基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米粒子抗癌技术领域，尤其涉及一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

癌症自其出现以来，已经成为使人类致死的首要原因，并已发展成为全球重要的公共健康问题，如何有效的治疗癌症也已经成为人类关注的重点。现有的癌症治疗方法主要有手术切除、化疗、放疗等，但是这些治疗方法普遍存在杀死癌细胞的同时也会对正常机体造成极大的伤害，副作用极大，而一般的药物治疗方法，药效又难以满足治疗需求。随着纳米技术的发展，将纳米技术应用在医疗中可以有效的提高药效，因此有人考虑将纳米粒子应用在癌症治疗中，但传统纳米粒子(NPs)进入体内后大部分迅速被网状内皮系统吞噬、清除，可到达肿瘤细胞的纳米粒子数量会减少，从而使得药效降低，这极大地限制了纳米粒子在癌症治疗领域中的研究和应用。

基于以上的现状，如何保证纳米粒子进入体内后不被网状内皮系统吞噬、清除，以确保纳米技术在癌症治疗中的效果，就显得十分的迫切和重要。

发明内容

本发明实施例的第一个目的在于提供一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡，旨在解决现有纳米粒子进入体内后被网状内皮系统吞噬以导致纳米粒子靶向效果差、载药药效降低等问题。

本发明实施例采用的技术方案如下：

基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡，包括具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体以及包埋于所述外泌体内的复合纳米颗粒；

所述复合纳米颗粒中含有金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖，所述巯基-聚乙二醇-壳聚糖的巯基与所述金纳米团簇通过配位结合。

本发明实施例的第二个目的在于提供一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

提供金纳米团簇分散液、巯基-聚乙二醇-壳聚糖以及具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体；

向所述金纳米团簇分散液中加入所述巯基-聚乙二醇-壳聚糖，巯基与所述金纳米团簇发生配位结合，得到复合纳米颗粒；

采用电穿孔技术将所述复合纳米颗粒包埋至所述具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体内，再对所述具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体进行孵育，使所述具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体的外泌体膜得到恢复，并由此获得基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡。

本发明实施例的第三个目的是提供上述基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的应用，具体是将所述基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡作为治疗癌症的药物，或者将所述基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡作为治疗癌症药物的载体。

本发明实施例的有益效果如下：

相对于现有技术，本发明实施例提供的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡，由于纳米囊泡包括具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体以及包埋于具有肿瘤细胞特异性靶向之外泌体内的复合纳米颗粒，特异性靶向纳米囊泡进入体内时网状内皮系统对外泌体没有特异性吞噬反应，因此包埋于特异性靶向纳米囊泡的复合纳米颗粒可以有效的穿过网状内皮系统而不被网状内皮系统吞噬，从而保证复合纳米颗粒达到肿瘤细胞的量不会减少，又由于复合纳米颗粒中含有聚乙二醇修饰的壳聚糖，一方面被有效输送至肿瘤细胞表面，激活体内具有免疫功能的淋巴细胞，同时使得被激活的具有免疫功能的淋巴细胞能够分辨正常细胞和癌细胞，从而杀死癌细胞，另一方面，聚乙二醇修饰的壳聚糖具有酶响应，在酶响应下缓释以延长对肿瘤细胞的作用时间，从而起到双重提高药效的效果，再一方面，缓释出来的壳聚糖能够抑制肿瘤血管内皮细胞的生成，使得癌肿不能向周围组织浸润或转移，以达到治疗早期癌症的目的，同时还可有效抑制癌症毒素的产生，还能减轻癌症患者放疗、化疗过程中产生的不良反应，此外，由于壳聚糖具有生物可降解性和生物相容性特性，因此其不会对人体有其他副作用，上述外泌体、复合纳米颗粒以及负载于所述复合纳米颗粒上的壳聚糖三者各自特性的相互协同作用下，可以提高纳米粒子的靶向性以及载药药效，使得本发明的纳米囊泡具有良好的特异靶向性，可以直接或者间接的作为治疗癌症的药物。

本发明实施例提供的基于壳聚糖的特意向靶向纳米囊泡的制备方法，具有生产工艺简单、产品性能稳定适宜大批量生产等特点，并且获得的纳米囊泡具有良好的靶向性，同时具有良好的药效以及具有良好的载药功能。

本发明提供的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的应用，是将其作为治疗癌症的药物或者治疗癌症药物的载体，均具有特异性靶向性，能够保证治疗癌症药物的药效，且对人体无毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1提供的复合纳米颗粒透射电镜图；

图2是实施例1提供的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡透射电镜图；

图3是荷瘤小鼠注射实施例1的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡前后的靶向效果示意图；

图4是荷瘤小鼠注射实施例1的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡前后的核磁成像照片；

图5是实施例1中复合纳米颗粒、基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡以及PBS对荷瘤小鼠的治疗曲线；

图6是实施例1中复合纳米颗粒、基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡以及PBS荷瘤小鼠治疗后的体重变化曲线。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

名词解释：

MMNPs@Au：超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒负载金纳米团簇或者金纳米团簇负载于超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒；

MMNPs-DA：盐酸多巴胺修饰的超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒；

Fe

Exo-Fe

本申请涉及三方面的发明方案，其中，第一个发明方案是提供一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法。

该基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法包括以下步骤：

(A)、提供金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖；

(B)、将金纳米团簇制成金纳米团簇分散液，随后向金纳米团簇分散液中加入巯基-聚乙二醇-壳聚糖，巯基-聚乙二醇-壳聚糖上的巯基与金纳米团簇发生配位，形成极强配位化学键，由此得到包含金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖的复合纳米颗粒；

(C)、提供具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体；

(D)、采用电穿孔技术将步骤(B)得到的复合纳米颗粒包埋于具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体中，随后对所述外泌体进行孵育，使外泌体的外泌体膜恢复，由此得到基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡。

在步骤(A)中，金纳米团簇可以是纯度达到99.99％以上的金纳米团簇，也可以是负载于上转换纳米材料表面的金纳米团簇。

上转换纳米材料选自超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒、上转换发光纳米材料中的任一种。

当上转换纳米材料为超顺磁性纳米花状四氧化三铁颗粒时，一方面，可以有效抑制金纳米团簇的团聚，提高金纳米团簇的分散均匀性，进而提高巯基-聚乙二醇-壳聚糖在金纳米团簇表面的负载量；另一方面，具有导向性，可以起到导向作用，包含其的复合纳米颗粒在外加磁场的诱导下，在靶向区具有很高的富集效果，结合具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体，可以有效的提高纳米囊泡靶向肿瘤细胞的效率；再一方面，具有多角结构，在交变磁场的作用下，可加速对病变细胞的破坏，与具有缓释和激活免疫细胞的壳聚糖相结合，可以极大地提高对肿瘤的治疗效果。

当上转换纳米材料为上转换发光纳米材料时，可以是荧光纳米材料，以便于标记观察，当然，不局限于荧光纳米材料，也可以是其他上转换发光纳米材料。

当金纳米团簇负载于超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒上时，上述金纳米团簇可以通过如下的方法制备：

(A1)、将氯化铁(FeCl

(A2)、向步骤(A1)得到的MMNPs分散液中加入盐酸多巴胺，混匀，随后依次加入金种子溶液(金种子溶液带负电)和适量的老化液，混合得到MMNPs@Au分散液。

步骤(A1)中，乙二醇和二乙二醇的体积比为(1～5)：(15～19)；FeCl

步骤(A2)的具体过程为：

将步骤(A1)得到的MMNPs分散液置于离心管中，外磁场分离，去除上清液，复溶于5～10mL的四氢呋喃中，超声分散，向其中加入盐酸多巴胺(DA)，超声1h，得到混合物；

在室温下将上述混合物置于摇床(速度设为：100rpm)，反应12h，磁分离，得到MMNPs-DA，分散于水中，得到MMNPs-DA分散液；

将金种子溶液加到MMNPs-DA分散液中，置于摇床上，室温下，震荡，反应10～12h，磁分离纯化，洗掉大部分的DA，随后复溶于5～10mL的去离子水，得到MMNPs@Au种子；最后将MMNPs@Au种子加入到老化液中，逐滴滴加甲醛溶液(甲醛与去离子水的体积比为1:1)，反应30min。

上述金种子溶液中的金种子选自粒径在2nm～5nm之间的金纳米颗粒或粒径在4nm～20nm之间的胶体金中的一种。

上述的老化液为HAuCl

上述盐酸多巴胺和超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒的投料比例为(10～40)mg：(0.67～5)mmol；金种子和超顺磁性纳米花状四氧化三铁纳米颗粒的投料比例为(0.4～3.6)mg：(0.67～5)mmol；HAuCl

所述金种子溶液的浓度为(4～12)mg/mL，所述HAuCl

在步骤(B)中，金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖的投料质量比例为(1～2)：(8～9)，在该投料比例下，得到的复合纳米颗粒，巯基-聚乙二醇-壳聚糖的质量含量可以达到80％以上，以利于发挥药效。在一些优选的实施例中，巯基-聚乙二醇-壳聚糖的质量含量达到90％以上。

巯基-聚乙二醇-壳聚糖的巯基可以与金纳米团簇发生配位，形成极强的配位化学键，从而可以有效地携带壳聚糖，使得壳聚糖可以通过复合纳米粒子递送到病变细胞，而聚乙二醇的空间位阻小，有利于携带更多的壳聚糖，从而提高递送到病变细胞表面的壳聚糖量。优选地，所述巯基-聚乙二醇-壳聚糖的分子量在2000～5000之间，如可以是2500、3000、3500、4000、4500等；所述金纳米团簇的粒径在5nm～30nm之间，如可以是5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、20nm、25nm、30nm等。

本发明的巯基-聚乙二醇-壳聚糖可以通过如下的方法获得：

(B1)、将巯基-聚乙二醇-羧基(SH-PEG-COOH)分散于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，并加入EDC/NHS，使SH-PEG-COOH的羧基被活化；

(B2)、向步骤(B1)活化后的SH-PEG-COOH中加入壳聚糖(CTS)，SH-PEG-COOH与CTS的投料摩尔比为1：10～20，活化的羧基与壳聚糖上的氨基发生反应，得到PEG化的CTS，即：巯基-聚乙二醇-壳聚糖(SH-PEG-CTS)。

在步骤(C)中，具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体，选自癌细胞外泌体、免疫细胞外泌体、肿瘤干细胞外泌体、骨髓细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体中的至少一种。这几类外泌体，对肿瘤细胞具有特异性靶向，进入患者体内后可以特异性靶向病变细胞，具有极强的靶向性效果，降低需要借助外界条件对药物进行靶向而对患者产生的意外伤害。

在步骤(C)中，具有肿瘤细胞特异性靶向的外泌体，可以通过如下的方法获得：

(C1)、在温度为4℃的条件下，将收集的癌细胞悬液或者免疫细胞悬液或者肿瘤干细胞悬液或者骨髓细胞悬液或者脐带间充质干细胞悬液进行离心(3500rpm)，去除细胞碎片或凋亡小体，取上清液，继续在4℃下离心(110000g，35min)重复纯化过程，离心(110000g，1h)后沉淀成小球；

(C2)、在温度为4℃的条件下将步骤(C1)得到的小球悬浮在200μL的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除去细菌和残留的细胞膜碎片后，得到外泌体；

(C3)、在温度为4℃的条件下，将步骤(C2)得到的外泌体加入无菌磷酸盐缓冲液中稀释，然后-80℃中保存，备用。

在步骤(D)中，电穿孔包埋过程如下：

(D1)、将100～150μL的步骤(C)提供的外泌体与15～20μL的步骤(B)得到的复合纳米颗粒和85～90μL的电穿孔缓冲液(总反应体积：200～260μL)混合并置于0.2cm电穿孔试管中；

(D2)、利用电穿孔系统(Bio-Rad Gene Pluser Xcell)进行电穿孔处理，具体是将电穿孔条件设置为250V和100μF；在电穿孔过程中，外泌体的外泌体膜被穿孔，复合纳米颗粒逐渐被加载到外泌体内；

(D3)、将步骤(D2)获得的产物在37℃的条件下孵育25min，以使得外泌体的外泌体膜恢复；

(D4)、采用OptiPrep

如果需要示踪，在步骤(D4)后还可以对得到的特异性靶向纳米囊泡进行示踪物质的嫁接，如进行磺化Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-Cy5.5)等荧光标记物的嫁接，由此得到可示踪特异性靶向纳米囊泡。

基于第一个发明方案，本申请的第二发明方案是提供一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡。

该基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡包括外泌体以及包埋于所述外泌体内的复合纳米颗粒，其中，外泌体选自癌细胞外泌体、免疫细胞外泌体、肿瘤干细胞外泌体、骨髓细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体、这些外泌体均具有肿瘤细胞特异靶向性；复合纳米颗粒中含有金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖，所述巯基-聚乙二醇-壳聚糖的巯基与所述金纳米团簇通过配位结合。该复合纳米颗粒为上述制备方法得到的复合纳米颗粒。

由于该基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡中，外泌体是对肿瘤细胞具有特异性靶向的外泌体，其可以携带复合纳米颗粒进入患者体内而不被网状内皮系统当做入侵物而被吞噬或者清除，因此达到肿瘤细胞的复合纳米颗粒量不会减少，而复合纳米颗粒上携带了聚乙二醇修饰的壳聚糖，在聚乙二醇的作用下，壳聚糖具有缓释效果，有利于延长药效。

因此，本申请的第三发明方案是提供上述基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的应用，其应用包括将基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡作为治疗癌症的药物或者将其作为治疗癌症药物的载体。

为了更好的说明本申请的技术方案，下面通过若干实施例来进一步解释说明。

实施例1

一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S11.金纳米团簇的制备：

a1、将15mmol的FeCl

a2、将步骤a1得到的MMNPs分散液置于离心管中，外磁场分离，去除上清液，复溶于10mL的四氢呋喃中，超声分散，向其中加入盐酸多巴胺，超声1h，得到混合物；

a3、在室温下将上述混合物置于摇床(速度设为：100rpm)，反应12h，磁分离，得到MMNPs-DA，分散于水中，得到MMNPs-DA分散液；

a4、将10mL金种子溶液加到MMNPs-DA分散液中，置于摇床上，室温下，震荡，反应10h，磁分离纯化，洗掉大部分的DA，随后复溶于10mL的去离子水，得到MMNPs@Au种子溶液；

a5、向MMNPs@Au种子溶液中加入10mL老化液中，逐滴滴加甲醛溶液(甲醛与去离子水的体积比为1:1)，反应30min，得到金纳米团簇分散液。

S12.复合纳米颗粒的制备：

b1、按照金纳米团簇和巯基-聚乙二醇-壳聚糖的投料质量比例为1：8，向a5得到的金纳米团簇分散液中加入相对分子量为2000的巯基-聚乙二醇-壳聚糖，在XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转25min，转速为25转/分，得到复合纳米颗粒分散液。

S13.基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备：

c1、在4℃的温度下，将收集的骨髓细胞悬液进行离心(3500rpm)，去除细胞碎片或凋亡小体，取上清液，继续在4℃下离心(110000g，35min)重复纯化过程，离心(110000g，1h)后沉淀成小球；

c2、在4℃的温度下将步骤c1得到的小球悬浮在200μL的PBS中，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除去细菌和残留的细胞膜碎片后，得到外泌体；

c3、在4℃下，将步骤c2得到的外泌体加入无菌磷酸盐缓冲液中，稀释，然后-80℃中保存；

c4、将100μL的步骤c3得到的外泌体(2.4×10

c5、利用电穿孔系统(Bio-Rad Gene Pluser Xcell)在250V和100μF的条件下进行电穿孔处理；

c6、将步骤c5获得的产物在37℃下孵育25min，以使得外泌体的外泌体膜恢复；

c7、采用50％的OptiPrep

c8、对得到的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡进行NHS-Cy5.5的嫁接，由此得到示踪特异性靶向纳米囊泡。

性能测试：

1.形貌观测

对实施例1步骤S12得到的复合纳米颗粒、S13得到的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡进行透射电镜观察，结果分别如图1、图2所示。

从图1中可知，得到的复合纳米颗粒，呈现核壳结构，其中核的材料为金纳米团簇，而壳的材料为巯基-聚乙二醇-壳聚糖，基本上是巯基-聚乙二醇-壳聚糖包覆在金纳米团簇表面，形成单分散的材料。

从图2可知，囊泡的结构呈球形，其中复合纳米颗粒包埋于骨髓外泌体中，囊泡的粒径约为800nm。

2.靶向性检测

将得到的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡注入荷瘤小鼠体内，并与未注入基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的荷瘤小鼠作为空白对照组，采用核磁成像观察基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的靶向情况，具体结果如图3、图4所示。

从图3和图4可知，基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡注入荷瘤小鼠体内后，具有非常强的特异靶向性，可以快速的集结于病变细胞表面。

3.肿瘤治疗效果测试

取三只生理条件一致的荷瘤小鼠，并编号，将基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡(Exo-Fe

从图5可知，基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡能够明显的抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤体积，16天内肿瘤体积几乎不会长大，而复合纳米颗对瘤小鼠体内的肿瘤体积有一定的抑制效果，但是不明显，16天内肿瘤体积逐渐增大。

从图6可知，基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡、复合纳米颗粒注入荷瘤小鼠体内后，16天内，荷瘤小鼠的重量均没有明显的变化，表明该纳米囊泡具有优异的生物安全性。

实施例2

一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S21.提供8mg平均粒径为5nm的金纳米团簇(纯度≥99.99％)和32mg平均相对分子质量为3000的巯基-聚乙二醇-壳聚糖；

将金纳米团簇、巯基-聚乙二醇-壳聚糖和去离子水置于XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转25min，转速为25转/分，得到复合纳米颗粒分散液。

S22.基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备：

c1、在4℃的温度下，将收集的骨髓细胞悬液进行离心(3500rpm)，去除细胞碎片或凋亡小体，取上清液，继续在4℃下离心(110000g，35min)重复纯化过程，离心(110000g，1h)后沉淀成小球；

c2、在4℃的温度下将步骤c1得到的小球悬浮在200μL的PBS中，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除去细菌和残留的细胞膜碎片后，得到外泌体；

c3、在4℃下，将步骤c2得到的外泌体加入无菌磷酸盐缓冲液中，稀释，然后-80℃中保存；

c4、将100μL的步骤c3得到的外泌体(2.4×10

c5、利用电穿孔系统(Bio-Rad Gene Pluser Xcell)在250V和100μFd的条件下进行电穿孔处理；

c6、将步骤c5获得的产物在37℃下孵育25min，以使得外泌体的外泌体膜恢复；

c7、采用60％的OptiPrep

c8、对步骤c7得到的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡进行NHS-Cy5.5的嫁接，由此得到具有示踪效果的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡。

实施例3

一种基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S31.提供5mg平均粒径为10nm的金纳米团簇(纯度≥99.99％)和45mg平均相对分子质量为4000的巯基-聚乙二醇-壳聚糖；

将金纳米团簇制成分散液后向其中加入巯基-聚乙二醇-壳聚糖，得到混合液，将混合液置于XH-1T型多管可调式旋转混合器上旋转20min，转速为30转/分，得到复合纳米颗粒分散液。

S32.基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡的制备：

c1、在4℃的温度下，将收集的骨髓细胞悬液进行离心(3500rpm)，去除细胞碎片或凋亡小体，取上清液，继续在4℃下离心(110000g，35min)重复纯化过程，离心(110000g，1h)后沉淀成小球；

c2、在4℃的温度下将步骤c1得到的小球悬浮在200μL的PBS中，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除去细菌和残留的细胞膜碎片后，得到外泌体；

c3、在4℃下，将步骤c2得到的外泌体加入无菌磷酸盐缓冲液中，稀释，然后-80℃中保存；

c4、将100μL的步骤c3得到的外泌体(2.4×10

c5、利用电穿孔系统(Bio-Rad Gene Pluser Xcell)在250V和100μF进行电穿孔处理；

c6、将步骤c5获得的产物在37℃下孵育25min，以使得外泌体的外泌体膜恢复；

c7、采用65％的OptiPrep

c8、对步骤c7得到的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡进行NHS-Cy5.5的嫁接，由此得到具有示踪效果的基于壳聚糖的特异性靶向纳米囊泡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。