3～6h进行；

S5、冷冻干燥固化，将预冻后载有材料的模具放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥固化；所述冷冻干燥固化的程序设定包括：

升华干燥阶段：温度设定为-20～10℃，以1℃/min的升温速率达到设定温度后维持15～30h，真空度3-10Pa；

解析干燥阶段：温度设定为15～30℃，以1℃/min的升温速率达到设定温度后维持2～5h，真空度低于5Pa；

S6、采用冰袋或者干冰维持低温，-70～0℃，

进一步地，S3中超声均质化和脱气所用超声波30～50kHz，超声时间20～40min。

进一步地，S6中辐照剂量为5～35kGy。

一种金属仿生复合骨修复材料在制备骨缺损修复支架中应用。

进一步地，所述金属仿生骨修复材料用于制备大段骨缺损修复支架。

进一步地，所述金属仿生骨缺损修复支架根据患者需求个性化定制后通过生理盐水复水后直接使用。

本发明的工作原理介绍：增材制造制备的Ti6Al4V支架，可以通过建模设计与有限元模拟计算对其机械性能进行预期设计，可以针对人体不同部位骨组织的机械强度设计出具有与原生骨组织相同或相近力学性能的支架结构，实现个性化的定制器械快速制备；添加细胞外基质材料后，复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架获得了天然生物材料所具有的生物活性调节能力，冷冻干燥固化后的细胞外基质主要成分I型胶原变性温度均在40℃以上，具有良好的生物活性，能够满足人体内环境的要求，细胞外基质中的生物活性因子等物质更可以有效调节细胞的增殖和分化，促进骨组织快速再生。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明制备得到的复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料，相较于规模化生产的金属支架材料，可以进行个性化定制，能够与机体的特定部位骨组织进行机械性能适配；

(2)本发明制备得到的复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料，相较于一般的支架材料，除了能够提供足够的力学承载性能外，负载的细胞外基质材料，由于其卓越的生物相容性，能够更好的促进细胞吸附与增殖分化，并为多种细胞的迁移、生长、分化提供更为理想的支架结构及生物活性物质；

(3)本发明制备得到的复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料，相较于一般的支架材料，除负载有细胞外基质材料外，相较于一般的骨修复材料，能够负载多种无机相成分、生物活性物质成分，对新骨再生提供足够的基础材料与调控信号传导；

(4)本发明制备得到的复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料，相较于一般的支架材料，具有一定的可降解性能，良好的生物相容性、良好的骨诱导性及成骨活性。由于没有交联剂的使用，因此，大大降低了细胞毒性，避免了炎症反应；

(5)本发明制备得到的复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料，相较于一般的支架材料，其材料经复水后，能够充分填充到支架材料的孔隙结构中去，为细胞的迁移生长、物质的运输提供场所；

附图说明

图1为复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料微观结构图；

图2为金属仿生骨缺损修复支架结构设计图；

图3为一种金属仿生骨缺损修复支架结构图

图4为复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架制备示意图；

图5复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料制备方法示意图

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细发明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下发明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1：

设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm

实施例2：

设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm

实施例3：

设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm

冷冻干燥程序设定：升华干燥阶段：温度设定为-10℃，升温速率1℃/min，维持时间18h，真空度8Pa；解析干燥阶段：15℃，升温速率1℃/min，维持时间4h，真空度低于5Pa。将样品从冷冻干燥机中取出后真空封装。采用干冰维持低温，-40℃，

实施例4：

设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm

对比例1：设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm3，外径15mm，内径7.5mm，高度10mm，采用15～53μm粒径的TC4球形粉基于EOS M100进行支架打印，打印对打印后的支架进行喷砂处理，去除表面粘附的未熔融的粉料，30kHz清洗30min，重复2次。

对比例2：设计支架构型单元为菱形十二面体相对密度30，单元尺寸为2×2×2mm

表1实施例1至4的制备金属仿生骨缺损修复支架材料的实验条件

上述表中各参数按顺序排列包括：

填充成分：细胞外基质(g)，无机相(g)，0.5μg/ml生物活性物质(ml)，生理盐水(ml)；

预冻条件：温度(℃)，降温速率(℃/min)，维持时间(h)；

升华干燥阶段：温度(℃)，升温速率(℃/min)，维持时间(h)，真空度；

解析干燥阶段：温度(℃)，升温速率(℃/min)，维持时间(h)；

灭菌：温度(℃)，辐照剂量(kGy)；

实施例5：支架性能测试

将实施例1的仿生骨组织工程支架材料在扫描电镜下进行表征，扫描电镜图如图3所示。

1.孔隙率测定方法

取25mL刻度瓶，加无水乙醇至刻度，称总质量为m1；取同工艺制备得到的质量为m的单独细胞外基质块体浸入乙醇中，静置30min，吸去刻度线以上的无水乙醇，并称质量为m2；取出细胞外基质，称取剩余乙醇及刻度瓶的总质量为m3，该工艺下的细胞外基质的孔隙率按公式(1)计算：

孔隙率＝(m2-m3-m)/(m1-m3)×100％ (1)

不同工艺制备的细胞外基质的孔隙率见表2。

2.变性温度测定方法

参照YY/T 1453-2016组织工程医疗器械产品Ⅰ型胶原蛋白表征方法附录C。不同工艺制备的细胞外基质的变性温度见表2。

3.胶原蛋白酶体外加速降解

a)Tris溶液的配制

取3.027g Tris粉末溶解，加1.72mL HCl溶液，配置成500mL Tris溶液，存于容量瓶中，待用。

b)胶原蛋白降解液的配制

取200mL上述Tris溶液，加0.0003g、205u/mg的胶原蛋白酶，0.1110g氯化钙，溶解混匀，即得胶原蛋白酶浓度为0.3u/mL，氯化钙浓度0.05mol/L胶原降解液。

c)体外加速降解

取10mL降解液于离心管中，加不同工艺制备得到的质量为m的单独细胞外基质块体，然后将离心管放入37℃恒温箱中，每隔一段时间观察一次直至支架内细胞外基质材料不再发生变化，干燥称重质量m1。胶原酶降解率根据公式(2)计算：

胶原酶降解率＝[1-(m-m1)/m]×100％(2)

不同工艺制备的细胞外基质降解情况见表2，由于细胞外基质材料主要成分为胶原蛋白，仍然存在其他成分，并且由于无机相和其他成分的添加，所以最终表现为细胞外基质成分未完全降解。

4.抗压强度及弹性模量计算

采用万能力学试验机(MTS E45)，室温下压头下降速度为1mm/min，对试样进行压缩测试，通过力学试验机配套软件获取抗压强度测试数据，根据测试数据获取抗压强度，同时根据公式(3)计算：

E＝σ/ε (3)

其中E表示弹性模量，单位(GPa)，σ表示应力，ε表示应变。

各实施例支架材料所测得的抗压强度见表2。实施例2、3与对比例1、2的压缩强度相比较可以证明，复合支架材料的工艺处理并未对支架本身的力学性能产生明显的影响。而实施例1-4的抗压强度均满足人体骨骼对抗压强度的要求，可以证明不同参数设计可以实现力学性能可调控的目标。

表2复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架材料性能参数表

注：表2中所涉及孔隙率、变性温度和胶原酶降解率均指细胞外基质成分。

综上，表格中所列数据可以清晰的显示，添加细胞外基质材料后，复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架获得了天然生物材料所具有的生物活性调节能力，冷冻干燥固化后的细胞外基质主要成分I型胶原变性温度均在40℃以上，具有良好的生物活性，能够满足人体内环境的要求，细胞外基质中的生物活性因子等物质更可以有效调节细胞的增殖和分化，促进骨组织快速再生。胶原酶降解率说明所用细胞外基质材料主要为胶原成分，因此体内植入后可以实现降解转归，作为新骨生成的有机成分，加速新骨再生。并且通过对冷冻干燥工艺参数的调整，可以有效调控支架内填充细胞外基质的孔隙率，便于细胞长入和代谢物运输。对比例因为缺少细胞外基质存在，仅能发挥钛合金支架的机械性能起到支撑作用，虽然支架本身存在孔隙结构，但是细胞在金属材料上的黏附增殖分化速度远低于复合支架，并且金属材料很难对细胞的增殖分化进行调控。因此复合细胞外基质的金属仿生骨缺损修复支架与传统纯金属支架材料相比，除了能够提供足够的力学支撑外，更能够发挥优异的细胞调节与促进骨再生功能。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性发明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。