一种两性糖脂生物表面活性剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体地说，涉及一种两性糖脂生物表面活性剂及其制备方法。

背景技术

生物表面活性剂，是指微生物经过自身的新陈代谢形成的具有表面活性的活性物质，该类物质具有特别的亲水基和疏水基，具有比化学表面活性剂更为复杂的结构。因此其用途十分广泛，已在化工、医药、化妆、石油后期采收和环境污染治理等行业中获得广泛的应用。按照生物表面活性剂的结构特征，可以把其划分为多聚物、脂肽类、中性脂类、磷脂类等。当前，生物表面活性剂产生菌有肠球菌、假单胞菌、链霉菌、地衣芽孢杆菌、不动杆菌、酵母菌等。这些微生物在某一特定培养条件下，如合适的碳源、氮源、有机营养物、pH值及温度等，在生长过程中将分泌出具有表面活性剂的代谢产物于体外，这就是生物表面活性剂。据预测，生物表面活性剂成本只有合成表面活性剂成本的30％。由于生物表面活性剂无毒，从生态学的角度来看，生物表面活性剂比合成表面活性剂更有利于环境保护。由于生物表面活性剂具有以上优点，并能通过生物代谢等手段发酵生产，因此受到了生物工程界的普遍重视。同时，生物表面活性剂具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗炎等生物活性。

但目前已被认知的生物表面活性剂均为阴离子或非离子型表面活性剂，还没有带阳离子基团的生物表面活性剂。然后化学合成的表面活性剂存在的类型却非常丰富，因此使得化学合成的表面活性剂的应用领域也相对较宽。在常规生物表面活性剂的实际应用当中，我们常遇到一些因为没有带阳离子基团而引起的技术瓶颈。例如：在抑制菌等生化活性功能中，阳离子的效果比常规表活剂效果明显；例如在遇到液体中金属离子含量高、pH超低等问题，需要加入阳离子表面活性剂去解决。然后一旦引入不同类型的表面活性剂，在某种条件下，往往会使整体效果大大下降。因此，制备两性生物表面活性剂具有重要的应用价值，且创新性开阔了生物表面活性剂的品种和功能的多样性。

发明内容

1、要解决的问题

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种性能优良、功能多的两性糖脂生物表面活性剂及其制备方法，与现有技术相比，本发明制备的两性糖脂生物表面活性剂为优质的两性糖脂生物表面活性剂，同时制备方法简单、成本低、原料来源广泛，采用多菌体、多级联合的同一罐体发酵合成方法。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明提供的技术方案为：

一种两性糖脂生物表面活性剂，以重量百分比计，包括以下组份：

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，以重量百分比计，包括以下组份：

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，以重量百分比计，包括以下组份：

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，以重量百分比计，包括以下组份：

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，以重量百分比计，包括以下组份：

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，

所述的脂肪酸包括C

所述的多糖包括含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖的聚合多糖高分子，所述的多糖为黄原胶、葡聚糖、结冷胶中的任意一种，所述的多糖的分子量大于二十万道尔顿；

所述的两性糖脂生物表面活性分子的分子结构包含脂肪胺或糖胺，所述的两性糖脂生物表面活性分子的分子量小于三千道尔顿；所述的两性糖脂生物表面活性分子由包含Candida、Pseudomonas、Neurospora菌种进行混合交替培养，然后经分离、酸沉、过滤及浓缩得到；

所述的糖胺包括葡萄糖的N-乙酰糖胺，所述的糖胺的分子量小于一千道尔顿；

所述的脂肽包括枯草素、吩嗪素、伊枯草素、地衣素中的任意两种，所述的脂肽的分子量为八百至两千二道尔顿；

所述的脂肽包括枯草素(surfactin，7个氨基酸链)，或吩嗪素(Fengycin，10个氨基酸)，或伊枯草素(iturin，7个氨基酸链)，或地衣素(Lichenysin，7个氨基酸链)等脂肽，所述的脂肽的分子量为八百至两千二道尔顿；具体来说，所述的脂肽中枯草素，或吩嗪素，或伊枯草素，或地衣素的重量比例为10：1-12：1，所述的枯草素为一个含7个氨基酸作为亲水基和含有13-15个链长的脂肪酸链闭环脂肽，所述的吩嗪素为一个β-氨基脂肪酸(C14-C18)、10个α-氨基酸残基及一个β-氨基脂肪酸连成的闭环脂肽。所述的伊枯草素一个含7个氨基酸作为亲水基和含有14-17个链长的脂肪酸链闭环脂肽。所述的地衣素一个含7个氨基酸作为亲水基和含有13-17个链长的脂肪酸链闭环脂肽。以上脂肽可从Sigma或者日本Saraya购买；也可以由芽孢杆菌Bacillus发酵得到，发酵条件为：(1)接种量2％-10％，(2)液体发酵培养基(L)：蔗糖5-10g，谷氨酸钠5g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸亚铁0.2mg，硫酸镁5.0mg，硫酸铜1mg，pH 6-8。发酵试验在30℃原位灭菌发酵罐进行；(3)通气量0.3vvm，搅拌速度100rpm-300rpm。

所述的脂肪胺为月桂酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、油酸酰胺、硬脂油酰胺中任意一种或几种的混合物。

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂中，

所述的脂肪酸为辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、软脂酸中的一种；

所述的糖胺为葡萄糖胺或N-乙酰糖胺。

一种两性糖脂生物表面活性剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)培养：采用Pseudomonas、Candida、Neurospora细菌进行分阶段培养；

(2)分离：调节步骤(1)培养后的发酵培养液的pH值为8-10，随后进行高速离心，并回收中层清澈液；

(3)酸沉：调节步骤(2)分离后的中层清澈液的pH值为2-3，随后在4℃-10℃下冷藏24h；

(4)过滤：采用陶瓷膜在4℃-10℃下收集步骤(3)酸沉的沉淀物，随后使用pH值等于8的水溶解所述的沉淀物，再次使用陶瓷膜进行过滤，得到含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶液；

(5)浓缩：真空浓缩步骤(4)过滤后的含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶液，得到浓缩水溶液；

(6)成品：在步骤(5)浓缩后得到的浓缩水溶液中加入上述所述的组份，并搅拌1h，其中搅拌的速度为200rpm，其中搅拌的温度为20℃-50℃，即可。

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂分子的制备方法中，

步骤(1)中所述的分阶段培养如下：

种子阶段：首先采用Pseudomonas细菌在33℃-37℃下用LB培养基培养24h-36h，Candida细菌在23℃-26℃下用YPD培养基培养24h-36h，Neurospora细菌在28℃-32℃下用YPD培养基培养24h-36h；上述培养后分别准备好种子液体；

发酵阶段：首先在发酵培养基中按照5％-10％的接种量接入Pseudomonas细菌种子液，并在33℃-37℃下用发酵培养基中培养24h-36h；然后在上述发酵培养基中按照5％-10％的接种量接入Candida细菌种子液，并在23℃-26℃下培养80h-100h；最后在上述发酵培养基中按照5％-10％的接种量接入Neurospora细菌种子液，并在28℃-32℃下培养36h-48h；

步骤(2)中调节pH值前需要将步骤(1)培养后的发酵培养液在80℃-100℃下高温灭菌2h；步骤(2)中高速离心的设备为三相离心机，其离心力为10000g。

上述所述的两性糖脂生物表面活性剂分子的制备方法中，

所述的发酵培养基，以重量百分比计，包括以下组份：

其中水溶碳源为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、玉米浆中的任意一种或几种的混合物，

其中油溶碳源为植物油、动物油、石油烃、脂肪胺中的任意一种或几种的混合物。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明制备的两性糖脂生物表面活性剂为优质的两性糖脂生物表面活性剂，同时制备方法简单、成本低、原料来源广泛，采用多菌体、多级联合的同一罐体发酵合成方法。具体来说，通过不同菌种不同阶段的合成方法科学合理有效，最终发酵原液中纯两性糖脂含量达到了45g/L以上的指标，均比文献报道的要高；合成的生物表面活性剂达到了阴阳两性共体，制备的生物表面活性剂的配伍性好，尤其是与钙镁等二价离子之间的配伍性，其能与原油在不同条件下形成超低界面张力和表面张力，且具有较宽的超低界面/表面张力，此外制备的生物表面活性剂具有更好的抑菌性。根据本发明的两性生物表面活性剂的特性，具有优秀的表界面活性、抑菌性及乳化性，且抗高温抗盐，适用于多种液体体系，其可以应用于石油、食品、日化、医药等行业。

附图说明

图1为两性糖脂表面活性剂分子的结构鉴定；

图2为实施例1中两性糖脂表面活性剂分子与煤油的界面张力；

图3为实施例1中两性糖脂表面活性剂分子与钙镁二价的配伍性，其中左图为加入氯化钙，其中右图为加入氯化镁；

图4为实施例2中两性糖脂表面活性剂分子与煤油的界面张力；

图5为实施例2中两性糖脂表面活性剂分子与钙镁二价的配伍性，其中左图为加入氯化钙，其中右图为加入氯化镁.

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行描述。

需要注意的是，本申请涉及的“接种量”为相应的液体培养基重量分数。

实施例1

两性糖脂生物表面活性剂分子的制备方法为

1、菌种：两性糖脂生物表面活性剂需要用三种细菌Pseudomonas aeruginosa(ATCC 15442)、Candida albicans(ATCC 10231)、Neurospora crassa(ATCC 18889)依次来培养。

2、培养基：NaNO

3、种子摇瓶培养

斜面菌种培养48h，三支上述单菌斜面分别转接至1L的三角瓶中，其中三角瓶中填装有200mL的LB或YPD培养基，假单胞菌Pseudomonas在35℃左右培养、念珠菌Candida在25℃左右培养、链孢霉菌Neurospora在30℃左右培养，培养36h。

4、20L发酵罐生产工艺

(1)发酵：采用Pseudomonas、Candida、Neurospora细菌进行分阶段培养；

步骤(1)中所述的分阶段培养如下：

种子阶段：首先采用Pseudomonas细菌在33℃下用LB培养基培养24h，Candida细菌在23℃下用YPD培养基培养24h，Neurospora细菌在28℃下用YPD培养基培养24h；上述培养后分别准备好种子液体；

发酵阶段：首先在发酵培养基中按照5％的接种量接入Pseudomonas细菌种子液，并在35℃下用发酵培养基中培养36h，其中通气量设置为0.6vvm，其中搅拌速度设置为200rpm；然后在上述发酵培养基中按照6％的接种量接入Candida细菌种子液，并在23℃-26℃下变温培养80h，其中通气量设置为1.0vvm，其中搅拌速度设置为300rpm；最后在上述发酵培养基中按照7％的接种量接入Neurospora细菌种子液，并在28℃-32℃下变温培养48h，其中通气量设置为0.3vvm，其中搅拌速度设置为100rpm；

(2)分离：调节步骤(1)培养后的发酵培养液的pH值为10，随后进行高速离心，去除菌体和残余油脂，并回收中层清澈液；步骤(2)中调节pH值前需要将步骤(1)培养后的发酵培养液在100℃下高温灭菌2h；步骤(2)中高速离心的设备为三相离心机，其离心力为10000g；

(3)酸沉：调节步骤(2)分离后的中层清澈液的pH值为3，随后在4℃下冷藏24h；

(4)过滤：采用陶瓷膜在4℃下收集步骤(3)酸沉的沉淀物，随后使用pH值等于8的水溶解所述的沉淀物，再次使用陶瓷膜进行过滤，得到含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶液；其中陶瓷膜的孔径为0.01mm；

(5)浓缩：真空浓缩步骤(4)过滤后的含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶，真空浓缩倍数为2倍。

如表1所述，两性糖脂生物表面活性剂可通过多级、多菌种发酵工艺得到。

表1发酵培养情况

如表1和图1所示，其为两性糖脂生物表面活性分子的化学结构分析，采用高效液相色谱质谱联用、Zeta电位和电泳实验确定糖脂结构和电荷类型。两性糖脂类型表面活性分子的结构类似于下图，其中N原子在结构中存在的形式有仲胺或糖胺，在单糖分子和脂肪链结构上都存在；同时重要的是其中单糖部分是双塘；脂肪链部分可以是单链且有双键，且含有的碳原子数在18个之间。所述的两性糖脂生物表面活性分子为17-L-[(2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-葡萄糖基)-O-]-十八烯酸胺-6'，6″二乙酸酯(图1的A)与17-L-[(2′-O-β-D-吡喃葡萄糖胺基-β-D-鼠李糖基)-O-]-十八烯酸-6'，6″二乙酸酯(图1的B)，α-L-鼠李糖基胺基-(1-2)-α-L-鼠李糖基-3-羟基-癸酰-3-羟基癸酸盐(图1的C)，α-L-鼠李糖基胺基-(1-2)-α-L-鼠李糖基-3-羟基-癸酰-3-羟基癸酸胺(图1的D)，上述四种物质的混合比例为3：3：2：2。

其中两性糖脂生物表面活性剂，以重量百分比计，包括以下组份：

其中两性糖脂生物表面活性剂的制备工艺如下：将上述组份混合并搅拌1h，其中搅拌的速度为200rpm，其中搅拌的温度为20℃，即可。将上述配制的两性表面活性剂用纯洁水配制成不同浓度(50-1000ppm)的溶液。采用旋滴法测试不同浓度的溶液与煤油的界面张力，温度为20℃和90℃，从结果可以看出，如图2所示，该新型生物表面活性剂与煤油的最低界面张力在0.0008mN/m-0.001mN/m，均能达到超低界面张力。与CNKI文献调研(以生物表面活性剂为关键搜索词)的结果对比，文献报告的表面活性剂溶液与煤油的界面张力均大于0.01mN/m，因此，本申请的两性生物表面活性分子具有更高的表界面活性。

随后将制备的两性糖脂生物表面活性剂进行与金属阳离子的配伍性；如图3所示，将上述配制的两性表面活性剂用纯洁水配制成10000ppm的水溶液，然后分别加入氯化钙与氯化镁，不断添加到20000ppm的浓度。观察溶液的浑浊情况。由图可见，在高达20000ppm的钙镁离子存在下，均能保持清澈，说明该新型两性生物表面活性与阳离子钙镁离子配伍性好。与CNKI文献调研(以生物表面活性剂为关键搜索词)的结果对比，一般的生物表面活性剂分子不能耐受超过3000ppm的钙镁离子。

如表2所示，制备的的两性糖脂生物表面活性剂开展了抑菌试验，本实验参考国家标准测试WS/T 650-2019《抗菌和抑菌效果评价方法》，对本两性生物表面活性剂进行抑菌实验。与常规抑菌剂苯甲酸钠对比，两性生物表面活性剂具有更高的细菌和真菌的抑菌效果。

表2抑菌试验

实施例2

两性糖脂生物表面活性剂分子的制备方法

1、菌种：两性糖脂生物表面活性剂需要用三种细菌Pseudomonas aeruginosa(ATCC 15442)、Candida albicans(ATCC 10231)、Neurospora crassa(ATCC 18889)依次来培养。

2、培养基：NaNO

3、种子摇瓶培养

斜面菌种培养36h-48h，三支上述单菌斜面分别转接至1L的三角瓶中，其中三角瓶中填装有200mL的LB或YPD培养基，假单胞菌Pseudomonas在35℃左右培养、念珠菌Candida在25℃左右培养、链孢霉菌Neurospora在30℃左右培养，培养30h。

4、20L发酵罐生产工艺

(1)发酵：采用Pseudomonas、Candida、Neurospora细菌进行分阶段培养；

步骤(1)中所述的分阶段培养如下：

种子阶段：首先采用Pseudomonas细菌在33℃下用LB培养基培养24h，Candida细菌在23℃下用YPD培养基培养24h，Neurospora细菌在28℃下用YPD培养基培养24h；上述培养后分别准备好种子液体；

发酵阶段：首先在发酵培养基中按照8％的接种量接入Pseudomonas细菌种子液，并在35℃下用发酵培养基中培养36h，其中通气量设置为0.6vvm，其中搅拌速度设置为200rpm；然后在上述发酵培养基中按照9％的接种量接入Candida细菌种子液，并在23℃-26℃下变温培养90h，其中通气量设置为1.0vvm，其中搅拌速度设置为300rpm；最后在上述发酵培养基中按照7％的接种量接入Neurospora细菌种子液，并在28℃-32℃下变温培养48h，其中通气量设置为0.3vvm，其中搅拌速度设置为100rpm；

(2)分离：调节步骤(1)培养后的发酵培养液的pH值为8，随后进行高速离心，去除菌体和残余油脂，并回收中层清澈液；步骤(2)中调节pH值前需要将步骤(1)培养后的发酵培养液在100℃下高温灭菌2h；步骤(2)中高速离心的设备为三相离心机，其离心力为10000g；

(3)酸沉：调节步骤(2)分离后的中层清澈液的pH值为2，随后在4℃下冷藏24h；

(4)过滤：采用陶瓷膜在4℃下收集步骤(3)酸沉的沉淀物，随后使用pH值等于8的水溶解所述的沉淀物，再次使用陶瓷膜进行过滤，得到含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶液；其中陶瓷膜的孔径为0.01mm；

(5)浓缩：真空浓缩步骤(4)过滤后的含有两性糖脂生物表面活性分子的水溶液，真空浓缩的倍数5倍。

如表3所述，两性糖脂生物表面活性剂可通过多级、多菌种发酵工艺得到。

表3发酵培养情况

如表3和图1所示，其为两性糖脂生物表面活性分子的化学结构分析，采用高效液相色谱质谱联用、Zeta电位和电泳实验确定糖脂结构和电荷类型。两性糖脂类型表面活性分子的结构类似于下图，其中N原子在结构中存在的形式有仲胺或糖胺，在单糖分子和脂肪链结构上都存在；同时重要的是其中单糖部分是双塘；脂肪链部分可以是单链且有双键，且含有的碳原子数在18个之间。所述的两性糖脂生物表面活性分子为17-L-[(2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-葡萄糖基)-O-]-十八烯酸胺-6'，6″二乙酸酯与17-L-[(2′-O-β-D-吡喃葡萄糖胺基-β-D-鼠李糖基)-O-]-十八烯酸-6'，6″二乙酸酯，α-L-鼠李糖基胺基-(1-2)-α-L-鼠李糖基-3-羟基-癸酰-3-羟基癸酸盐(图1的C)，α-L-鼠李糖基胺基-(1-2)-α-L-鼠李糖基-3-羟基-癸酰-3-羟基癸酸胺(图1的D)，上述四种物质的混合比例为为4：3：2：1。

其中两性糖脂生物表面活性剂，以重量百分比计，包括以下组份：

其中两性糖脂生物表面活性剂的制备工艺如下：将上述组份混合并搅拌1h，其中搅拌的速度为200rpm，其中搅拌的温度为50℃，即可。将上述配制的两性表面活性剂用纯洁水配制成不同浓度的溶液。采用旋滴法测试不同浓度的溶液与煤油的界面张力，温度为20℃和90℃，从结果可以看出，如图4所示，该新型生物表面活性剂与煤油的最低界面张力在0.001mN/m-0.003mN/m，均能达到超低界面张力。与文献调研的结果对比，文献报告的表面活性剂溶液与煤油的界面张力均大于0.01mN/m，因此，本申请的两性生物表面活性分子具有更高的表界面活性。

随后将制备的两性糖脂生物表面活性剂进行与金属阳离子的配伍性；如图5所示，将上述配制的两性表面活性剂用纯洁水配制成10000ppm的水溶液，然后分别加入氯化钙与氯化镁，不断添加到20000ppm的浓度。观察溶液的浑浊情况。由图可见，在高达20000ppm的钙镁离子存在下，均能保持清澈，说明该新型两性生物表面活性与阳离子钙镁离子配伍性好。与文献对比，一般的生物表面活性剂分子不能耐受超过3000ppm的钙镁离子。

如表4所示，制备的的两性糖脂生物表面活性剂开展了抑菌试验，本实验参考国家标准测试WS/T 650-2019《抗菌和抑菌效果评价方法》，对本两性生物表面活性剂进行抑菌实验。与常规抑菌剂苯甲酸钠对比，两性生物表面活性剂具有更高的细菌和真菌的抑菌效果。

表4抑菌试验

本发明制备的两性糖脂生物表面活性剂为优质的两性糖脂生物表面活性剂，同时制备方法简单、成本低、原料来源广泛，采用多菌体、多级联合的同一罐体发酵合成方法。具体来说，通过不同菌种不同阶段的合成方法科学合理有效，最终发酵原液中纯两性糖脂含量达到了45g/L以上的指标，均比文献报道的要高；合成的生物表面活性剂达到了阴阳两性共体，制备的生物表面活性剂的配伍性好，尤其是与钙镁等二价离子之间的配伍性，其能与原油在不同条件下形成超低界面张力和表面张力，且具有较宽的超低界面/表面张力，此外制备的生物表面活性剂具有更好的抑菌性。根据本发明的两性生物表面活性剂的特性，本发明的生物表面活性剂可以应用于石油、食品、日化、医药等行业。

以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。