用于增强上皮存活和身体表面重建的高分子量透明质酸

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及使用高分子量透明质酸来补充身体的上皮表面并补偿天然多糖的缺失或功能障碍。

背景技术

透明质酸(HA)由上皮细胞等在人体表面产生。表面处HA的存在可极大地促进生物体的存活以及表皮或其他表面结构的功能完整性。HA是大多数脊椎动物组织的细胞外基质(ECM)的重要组成部分(Vigetti D等，“Hyaluronan Synthesis is Inhibited byAdenosine Monophosphate-activated Protein Kinase Through the Regulation ofHAS2 Activity in Human Aortic Smooth Muscle Cells,”The Journal of BiologicalChemistry,2011,286(10):7917-7924)。由特定的合酶产生，哺乳动物细胞可以产生两种特定的HA合酶(HAS1和HAS2)，它们产生高分子量HA(HMW-HA)，范围为数百万道尔顿(Da)，而其他同工酶(HAS3)合成的HA为低分子量HA，其分子量范围为几千Da。

HA的周转(turnover)对于维持组织稳态很重要，通常在24小时内，大约30％的HA被新形成的HA替代(Fox SB等，“Normal Human Tissues,in Addition to Some Tumors,Express Multiple Different CD44 Isoforms,Cancer Res,1994,54:4539-46)。HA的清除可通过组织内的内吞摄取而发生，特别是在淋巴结和肝脏中。活性氧(ROS)的存在会提高HA的周转(Hrabarova E等，“Pro-oxidative Effect of Peroxynitrite RegardingBiological systems:A Special Focus on High-Molar-Mass HyaluronanDegradation,”Gen Physiol Biophys,2011,30:223-38；Hrabarova E等，“Free-radicalDegradation of High-Molar-Mass Hyaluronan Induced by Ascorbate Plus CupricIons:Evaluation of Antioxidative Effect of Cysteine-derived Compounds,ChemBiodivers,2012,9:309-17；和Soltes L等，“Degradative Action of Reactive OxygenSpecies on Hyaluronan Biomacromolecules,”2006,7:659–68)。

在给定时间组织内HA的大小还取决于可以产生生物活性HA寡糖的特定的降解酶(透明质酸酶)。已经描述了在细胞质膜中合成的HA水平升高，其中存在增强的生长因子活性和细胞因子存在，例如在组织调节和伤口愈合期间以及在炎症过程中。由于其化学结构不变，HA的免疫反应的可能性大大降低，从而提高了其生物相容性(Farwick M等，“Fifty-kDa Hyaluronic Acid Upregulates Some Epidermal Genes Without Changing TNF-αExpression in Reconstituted Epidermis,”Skin Pharmacol Physiol,2011,24:210-217)。因此，预期不会对外部施用的HA产生不良反应。在成体组织中，HA合成受到损伤、炎症和赘生性肿瘤(neoplastic tumor)的刺激(Tammi RH等，“Transcriptional and Post-Translational Regulation of Hyaluronan Synthesis,”FEBS J,2011,278(9):1419-28)。在通过HAS进行的合成中，不同细胞类型之间在它们所响应的刺激物方面存在很大差异。另一方面，尽管HA结构简单，但它与众多蛋白质具有过多的相互作用特性。它与CD44等细胞受体和HA介导的细胞运动受体(RHAMM)相互作用的能力可以触发多种反应(Misra S等，“Interactions Between Hyaluronan and its Receptors(CD44,RHAMM)Regulate theActivities of Inflammation and Cancer,”Front Immunol,2015,6:201)。具体作用似乎取决于分子大小。

目前的理解是低分子量HA(LMW HA)具有最广为人知的作用。因此，皮肤病学行业偏爱LMW HA。类似地，用于眼睛表面的眼用制剂的HA主要是LMW HA。已经显示高分子量HA(HMW HA)分子比LMW HA渗透皮肤和眼睛的表面的效率低。因此，迄今为止，HMW HA尚未成为局部应用关注的主要焦点。如果使用的话，它们被用作例如在眼睛表面的润滑剂，从而发挥其作为非牛顿流体的特性。但是，在成体组织中，如果在损伤、炎症和赘生性肿瘤中刺激HA合成，则HA产生的增加应直接或间接有助于平息那些介质，例如细胞因子和生长因子，其因损伤、炎症、赘生性肿瘤而被募集或激活。

在易感性(predisposition)或持续的外部挑战不断地对组织施加压力的情况下，它们会不断增加HA的产生。随着时间的流逝，这可能会导致组织的再生能力和HA产生能力被超过和/或耗尽的情况。在这些情况下，上皮会受到损害，HA合成的调节系统将失去平衡。在HA存在的情况下，HA表达的刺激物的相对恒定表达可能会导致其蓄积并产生次级效应(secondary effect)。这些次级效应之一可能是促炎状态，例如在特应性炎症中发现的。

发明内容

在健康受试者和青年中，透明质酸(HA)的产生通常可以应对正常细胞周转和抵御环境的需求。然而，在其他情况下，例如疾病，或在老年受试者中，所产生的HA的数量或质量不足以维持人体上皮表面组织功能的完整性。本发明人提出，将高分子量(HMW)HA局部应用于特应性和其他受试者的上皮表面可以起到补充或恢复上皮表面上的HA的作用，保护上皮免受伴随上皮表面HA缺乏或受损的有害作用。

健康上皮细胞的细胞外基质(ECM)中HA的平均分子量为3-4MDa，并发生分解代谢(每天周转30％-50％，具体取决于组织类型)。从生命的第五个十年开始，上皮细胞的细胞外空间中游离的、未与细胞结合的HA的量急剧减少，但HA的总量没有显著变化。据报道这是在老年患者中观察到皮肤脱水(parchy)的主要原因，部分归因于皮肤修复能力的丧失和水结合能力的丧失。

皮肤ECM中HA的平均分子量可能随年龄而变化(例如，因为细胞合成HA的能力随年龄而降低，因此平均分子量变低)。所有这些作用都与文献中描述的HA的分子量依赖性信号函数没有直接关系。新生血管形成的机制可能由上皮和其他组织的机械稳定性控制。这样一来，就可以很好地解释为什么HMW HA通过简单地确保稳定的ECM来发挥抗血管生成的作用，而低分子量HA通过简单地将ECM中HA的分子量的平衡转移到较低的值来发挥血管生成的作用，由此降低组织的机械稳定性。本发明人提出，稳定的ECM下调炎症并有助于防止炎症进入慢性阶段；此外，HA在基质中的这种作用可能有助于解释和理解HA在肿瘤进展中的作用的有争议的报道。

本发明涉及用于在人类或非人类受试者的上皮表面恢复HA的组合物和方法。所述组合物包含HMW HA，HMW HA类似物或其组合，并且修复方法包括将所述组合物局部施用至HA量或功能不足的上皮表面。

在一些实施方式中，该方法降低了人类或非人类动物受试者的身体的内部或外部上皮表面上的超敏反应的严重程度或延迟了其发作。通过将包含极高分子量形式的透明质酸的组合物局部施用至体表，如皮肤或粘膜，本发明可以减弱或延迟上皮表面上的超敏反应的发生。可以在上皮表面上的超敏反应发生之前、期间和/或之后将组合物局部施用到上皮表面。

不受限于作用机制的理论，提出当局部施用至上皮表面时，该组合物可干扰促炎细胞因子与上皮表面上的受体的结合，从而改善细胞稳定性和完整性。

具体实施方式

透明质酸(HA)是一种碳水化合物，尤其是一种粘多糖，可以在活有机体中找到。内源性HA的生物学功能包括维持液体结缔组织(例如关节滑液和眼玻璃体液)的弹性粘度(Necas J等，“Hyaluronic acid(hyaluronan):a review”,Veterinarni Medicina,2008,53(8):397-411；Stern R等，“Hyaluronan fragments:An information-rich system”,European Journal of Cell Biology,2006,85:699-715)。尽管对HA的多种信号传导所涉及的具体机制仍知之甚少，但众所周知HA可以调节多方面的生物学效应，而这些生物学效应能随HA的大小而变化(Cyphert JM等，“Size Matters:Molecular Weight Specificityof Hyaluronan Effects in Cell Biology,”International Journal of Cell Biology,2015,Epub 2015Sep 10,563818)。

自二十世纪七十年代以来，透明质酸钠和其他粘弹性剂已用于眼内手术，自二十世纪八十年代以来已用于干眼症的治疗(Higashide T和K Sugiyama，“Use ofviscoelastic substance in ophthalmic surgery-focus on sodium hyaluronate,”Clinical Ophthalmology,2008,2(1):21-30；Polack FM和MT McNiece，“The treatmentof dry eyes with Na hyaluronate(Healon)-preliminary report,1982,1(2):133-136)；然而，迄今为止，透明质酸在上皮细胞中的生物学功能还很少受到关注(Müller-Lierheim WGK,“

用于本发明的组合物和方法中的HA是高分子量的(HMW)。在一些实施方式中，HMWHA具有大于2.5m

在一些实施方式中，用于本发明的组合物的透明质酸浓度为0.1至0.19％w/v。

在一些实施方式中，用于本发明的组合物具有：a)pH为6.8-7.6；b)渗透压(osmolarity)为240-330mosmol/kg；c)NaCl浓度为7.6-10.5g/l；和/或d)磷酸盐浓度为1.0-1.4mmol/l。

在一些实施方式中，用于本发明的组合物是澄清无色的溶液，没有可见的杂质。所设想的是，该组合物是无菌的。

在一些实施方式中，用于本发明的方法和试剂盒中的组合物是Comfort

在一些实施方式中，通过马克-霍温克方程计算，HA具有至少300万道尔顿的分子量。在一些实施方式中，通过马克-霍温克方程计算，HA具有在300万至400万道尔顿范围内的分子量。

在一些实施方式中，HMW HA是透明质酸。在一些实施方式中，HMW HA是交联的，例如hylan A和hylan B。在一些实施方式中，HMW HA是非交联的。在一些实施方式中，HMW HA是线性的。在一些实施方式中，HMW HA是非线性的。在一些实施方式中，HMW HA是透明质酸的衍生物，例如酯衍生物、酰胺衍生物或硫酸化衍生物，或前述的两种或更多种的组合。

该组合物可以是液体、固体或半固体形式。在一些实施方式中，组合物是液体(例如，流体、喷雾剂、洗剂、气雾剂)。在一些实施方式中，组合物是固体(例如，片剂、胶囊、颗粒、粉末、小袋、干粉吸入剂、咀嚼片)。在一些实施方式中，组合物是半固体(例如，乳膏、软膏、凝胶、果冻、糊剂、药膏、香脂、摩丝、泡沫、透皮贴剂、栓剂)。

在一些实施方式中，局部施用组合物的上皮表面在局部施用组合物时HA的量或HA的功能不足。在其他实施方式中，局部施用组合物的受试者的上皮表面在局部施用组合物时HA的量或HA的功能并不缺乏。

在一些实施方式中，向其局部施用组合物的上皮表面是皮肤的表面。在一些实施方式中，向其局部施用组合物的上皮表面是粘膜的上皮表面，例如眼，耳，胃肠道(例如，嘴、食道、胃、小肠、大肠、结肠、盲肠、直肠或肛门)，呼吸道(例如，鼻子、喉、气管、支气管树、肺泡)或泌尿生殖道(例如，膀胱、输尿管、尿道、肾脏、输精管、外阴、阴道、宫颈、子宫、输卵管)的粘膜。

在一些实施方式中，向其局部施用组合物的上皮表面是眼表面(例如结膜)。在一些实施方式中，向其局部施用组合物的上皮表面是非眼表面。

无论在将组合物施用于眼睛时眼表的HA或HA功能是否降低，所施用的组合物可以增加或增强其所施用的眼睛的视觉功能。所施用的组合物有助于稳定眼睛的液膜(例如眼表面的泪膜)，优化视力和视觉功能，这在诸如航空和不可能或不希望眨眼的其他环境，太空旅行，在被污染或中毒的液体中潜水，或在寒冷、高温和干燥等极端气候条件下工作的极端条件下是特别有益的。

视觉功能的增加或增强可以被定义为处理视觉信息的速度和/或准确性的增加或增强。例如，视觉功能可以描述为一个人可以多么迅速和准确地处理视觉刺激，这些视觉刺激是根据诸如适应亮度，目标对比度和目标大小之类的标准定义的。评估视觉功能和视觉功能变化的方法在本领域中是已知的(参见例如Toda I等，“Visual performance afterreduced blinking in eyes with soft contact lenses or after LASIK,”JRefract.Surg.,2009,Jan.,25(1):69-73；以及Rea MS和MJ Quellette，“Relative visualperformance:A basis for application,”Lighting Res.Technol.,1991,23(3):135-144，通过引用将其全部内容并入本文)。

可以通过任何局部施用方法将所述组合物以流体形式施用至受试者的一只或两只眼睛的眼表。例如，流体可以以一滴或多滴的形式从用于分配滴眼剂的装置(例如滴管)中施用。流体可以自己施用或由第三方施用。以单剂量或多剂量施用于眼表的剂量将根据多种因素而变化，包括患者的状况和特征，症状的程度，同时进行的治疗，治疗的频率和所需的效果。例如，可以施用一滴或多滴(每滴约例如30微升)。通常，每天给药1至3次，每次1-3滴就足够了，特别是对于急性眼表炎症。但是，在慢性眼表炎症的情况下，可能需要更频繁地给药，尤其是在治疗的初始阶段，例如，每次1-3滴，每天4、5、6、7、8、9、10或更多次。

有利地，在一些实施方式中，随着上皮表面的HA被保存或恢复，组合物的施用频率和/或每剂量的量可以随时间减少。例如，在某些情况下，在四周后，可以减少施用量和/或可以减少每天的施用频率，或可以将施用频率减少至每半天。

该组合物可以在病症存在之前，例如在超敏反应发生之前进行预防性施用，以降低病症的严重性和/或延迟其发作；或者在存在诸如超敏反应之类的病症后，可以治疗性地施用该组合物以减轻该病症的严重性。任选地，在引起该病症的事件或刺激发生之前预防性施用该组合物，所述引起该症状的事件或刺激，例如创伤(例如非手术创伤)，手术，感染(例如暴露于细菌、病毒、真菌、原生动物(例如变形虫))，或暴露于会引起受试者超敏反应的抗原。在一些实施方式中，病症的发作无限期地延迟(即，预防)。在一些实施方式中，缓解或消除了该病症的一种或多种症状。在一些实施方式中，病症的所有症状被缓解或消除。

该组合物也可以预防性地给予特别易感或易于感染的受试者。受试者的免疫受损状况可能有一种或多种原因，例如医学治疗(例如放射疗法，化学疗法或其他免疫抑制疗法)，环境暴露(例如辐射暴露)或遗传缺陷。

在组合物施用时存在病症并且通过治疗方式施用组合物的情况下，任选地，该方法进一步包括在施用流体之前确定受试者患有病症的步骤。

在一些实施方式中，所述病症可以具有以下特征中的一个或多个：白细胞在眼表面和眼泪处的侵袭，CD44在眼表面处的上调，以及免疫级联的激活，该免疫级联包括IL-1，IL-2，IL-5，IL-6，IL-8，CXCL8，IL-10，IL-12，IL-16，IL-33，MCP1，CCL2，MIP1d(也称为CCL15)，ENA-78，CXCL5，sILR1，sIL-6R，sgp sEGFR，sTNFR，I-17A，IL-21，IL-22，CXCL9，MIG，CXCL11，I-TAC，CXCL10，IP-10，MIP-1β，CCL4，RANTES和CCL5。

该病症可能是由各种刺激(外部、内部或两者)引起的。在一些实施方式中，该病症是由外部刺激引起的，该外部刺激导致眼表面的上皮的光滑度和/或完整性的破坏(例如，医学治疗，眼科手术，非手术创伤，隐形眼镜佩戴，微生物感染，过敏原，半抗原，有毒物质或刺激性物质)。

各种医学治疗，例如小分子药物，放射线(如紫外线和放射疗法)以及生物制剂，都可能导致此病。例如，该病症可能是由“β受体阻滞剂”引起的，“β受体阻滞剂”是指抑制或阻断一种或多种β-肾上腺素能受体的活性的药物。β受体阻滞剂可用于治疗高血压，稳定和不稳定的心绞痛，心律不齐，偏头痛，食管静脉曲张出血，心力衰竭和冠状动脉疾病等。一些β-受体阻滞剂拮抗β-肾上腺素能受体的一种特定亚型(例如，选择性拮抗β-1肾上腺素能受体的β-1选择性β-阻滞剂)，而其他β-受体阻滞剂是非选择性的。一些β-受体阻滞剂可以抑制诸如去甲肾上腺素(noradrenaline)或去甲肾上腺素(norepinephrine)之类的配体对一种或多种β-肾上腺素能受体的作用。因此，术语“β-受体阻滞剂”是指β-肾上腺素能受体的所有类型的拮抗剂或抑制剂，而不论β-受体阻滞剂是否拮抗一种，两种或多种β-肾上腺素能受体，以及它们是否影响其他过程。β-受体阻滞剂的例子包括但不限于醋丁洛尔，阿普洛尔，阿替洛尔，倍他洛尔，比索洛尔，波吲洛尔，布新洛尔，布他沙明，卡替洛尔，卡维地洛，塞利洛尔，艾司洛尔，拉贝洛尔，左布洛诺尔，美沙洛尔，美替洛尔，美托洛尔，纳多洛尔，奈必洛尔，纳多洛尔，氧烯洛尔，喷布洛尔，吲哚洛尔，普罗帕酮，普萘洛尔，索他洛尔，噻吗洛尔和杜仲粉末(eucommia bark)。

在一些实施方式中，所述病症是眼睛过敏。在一些实施方式中，所述病症是由外部损伤引起的非感染性角膜结膜炎，过敏性角膜结膜炎(例如季节性过敏性角膜结膜炎)或感染性角膜结膜炎例如病毒性角膜结膜炎，细菌性结膜炎，真菌性角膜结膜炎，寄生虫性结膜炎。在一些实施方式中，所述病症由内部刺激(例如，激素紊乱(例如绝经期和男性更年期)，风湿性疾病，上皮-间质转化(EMT)或自身免疫性疾病)引起的。

该病症可能是由眼睛的上皮中的创伤引起的。在一些实施方式中，创伤是由物理创伤，化学创伤，诸如准分子的激光治疗或辐射(辐射损伤)引起的。在一些实施方式中，创伤是由眼外科手术引起的。眼科手术的例子包括但不限于自然或人工角膜移植，角膜植入(例如角膜内环(ICR)和人工角膜)，青光眼手术，白内障手术(例如白内障超声乳化术，白内障囊外手术或囊内手术)，屈光手术(例如，放射状角膜切开术或屈光角膜切口)，视网膜手术，斜视(目偏视)手术，矫正激光眼科手术(例如，激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)或激光光学角膜切削术(PRK))和交联手术。在眼外科手术例如青光眼外科手术之前，期间和/或之后施用本发明的液体可以改善临床结果，例如通过加速恢复，包括术后恢复视觉功能，减少疤痕和减轻瘙痒，刺激，疼痛和其他不适。

可以施用液体以减轻或预防或延迟眼部不适例如发痒或眼痛的发作。疼痛可能有一个或多个原因。例如，眼痛可以是与眼表面的机械、化学或热刺激有关的疼痛。眼痛可能与急性或慢性炎症或免疫反应有关。随着疼痛的减轻，随之而来的是继发性神经炎症作用(secondary neuroinflammatory effect)的减轻(Belmonte C等，“TFOS DEWS II painand sensation report”,The Ocular Surface,15:404-437)。疼痛的原因可能是已知的或未知的。

在一些实施方式中，向其局部施用HMW HA组合物的受试者具有特应性。通常，包括抗体在内的免疫系统可以保护人体免受称为抗原的异物的侵害。但是，在易感人群中，免疫系统在暴露于某些物质(过敏原)时会反应过度。

过敏是超敏反应的结果，可以是即时或延迟的。涉及经典的免疫球蛋白E(IgE)依赖性反应，例如哮喘，结膜炎，过敏性鼻炎，特应性湿疹，变应性荨麻疹，甚至是过敏性反应。个体响应个体环境中的各种抗原而产生IgE抗体的倾向，导致了易感性的建立和增强，使其发展成称为特应性的速发型超敏反应。特应性与过敏不同。两者均与炎症有关，但是特应性并不遵循炎症级联反应，并且确实涉及促炎性调节剂。确实存在与过敏的联系；然而，特应性是表现出过度免疫反应(例如，以超敏反应形式)的倾向，而过敏是对过敏原的直接反应。根据Brown MA和JM Hanifin，“Atopic Dermatitis”,Current Opinion in Immunology,2(4):531-534，白细胞介素4(IL-4)在人IgE合成中可能特别重要，并且可能在控制特应性皮炎中的肥大细胞和IgE的产生起重要作用。过敏性(包括特应性)和其他超敏性疾病是对外来抗原的不适当或夸大的免疫反应。不适当的免疫反应包括那些被误导对抗固有的身体成分的反应，从而导致自身免疫性疾病。

皮肤作为有机体与外部环境之间的界面，在保护和支持其所包围的生命中起着至关重要的作用。重要的是，在特应性的情况下，存在表皮屏障的相关功能障碍(Brown S和NJReynolds,“Atopic and non-atopic eczema”,BMJ,2006,332:584)。在皮肤上，特应性可见为特应性湿疹，这是一种发痒的炎症性皮肤病症。特应性通常与上皮细胞之间的不紧密连接相关，这使身体表面更容易受到环境的伤害。不受作用机制的理论的限制，包含HMW HA的组合物的局部施用可以有助于增强ECM，从而有助于保护特应性患者的体表。

超敏反应根据Gell和Coombs分类分为四种类型。超敏性疾病通常涉及不止一种类型。I型反应(速发型超敏反应)是IgE介导的。抗原结合到与组织肥大细胞和血液嗜碱性粒细胞结合的IgE，触发预先形成的介质(例如组胺、蛋白酶、趋化因子)的释放以及其他介质(例如前列腺素、白三烯、血小板活化因子、细胞因子)的合成。这些介质引起血管舒张，毛细血管通透性增加，粘液分泌过多，平滑肌痉挛以及嗜酸性粒细胞，2型辅助性T(TH2)细胞和其他炎症细胞的组织浸润。I型反应通常会在暴露于抗原后不到一小时的时间内发生。I型超敏反应是所有特应性疾病(例如，过敏性哮喘、鼻炎、结膜炎)和许多过敏性疾病(例如，过敏反应、某些血管性水肿、荨麻疹、乳胶和某些食物过敏)的基础。术语特应性和变态反应通常可互换使用，但是如上所述，其是不同的。特应性是夸大的IgE介导的免疫反应；所有特应性疾病均为I型超敏性疾病。过敏是对外源抗原的任何夸大的免疫反应，无论其机制如何。因此，所有特应性疾病都被认为是过敏性的，但是许多过敏性疾病(例如超敏性肺炎)不是特应性的。过敏性疾病是人群中最常见的疾病。

特应性疾病最常影响鼻子、眼睛、皮肤和肺部。这些疾病包括结膜炎、外源性特应性皮炎、免疫介导的荨麻疹、免疫介导的血管性水肿、急性乳胶过敏、某些过敏性肺部疾病(例如，过敏性哮喘、IgE介导的过敏性支气管肺曲霉病的成分)、过敏性鼻炎，以及对毒刺的过敏反应。

施用HMW HA组合物的受试者可能具有与特应性或变态反应性疾病相关的遗传风险因素，例如易感基因或变异(Portelli MA等，“Genetic risk factors for thedevelopment of allergic disease identified by genome-wide association”,Clinical&Experimental Allergy,2014,45:21-21；Tamari M等，“Genome-wideAssociation Studies of Atopic Dermatitis”,Journal of Dermatology,2014,41:213-220；Hinds DA等，“A Genome-Wide Association Meta-Analysis of Self-reportedAllergy Identifies Shared and Allergy-Specific Susceptibility Loci”,NatGenet,2013,45(8):907–911；

在一些实施方式中，向其局部施用HMW HA组合物的受试者患有圆锥形角膜(KC)。圆锥形角膜是一种渐进性眼病，其中正常的圆形角膜变薄并开始膨出成圆锥状。圆锥形光线会在光线进入眼睛到达感光视网膜的过程中将光线偏转，从而导致视力失真。圆锥形角膜可以发生在一只或两只眼睛中，通常开始于一个人的青少年或20多岁的时期。

随着角膜形状变得更加不规则，它将导致渐进性近视和不规则散光的发展，从而导致视力失真和模糊的其他问题。眩光和光线敏感性也可能发生。

通常，圆锥形角膜患者每次拜访眼保健医生时都会经历眼镜处方的变化。

在皮肤等表面上，随着年龄的增长，皮肤会变得干燥，失去弹性，并伴有瘙痒。瘙痒和局部刺激是特应性疾病的标志之一。在眼睛上，它可能引起眼睛摩擦。再次揉眼睛被认为是危险因素(Galvin V等，“Keratoconus:An Inflammatory Disorder？”,Eye,2015,29:843-859)，因为它会导致眼表的细胞因子平衡的紊乱，这可能是一种KC进展的关键危险因素(Balasubramanian SA等，“Effects of Eye Rubbing on the Levels of Protease,Protease Activity,and Cytokines in Tears:Relevance in Keratoconus,”Clin ExpOptom,2013,96(2):214-218)。如上所述，IL-4在人IgE合成中可能特别重要，并且在特应性皮炎中控制肥大细胞和IgE的产生中可能具有重要作用。在这里，使用HA可以降低KC的严重程度(KolozsváriBL等，“Association Between Mediators in the Tear Fluid and theSeverity of Keratoconus”,Ophthalmic Res.,2014,51:46-51)。目前，并不认为KC的病理生理学本质上是直接炎症性的，而是准炎症性的，即与炎症相关或相关联的(McMonniesCW，“Inflammation and Keratoconus”,Optometry and Vision Science,Feb 2015,92(2):e35-e41)，涉及特定的亚临床炎症过程(Lema I等，“Inflammatory Molecules in theTears of Patients with Keratoconus”,Ophthalmology,2005,112:654-659；Lema I等，“Subclinical Keratoconus and Inflammatory Molecules from Tears”,Br JOphthalmol,2009；93:820–824)。此过程涉及泪膜中的促炎性介质，例如IL-6和MMP-9(JunAS等，“Subnormal Cytokine Profile in the Tear Fluid of Keratoconus Patients,”PLoS One,2011；6:1-8)。与角膜KC平行，成纤维细胞显示出与IL-1的结合能力增强(FabreEJ等，“Binding Sites for Human Interleukin 1Alpha,Gamma Interferon and TumorNecrosis Factor on Cultured Fibroblasts of Normal Cornea and Keratoconus,”Curr Eye Res,1991；10:585-592)，暗示与炎症有关。在KC进展中，角膜基质的初始变化可能会触发轮廓异常的发生。异常的增加则会触发角膜表面的压力增加。在这里，上皮在维持表面细胞因子稳态中起着关键作用，KC角膜增加了IL-1α和IL-1β的表达(Zhou L等，“Expression of Wound Healing and Stress-Related Proteins in KeratoconusCorneas,Curr Eye Res,1996,15:1124–1131；Bosnar D等，“Influence of Interleukin-1ɑand Tumor Necrosis Factor-ɑProduction on Corneal Graft Survival”,Croat MedJ,2006,47(1):59-66；和Pearson AR等，“Does Ethnic Origin Influence the Incidenceor Severity of Keratoconus？,”Eye(Lond),2000；14(Pt 4):625-628)。已显示角膜上皮在损伤或组织损伤后以及细胞凋亡后都会分泌IL-1(Wilson SE等，“Epithelial InjuryInduces Keratocyte Apoptosis:Hypothesized Role for the Interleukin-1System inthe Modulation of Corneal Tissue Organization and Wound Healing,Exp Eye Res,1996,62(4):325-327)。通常，IL-1α不仅在炎症过程中上调，而且在角膜外伤中也上调(West-Mays JA等，“Repair Phenotype in Corneal Fibroblasts is Controlled by anInterleukin-1ɑAutocrine Feedback Loop”,Investigative Ophthalmology&VisualScience,June 1997,38(7):1367-1379)。同时，来自KC患者的成纤维细胞显示IL-1α受体的表达升高(Bureau J等，“Modification of Prostaglandin E2 and Collagen Synthesisin Keratoconus Fibroblasts Associated with an Increase of Interleukin 1AlphaReceptor Number,”C R Acad Sci III,1993,316:425-430)。另一个关键因素可能是IL-17，这是一种与许多慢性炎性病症相关的促炎细胞因子。有趣的是，Jun等(2011年)在KC患者的泪液样本中检测到IL-17水平升高。IL-17通过刺激基质细胞分泌各种促炎性细胞因子而与角膜炎症的致病机制相关(Maertzdorf J等，“IL-17Expression in Human HerpeticStromal Keratitis:Modulatory Effects on Chemokine Production by CornealFibroblasts,”J Immunol,2002年11月15日，169(10):5897-5903)，包括IL-6，IL-8和细胞间粘附分子1(ICAM-1)(Gabr MA等，“Interleukin-17Synergizes With IFNγor TNFαtoPromote Inflammatory Mediator Release and Intercellular Adhesion Molecule-1(ICAM-1)Expression in Human Intervertebral Disc Cells,”J Orhop Res,2011,29(1):1-7)。如上所述，尽管结构简单，但HA具有与多种蛋白质的大量相互作用特性(VigettiD等，“Hyaluronan Synthesis is Inhibited by Adenosine Monophosphate-activatedProtein Kinase Through the Regulation of HAS2 Activity in Human Aortic SmoothMuscle Cells,”Journal of Biological Chemistry,2011,286(10):7917-7924)。如Vignetti等(2011)所述，HMW HA(>1000kD)和CD44诱导细胞迁移并促进伤口愈合过程(Tzircotis G等，“Chemotaxis Towards Hyaluronan is Dependent on CD44 Expressionand Modulated by Cell Type Variation in CD44-Hyaluronan Binding”,Journal ofCell Science,2005,118(21):5119-5128)；此外，细胞迁移的方向性强烈依赖于CD44表达以及细胞外基质(ECM)环境中的HA梯度(Acharya PS等，Fibroblast Migration isMediated by CD44-Dependent TGF Beta Activation,”J Cell Sci,2008,121(Pt 9):1393-1402)。HA的其他参与，包括生长因子的调节和结合以及酶活性的调节。

由于特应性是发展KC的危险因素，作为预防或延迟KC发作的预防方法，可以将该组合物局部施用于30岁以下的特应性患者的眼表，并且在所有年轻的隐形眼镜配戴者中施用，因为配戴隐形眼镜会导致角膜组织类似于特应性的改变。

可选地，HMW HA可以在一种或多种KC治疗之前，期间或之后局部施用于眼表，例如：角膜交联术(CXL)，定制的软性隐形眼镜，透气性隐形眼镜，“背负式”角膜接触镜，混合型角膜接触镜，巩膜和半巩膜片，假体角膜接触镜，外科手术应用的角膜插入物(例如Intacs产品)，角膜地形图引导的的传导性角膜移植术(topography-guided conductivekeratoplasty)或角膜移植，或上述两种或多种的组合。

任选地，该组合物还包含一种或多种生物活性剂(例如，疏水活性成分)。如本文所用，术语“生物活性剂”是指当以有效量施用以影响组织时对人类或非人类动物受试者有作用的任何物质。生物活性剂可以是任何种类的物质，例如药物分子或生物制剂(例如多肽、碳水化合物、糖蛋白、免疫球蛋白、核酸)，可以是天然产物或人工生产的，并且可以通过任何机制起作用，例如药理、免疫学或新陈代谢。生物活性剂类别的例子包括改变眼睛压力的物质(例如酶抑制剂)和抗血管生成剂。生物活性剂的一些具体实例包括类固醇(例如皮质类固醇)、抗生素、免疫抑制剂、免疫调节剂、他克莫司、纤溶酶激活剂、抗纤溶酶和环孢菌素A。在一些实施方式中，生物活性剂是用于治疗或预防眼部感染的类固醇或抗生素；青光眼药物，例如前列腺素类似物，β受体阻滞剂，α受体激动剂或碳酸酐酶抑制剂；过敏性眼用缓解剂，例如组胺拮抗剂或非甾体类抗炎药；或散瞳剂。不幸的是，在某些情况下，组合物中包括的一种或多种生物活性剂可能对眼睛或上皮表面有刺激性或损害性(例如，环孢菌素A)。有利地，通过其流变性质和其他性质，组合物中的高分子量HA可以缓解和/或保护上皮例如眼睛的上皮免受组合物中一种或多种生物活性剂的刺激和/或破坏作用(即，如果在没有高分子量HA的情况下给药，则生物活性剂对上皮表面的刺激性或损害性将更高)。

在一些实施方式中，包括在HMW HA组合物中的生物活性剂是免疫调节剂。HMW HA可以使上皮表面的环境更有益于免疫调节剂的活性，从而增强或促进免疫调节剂的作用。

在一些实施方式中，组合物不包含类固醇，抗生素或免疫调节剂。在一些实施方式中，该组合物不包含其他生物活性剂(例如，不包含疏水性活性成分)。

在某些情况下，可能希望在组合物中包含一种或多种防腐剂或去污剂。通常，此类防腐剂和去污剂对上皮例如眼上皮具有刺激性或损害性。有利地，通过其流变性质和其他性质，组合物可以减轻和/或保护上皮免受组合物中防腐剂或去污剂的刺激性和/或损害性作用。因此，在一些实施方式中，组合物还包含对上皮(例如眼上皮)具有刺激性或损害性的防腐剂或去污剂，(即，如果在没有高分子量HA的情况下给药，防腐剂或去污剂对上皮会更具刺激性或更具损害性)。在一些实施方式中，组合物不包含防腐剂或去污剂。

在一些实施方式中，组合物包含环孢菌素A、西他氯铵、泰洛沙泊或前述中的两种或更多种的组合。

在一些实施方式中，所述组合物包含生物活性剂，其为免疫抑制剂(例如，T细胞抑制剂，诸如环孢菌素A，他克莫司或西罗莫司；抗代谢物；烷基化剂；TNF抑制剂(例如，英夫利昔单抗，依那西普或阿达木单抗(adilumab))；淋巴细胞抑制剂；或白介素抑制剂)；前列腺素(例如拉坦前列素)，前列腺素类似物，或其他降低眼压的药物；抗组胺药和/或肥大细胞稳定剂(例如酮替芬)，或前述两种或更多种的组合。局部施用该组合物的上皮表面可以是眼表面或非眼表面。该组合物可以进一步包含防腐剂和/或去污剂，或不包含任何防腐剂或去污剂。

在一些实施方式中，组合物包含生物活性剂，其是选自糖皮质激素或其他类固醇的抗炎剂(例如，泼尼松，醋酸可的松，泼尼松龙，甲基泼尼松龙，地塞米松，倍他米松，曲安西龙，倍氯米松，醋酸氟可的松，醋酸脱氧皮质酮，醛固酮)，非甾体类抗炎药(例如水杨酸酯，芳基链烷酸，2-芳基丙酸，N-芳基邻氨基苯甲酸，昔康类，昔布类或磺酰苯胺)，Cox-2特异性抑制剂(例如伐地昔布，塞来昔布，或罗非昔布)，来氟米特，硫代葡萄糖金，硫代苹果酸金，aurofin，柳氮磺胺吡啶，羟氯喹，米诺四环素，TNF-α结合蛋白(例如英夫利昔单抗，依那西普或阿达木单抗)，阿巴西普，阿那白滞素，β-干扰素，γ-干扰素，白细胞介素-2，过敏症疫苗，抗组胺药，抗白三烯，β-激动剂，茶碱或抗胆碱能药，抗生素，他克莫司或类维生素A。

在一些实施方式中，组合物包含溶剂，助溶剂，缓和剂，润肤剂，防腐剂，抗氧化剂，保湿剂或增溶剂中的一种或多种。

在一些实施方式中，在将包含生物活性剂的另一种组合物施用于受试者之前，期间和/或之后，将组合物施用于受试者。在某些情况下，可能希望在另一种组合物中包含一种或多种防腐剂或去污剂。如上所述，这些防腐剂和去污剂通常对眼睛有刺激性或损害性，某些生物活性剂本身可能对眼睛有刺激性或损害性。有利地，通过其流变性质和其他性质，该组合物可以减轻和/或保护眼睛免受其他组合物中生物活性剂，防腐剂和/或去污剂的刺激和/或损害作用。因此，如果不与所述组合物一起施用，则另一组合物中的生物活性剂，防腐剂和/或去污剂将对上皮例如眼睛的上皮具有更大的刺激性或更大的损害性。

在一些实施方式中，在HMW HA组合物之前，之中或之后施用的其他组合物包括免疫调节剂。HMW HA可以使上皮表面的环境更有益于免疫调节剂的活性，从而增强或促进免疫调节剂的作用。

在一些实施方式中，其他组合物包括环孢菌素A，西他氯铵，泰洛沙泊或前述中的两种或更多种的组合。

在一些实施方式中，上皮表面是眼表面，并且另一种组合物是免疫抑制剂(例如，T细胞抑制剂，例如环孢菌素A，他克莫司或西罗莫司；抗代谢物；烷化剂；TNF抑制剂(例如，英夫利昔单抗，依那西普，或阿达木单抗)；淋巴细胞抑制剂；或白介素抑制剂)，前列腺素(例如拉坦前列素)；前列腺素类似物或其他降低眼压的药物；抗组胺药和/或肥大细胞稳定剂(例如酮替芬)，或前述两种或更多种的组合。其他组合物可以进一步包含防腐剂和/或去污剂，或没有任何防腐剂或去污剂。

施用给受试者的另一种组合物可以以任何形式并且通过任何途径(例如局部或全身)施用。在一些实施方式中，另一种组合物例如局部或通过注射施用于眼睛。在一些实施方式中，将另一种组合物局部施用于眼表。

在一些实施方式中，组合物中包含的防腐剂或去污剂是化学防腐剂或氧化防腐剂。

在一些实施方式中，包含在组合物中的防腐剂或去污剂是通过破坏微生物细胞膜的脂质结构来杀死易感微生物细胞，从而增加微生物细胞膜通透性的防腐剂或去污剂。

在一些实施方式中，包含在组合物中的防腐剂或去污剂是在不施用HMW HA的情况下引起对角膜组织例如角膜上皮，内皮，间质以及诸如膜的界面的损害的防腐剂或去污剂。

在一些实施方式中，包含在流体或其他组合物中的防腐剂或去污剂选自季铵防腐剂(例如，苯扎氯铵(BAK)或西他氯铵)，氯丁醇，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，聚季铵盐-1(例如，Polyquad

所述组合物可以是健康和美容产品，例如选自沐浴和洗浴产品，婴儿和儿童护理产品，防晒产品，洗发水，护发素，润肤露，固体或液体肥皂，头发定型产品，剃须膏，须后产品，手和指甲霜，面霜，洗面奶，古龙水，漱口水或牙膏中的一种。在一些实施方式中，组合物是化妆品，例如粉底，睫毛膏，眼影，眼线膏，果皮(peel)，磨砂膏，面膜，紧肤剂，爽肤水，身体乳霜，防晒产品，沐浴露，眼霜，手和角质层霜或化妆粉。

取决于上皮表面，可以用手或施用器施用组合物。在一些实施方式中，使用施用器施用组合物，例如滴管，棉签，化妆棉，擦巾，擦拭棒，小毛巾，海绵，纱布，粉扑，棒(wand)，粘性或非粘性绷带或隐形眼镜。

在一些实施方式中，该组合物至少基本上不含粘蛋白；或换句话说，粘蛋白浓度＜0.3％w/v。

在一些实施方式中，该组合物包含防腐剂。在其他实施方式中，流体不包含防腐剂(即，流体是不含防腐剂的)。

在一些实施方式中，该组合物还包含糖胺聚糖(GAG)，即，除了高分子量HA之外，还包含一种或多种GAG；电解质(例如氯化钠)；缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)；或上述两种或多种的组合。

在将组合物施用于受试者的眼睛时，受试者可能患有或可能未患有干眼综合征(水液缺乏型干眼或定性干眼症)。在治疗或预防方法的一些实施方式中，所述病症是眼表处的刺激，不适，炎症，免疫应答或前述的两种或更多种的组合，并且在向其施用了流体的受试者的眼睛在液体施用时没有水液缺乏型干眼(ATD)(即在没有ATD的情况下)。在治疗或预防方法的一些实施方式中，所述病症是眼表处的刺激，不适，炎症，免疫应答或前述的两种或更多种的组合，并且在向其施用了流体的受试者的眼睛在液体施用时没有定性干眼症(即在没有定性干眼的情况下)。在治疗或预防方法的一些实施方式中，所述病症是眼表处的刺激，不适，炎症，免疫应答或前述的两种或更多种的组合，并且在向其施用了流体的受试者的眼睛在液体施用时没有干眼综合症(即在没有水液缺乏型干眼或定性干眼症的情况下)。

在治疗或预防方法的一些实施方式中，所述病症是在眼表面的刺激，不适，炎症，免疫应答或前述的两种或更多种的组合，并且所述受试者未患有泪液量不足。然而，该受试者的眼表异常(形貌异常(topographic anomaly))包括角膜或眼表其他部位的隆起，而正常泪膜(正常表面张力和粘度的泪膜)无法覆盖该隆起，从而在眼表导致摩擦区域。

流体可与绷带隐形眼镜结合使用。因此，该方法可以进一步包括在施用流体之前，期间和/或之后将绷带隐形眼镜戴到眼睛上。例如，可以在将绷带隐形眼镜戴在眼睛上之前，在隐形眼镜之后来施用流体和/或在施用绷带隐形眼镜之前将流体放置在绷带隐形眼镜上。流体的使用允许绷带隐形眼镜在眼表面上施加压力，同时最小化眼表面上的摩擦。有利地，流体和绷带隐形眼镜可以在眼科手术例如青光眼手术后不久安全地使用。

本发明的另一个方面是包含用于实施本发明方法的HMW HA组合物的试剂盒。任选地，该试剂盒包括用于将组合物施用到所需的上皮表面上的施用器。

任选地，试剂盒还包括容纳组合物的容器。如瓶子，试管，瓶或香囊。

施用器可以用组合物预处理或包含组合物。

在一些实施方式中，施用器是棉签，化妆棉，擦巾，擦拭棒，小毛巾，海绵，纱布，粉扑，棒，刷子，梳子，滴管，或粘性或非粘性绷带。

试剂盒的容器可包括选自泵，喷雾器或盖的封闭物。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括通过将组合物局部施用至上皮表面而将组合物施用至上皮表面的使用说明，以及任选地用于将透明质酸恢复至透明质酸的量或功能不足的上皮表面的使用说明。

在另一个实施方式中，试剂盒包含本文所述的作为流体的组合物和一个或多个绷带隐形眼镜。绷带隐形眼镜可与组合物一起包装在同一容器中(绷带隐形眼镜与组合物接触)，或者绷带隐形眼镜可与流体分开包装在单独的容器中。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，注射器，泡罩包装等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。

该试剂盒可包括待与眼睛的眼表面或其他部分接触的递送剂(与流体分开或结合)。例如，试剂盒可包括用流体包被和/或将流体释放到眼表面上的颗粒(例如，微米颗粒或纳米颗粒)。

可选地，该试剂盒可以包括用于分配眼药水的施用器或装置(例如滴管)，该施用器或装置可以或可以不用作在使用(例如打开)试剂盒的外部包装之前试剂盒中的流体的容器，也就是说，滴眼剂分配装置可以起到容纳未使用的(未打开的)试剂盒中提供的流体的作用，或者可以是空的并且在使用试剂盒之后接收流体。任选地，试剂盒可以包括用于使用试剂盒的带有印刷或数字使用说明的标签或包装说明书，例如用于实施本发明的方法。

本发明的试剂盒可以包括包装材料，该包装材料被分隔开以容纳一个或多个容器，例如小瓶，试管等，每个容器包括将在本文所述的方法中使用的分离元件之一。仅以示例的方式，用于包装药品的包装材料包括美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药品包装材料的例子包括但不限于泡罩包装，瓶子，管，泵，袋，小瓶，不透光的密封容器，注射器，瓶以及任何适合所选制剂和预期给药和治疗方式的包装材料。

试剂盒可以包括一个或多个另外的容器，每个容器具有一种或多种从商业和使用者的角度出发用于使用本文所述的组合物所需的各种材料。此类材料的非限制性示例包括但不限于：缓冲液，稀释剂，载体，包装，容器，小瓶和/或列有内容和/或使用说明的管标签，以及带有使用说明的包装说明书。

标签可以在容器上或与容器关联。当将组成标签的字母，数字或其他字符粘贴，模制或蚀刻到容器本身时，标签可以位于容器上；当标签(例如作为包装说明书)存在于同时容纳容器的贮藏器(receptacle)或载体中时，则标签可以与容器相关联。标签可用于指示内容物将用于特定的治疗应用。标签还可以指示内容物的使用说明，例如本文所述的方法。

在试剂盒的一些实施方式中，流体可以存在于包装或分配器装置中，该包装或装置可以包含一种或多种含有本文公开的组合物的单位剂型。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以随附给药说明。

如上所述，用于本发明的组合物和方法中的HA是高分子量的(HMW)。在一些实施方式中，流体的透明质酸具有大于2.5m

此外，在上皮表面是眼表面的上皮的情况下，HMW HA和/或HMW HA类似物的浓度优选＜0.2％w/v。在其他情况下，例如，上皮表面是皮肤的上皮，HMW HA和/或HMW HA类似物的浓度优选在0.2％至3.0％w/v的范围内。

粘弹性定义为同时具有粘性和弹性性质的流体的特性。零剪切粘度被确定为消失剪切速率下的稳态剪切平稳粘度(steady shear plateau viscosity)。对于高粘度配方，首选使用控制应力流变仪进行测量。

分子量与特性粘度[η](m

[η]＝k·(Mrm)a

其中M

k＝1.3327·10

以及

a＝0.6691

其中，k和a的值被发现是最具预测性的。

可以通过以下方式产生流体：对灌装线进行消毒(如果需要)；将纯净水或注射用水(WFI)添加到不锈钢混合罐中；混合时加入盐；缓慢加入HA并混合，直到获得均匀的溶液/流体；如果需要，通过添加NaOH或HCl调节pH值，同时继续混合过程；将溶液通过1μm孔径的滤芯转移到无菌储罐中；然后通过无菌过滤将溶液无菌填充到无菌初级包装(单剂量或小瓶)中。在单剂量的情况下，这可以通过吹型-灌装-密封(BFS)工艺完成。对于眼用，该组合物优选是无菌的。对于例如皮肤的应用，该组合物可以是无菌的，但不是必须的。

优选地，流体至少基本上无粘蛋白，或者换句话说，粘蛋白浓度＜0.3％w/v。这意味着透明质酸可以达到或调节流动特性或性质，而不是由存在于受试者泪液中并主要负责其流动行为的粘蛋白。

优选的是，如果添加增加粘度的物质，则在接近最后步骤，最后步骤过程中或作为最后步骤添加它们。进行混合以达到均匀的混合物。作为替代或补充，优选首先提供纯净水或注射用水作为基础，然后任选地，首先在纯净水或注射用水中添加电解质，缓冲液和不增加粘度的物质。

HA在欧洲药典9.0，第3583页(透明质酸钠)中进一步描述，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方式中，本发明的方法和试剂盒中使用的流体具有表1所列的特征：

表1

在本发明的上下文中使用的术语“一”，“一个”，“该”和类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为同时涵盖单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。因此，例如，除非另外指出或与上下文明显矛盾，否则引用“一个细胞”或“一种化合物”应解释为涵盖单个细胞或单个化合物以及多个细胞和多个化合物。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。缩写“例如(e.g.)”源自拉丁文例如(exempligratia)，并在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“举例来说”是同义词。

在上皮表面处的HA的情况下，术语“缺乏”是指相对于生理上正常的情况，HA(膜结合的HA或未结合的HA)的量或结构缺乏，或缺乏HA的一种或多种生物学功能，该生物学功能对于皮内的细胞外间隙和在解剖位置上紧邻其下方的组织是正常的。体内测定HA含量和大小的方法是已知的(Cowman MK，“Hyaluronan and Hyaluronan Fragments”,AdvCarbohydr Chem Biochem.,2017,74:1-59，特别是第6章：Experimental Determinationof HA Content and Size In Vivo，其通过引用整体并入本文)。

在所施用的组合物的上下文中，短语“有效量”是指获得所需结果所需的组合物的量，所述所需结果例如是HA恢复(全部或部分)或在所需解剖部位的HA的一种或多种生物学功能。在一些实施方式中，有效量可以是能够预防疾病或病症，延迟疾病或病症的发作，治疗或改善疾病或病症，或者能够产生预期的治疗效果的量。

术语“上皮表面”是指主要由上皮细胞组成的身体表面。上皮是覆盖人体表面的大部分的细胞层。上皮是一组组织，执行多种功能，并采用不同的细胞排列和结构来实现这些功能。上皮可以是任何类型的上皮。它可能是角质化的(角化的)，例如皮肤，也可能是非角质化的，例如嘴，食道和阴道。例如，上皮可以是简单的鳞状上皮(例如，肺的肺泡和心脏、血管和淋巴管的内膜)，单层立方上皮(例如，在小腺的导管和分泌部中以及在肾小管中)，单层柱状上皮(例如，支气管，输卵管和子宫中的纤毛组织；消化道和膀胱中的平滑(非纤毛)组织)，假复层的柱状上皮(例如，气管和大部分上呼吸道内壁的纤毛组织)，复层鳞状上皮(例如，食管、口腔和阴道内壁)，复层立方上皮(例如，汗腺，唾液腺，乳腺)，复层柱状上皮(例如雄性尿道和某些腺管)，变移上皮(例如，膀胱、尿道和输尿管内壁)，或前述的两种或多种的任何组合。

上皮细胞的特征是存在紧密连接、粘附连接和细胞桥粒。上皮细胞是典型极化的，其顶表面面向内腔或外部环境，而基表面面向基底膜。可以将组合物局部施用于顶表面，或者如果暴露基底表面则施用于基底表面。上皮表面可以是完整的或连续的或不连续的，例如由于创伤引起的。

短语“透明质酸的生物学功能”是指讨论中的组织例如上皮中的生物学HA的一种或多种功能。例如，根据上皮的解剖部位，HA的功能可能包括以下一项或多项：水合作用，HA在细胞外基质中的水结合(使营养、分解代谢物和气体得以运输，从而滋养组织)，润滑，空间填充能力，细胞迁移所通过的骨架，组织粘度，减震(shock absorption)，自由基清除，细胞因子相互作用以及通过HA受体对炎症、细胞迁移、增殖和分化之一的调节(例如，参见Dicker KT等，“Hyaluronan:A Simple Polysaccharide with Diverse BiologicalFunctions”,Acta Biomater,2014,10(4):1558–1570)。

术语“分离的”当用作组合物的改性剂时，是指所述组合物是通过人为干预制成的或与从其天然存在的体内环境分离的。通常，如此分离的组合物基本上不含它们通常在自然界中相关的一种或多种材料，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。“基本上纯的”分子可以与一个或多个其他分子结合。因此，术语“基本上纯的”不排除组合物的组合。基本纯度可以为分子质量的至少约60％或更多。纯度也可以是约70％或80％或更高，并且可以更高，例如90％或更高。纯度可以通过任何适当的方法来确定，包括例如紫外光谱法，色谱法(例如，HPLC，气相)，凝胶电泳(例如，银或考马斯染色)和序列分析(用于核酸和肽)。

如本文所用，术语“体内平衡”是指生理系统维持内部稳定性或自身的稳定状态的能力，这是由于其各部分对可能干扰其正常状态的，非病理性疾病或功能的任何情况或刺激的协调响应。

如本文所用，术语“透明质酸”或“HA”是指由自然界中发现的N-乙酰氨基葡糖和葡萄糖醛酸的二糖重复序列组成的糖胺聚糖，也称为透明质酸(例如，由二糖[-D-葡萄糖醛酸-b1,3-N-乙酰基-D-葡糖胺-b1,4-]n的重复单元组成的直链糖胺聚糖聚合物)，以及具有化学修饰的透明质酸衍生物，例如透明质酸的酯，酰胺衍生物，烷基-胺衍生物，透明质酸的低分子量和高分子量形式以及诸如海兰胶(hylans)的交联形式。因此，二糖链可以是线性或非线性的。透明质酸可通过连接交联剂(例如硫醇，甲基丙烯酸酯，十六烷基酰胺和酪胺)进行交联。透明质酸也可以直接与甲醛和二乙烯基砜交联。海兰胶的实例包括但不限于：海兰胶A，海兰胶A(甲醛交联的糖胺聚糖聚合物)，海兰胶B(二乙烯基砜交联的糖胺聚糖聚合物)和海兰胶GF 20(Cowman MK等，Carbohydrate Polymers 2000,41:229-235；Takigami Set al.,Carbohydrate Polymers,1993,22:153-160；Balazs EA等，“Hyaluronan,itscross-linked derivative-Hylan-and their medical applications”,in CellulosicsUtilization:Research and Rewards in Cellulosics,Proceedings of NisshinboInternational Conference on Cellulosics Utilization in the Near Future(EdsInagaki,H and Phillips GO),Elsevier Applied Science(1989),NY,pp.233-241；Koehler等Scientific Reports,2017,7,article no.1210；和Pavan M等,CarbohydrPolym,2013,97(2):321-326；通过引用将其全部内容并入本文)。

术语“透明质酸”或HA包括HA本身及其药学上可接受的盐。可以将HA配制成药学上可接受的盐形式。HA的药学上可接受的盐可以使用常规技术制备。

在本发明的HA的上下文中，术语“高分子量”或“HMW”是指通过欧洲药典9.0第3584页“透明质酸钠”(通过引用整体并入本文)的方法确定的，具有>2.5m

如本文所用，术语“免疫受损的”是指患有先天性，获得性或诱导性无法发展正常免疫应答的受试者。因此，相对于正常受试者之一，免疫受损的受试者的免疫系统减弱或受损。免疫系统减弱或受损的受试者具有“免疫缺陷”或“免疫功能低下”，这与在正常免疫防御系统的一个或多个要素中被诱导或非诱导的原发性或继发性缺陷有关。免疫功能低下的疾病可能是由于药物治疗，例如放疗，化学疗法或其他免疫抑制治疗，例如类固醇，环磷酰胺，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，环孢霉素或雷帕霉素治疗引起的，特别是与癌症治疗或治疗有关的疾病或预防移植排斥。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来诊断受试者中免疫功能低下的存在。当罕见疾病发生或受试者从通常不会引起疾病的有机体生病时，尤其是在受试者反复感染的情况下，可能会存在免疫功能低下的强烈迹象。通常考虑其他可能性，例如最近获得的感染，例如HIV，肝炎，结核病等。但是，通常，明确的诊断是基于确定免疫功能低下的确切性质的实验室测试。大多数测试是在血液样本上进行的。血液包含抗体，淋巴细胞，吞噬细胞和补体成分，所有这些主要免疫成分都可能导致免疫缺陷。血细胞计数可用于确定吞噬细胞或淋巴细胞的数量是否低于正常水平。这两种细胞类型中任何一种的计数低于正常值均与免疫功能低下有关。通常还检查血细胞的外观。有时，受试者可能具有正常的细胞计数，但是细胞在结构上有缺陷。如果淋巴细胞计数低，通常会进行进一步测试以确定是否有任何特定类型的淋巴细胞低于正常淋巴细胞。可以进行淋巴细胞增殖试验以确定淋巴细胞是否可以对刺激作出反应。对刺激物的反应失败与免疫功能低下有关。还可以确定抗体水平和补体水平，以诊断免疫功能低下的存在。

如本文所用，术语“眼表面”是指眼睛和附件的结构，包括角膜，结膜，眼睑，睫毛，泪膜，主和副泪腺以及睑板腺。因此，无论是在产生部位的单个成分还是在眼表上形成薄膜，眼泪都包含在“眼表”一词中(参见Craig JP等“TFOS DEWS II Definition andClassification Report”,The Ocular Surface,2017,15:276-283，其全部内容通过引用合并于此)。可以将组合物局部施用于眼表面的一个或多个部分，包括例如整个眼表面。

“药学上可接受的盐”包括酸和碱加成盐。HA或本文描述的任何其他化合物的药学上可接受的盐旨在涵盖任何和所有药学上合适的盐形式。本文所述的优选的药学上可接受的盐是药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”是指那些保留游离碱的生物学有效性和性质的盐，这些盐在生物学上或其他方面都不是不希望的，并且是由无机酸例如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，氢碘酸，氢氟酸，亚磷酸等形成的。还包括与有机酸形成的盐，所述有机酸例如脂族一元和二元羧酸，苯基取代的链烷酸，羟基链烷酸，链烷二酸，芳香酸，脂族和芳族磺酸等，包括例如乙酸，三氟乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，马来酸，丙二酸，琥珀酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，水杨酸等。因此，示例性的盐包括硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，重亚硫酸盐，硝酸盐，磷酸盐，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，乙酸盐，三氟乙酸盐，丙酸盐，辛酸盐，异丁酸盐，草酸盐，丙二酸盐，琥珀酸辛二酸盐，癸二酸盐，延胡索酸盐，马来酸盐，扁桃酸盐，苯甲酸盐，氯苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，邻苯二甲酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，苯乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐等。还考虑了氨基酸的盐，例如精氨酸盐，葡萄糖酸盐和半乳糖醛酸盐(例如参见Berge SM等，“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Science,66:1-19(1997)，在此通过引用整体并入)。碱性化合物的酸加成盐可以通过使游离碱形式与足够量的所需酸接触而制备以根据技术人员熟悉的方法和技术来制备盐。

“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物学有效性和性质的那些盐，这些盐在生物学上或其他方面都不是不希望的。这些盐是通过将无机碱或有机碱加到游离酸中制备的。药学上可接受的碱加成盐可以与金属或胺，例如碱金属和碱土金属或有机胺形成。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠，钾，锂，铵，钙，镁，铁，锌，铜，锰，铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯，仲和叔胺的盐，取代胺，包括天然存在的取代胺，环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺，乙醇胺，二乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，2-二乙基氨基乙醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，N，N-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因，肼苯胺(hydrabamine)，胆碱，甜菜碱，乙二胺，二氨基联苄，N-甲基葡糖胺，葡萄糖胺，甲葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，多胺树脂等。参见Berge等，supra。在一些实施方式中，药学上可接受的盐是钠盐(参见欧洲药典9.0第3583页“透明质酸钠”，其通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“受试者”，“患者”和“个体”是指人类或非人类动物。受试者还指例如灵长类动物(例如人)，牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，兔子，大鼠，小鼠，鱼，鸟等。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是鸟或鱼。因此，该方法可以在医学环境和兽医环境中进行。非人类动物受试者可以是例如宠物或眼或非眼疾病的动物模型。受试者可以是任何年龄或生命阶段。例如，在一些实施方式中，受试者是婴儿或青少年。在一些其他实施方式中，该受试者是老年人。在一些实施方式中，所述受试者是特应性的(具有特应性)。

在一些实施方式中，所述受试者的眼睛在所述施用时(即，在不存在ATD的情况下)不具有水液缺乏型干眼(ATD)。

在一些实施方式中，受试者的眼睛在所述施用时(即，在不存在定性干眼的情况下)没有定性干眼。

在一些实施方式中，所述受试者的眼睛在所述施用时(即在不存在水液缺乏型干眼或定性干眼的情况下)不患有干眼综合症。

在一些实施方式中，所述受试者没有患有水液缺乏型干眼(ATD)，并且其中所述受试者具有眼表异常(形貌异常)，所述眼表异常包括角膜或正常泪膜(正常表面张力和粘度的泪膜)无法覆盖的眼表上的其他地方上的隆起，导致眼表产生摩擦区域，其中所用流体减少了摩擦。

在一些实施方式中，所述受试者是免疫受损的，即处于免疫功能低下。

短语“局部施用”在本文中以其常规含义使用，意指局部递送至所需的解剖部位，例如上皮表面(上皮的表面)。可以通过允许有效量的组合物和上皮表面接触的任何方式将包含HMW HA的组合物直接或间接施用于上皮表面。例如，该组合物可以例如通过滴眼剂或灌洗液直接施用到上皮表面，或通过与上皮表面接触的释放剂(delivery agent)间接施用。释放剂的实例是用组合物涂覆和/或将组合物释放到眼表面上的颗粒(例如，微米或纳米颗粒)。这样的颗粒可以由各种材料组成，例如天然或合成的聚合物。在一些实施方式中，释放剂本身可以滴剂形式施用。

本发明仅由说明书和附图中的实施方式示例性地描述，并且不限于此，而是包括专家在考虑和/或结合其专业知识后从本申请的完整文档中获取的所有变型，修改，替换和组合。

本文所涉及或引用的所有专利，专利申请，临时申请和出版物，包括所有附图和表格，均通过引用全文并入本文，只要它们不与本说明书的明确教导相抵触即可。

以下是说明实施本发明步骤的示例。这些示例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。

在9个国家的12个研究中心，正在对重度干眼症患者进行多中心，多国前瞻性随机临床研究(根据ODISSEY主要标准)。在HYLAN M研究中，将患者随机分为两组，一组接受之前确定的最有效的个体患者治疗，另一组改用高分子量透明质酸滴眼液(Comfort

这些患者(入组192名)已经接受了眼科医生可以提供的最佳治疗。所有患者在纳入研究时均已接受“稳定”疗法，即，在纳入本研究之前的一段规定时间内他们的疗法没有改变。将患者随机分为两组，一组继续接受当前的干眼症治疗，另一组患者接受上述流体的滴剂(

研究目标包括：(1)在严重干眼症状中，比较接受

参与HYLAN M研究的其中一个研究中心的患者到目前为止还没有通过所有的市售滴眼剂获得足够的体征和症状的缓解，医生决定进行自体血清滴眼剂治疗之前，已对这些滴眼剂进行了测试。他们将11名接受自体血清滴眼剂治疗的患者纳入研究。在这11名患者中，有6名被随机分配到Comfort

应当理解，本文描述的示例和实施例仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。另外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方式结合，并且所有此类组合可以理解为属于本发明的范围，但不限于此。