动物饲料组合物及其用途

本申请包含计算机可读形式的序列表，该序列表以引用方式并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及使用包含一种或多种微生物胞壁质酶的动物饲料改善动物的免疫力和/或抗炎能力的方法。

背景技术

胞壁质酶(muramidase)，又称溶菌酶(lysozyme)，是作为许多生物体针对细菌的防御机制产生的O-糖基水解酶。该酶通过切割细菌中的一种重要结构分子肽聚糖的糖苷键来引起细菌细胞壁的水解。当细菌细胞的细胞壁被胞壁质酶削弱后，细菌细胞就会因为不平衡的渗透压而溶解。

胞壁质酶天然存在于许多生物体，例如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物中。胞壁质酶已被分类为五种不同的糖苷水解酶(GH)家族(CAZy，www.cazy.org)：母鸡卵清胞壁质酶(GH22)、鹅卵清胞壁质酶(GH23)、噬菌体T4胞壁质酶(GH24)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)鞭毛蛋白(GH73)和拟鞘孢属(Chalaropsis)胞壁质酶(GH25)。来自GH23和GH24家族的胞壁质酶主要是从噬菌体已知的，并且直到最近才在真菌中鉴定出。已经发现胞壁质酶家族GH25在结构上与其他胞壁质酶家族无关。

胞壁质酶由于其天然丰度而传统上从母鸡卵清中提取，并且直到最近，母鸡卵清胞壁质酶还是唯一被研究用于动物饲料中的胞壁质酶。从母鸡卵清中提取的胞壁质酶是商业市场上可得的主要产品，但不能切割例如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)细胞壁中的N,6-O-二乙酰基胞壁酸，因此尤其不能溶解这种重要的人类病原体(Masschalck B、Deckers D、Michiels CW(2002),“Lytic and nonlytic mechanism ofinactivation of gram-positive bacteria by muramidase under atmospheric andhigh hydrostatic pressure”,J Food Prot.65(12):1916-23)。

WO2000/21381公开了一种组合物，该组合物包含至少两种抗微生物酶以及多不饱和脂肪酸，其中所述抗微生物酶中的一种抗微生物酶是来自雏鸡卵清的GH22胞壁质酶。GB2379166公开了一种组合物，该组合物包含破坏细菌的肽聚糖层的化合物和破坏细菌的磷脂层的化合物，其中破坏肽聚糖的化合物是来自雏鸡卵清的GH22胞壁质酶。

WO2004/026334公开了一种用于抑制牲畜肠道中肠道病原体生长的抗微生物组合物，该抗微生物组合物包含：(a)细胞壁溶解物质或其盐、(b)抗微生物物质、(c)多价螯合剂和(d)羊毛硫细菌素，其中细胞壁溶解物质或其盐是来自母鸡卵清的GH22胞壁质酶。

令人惊讶的是，本发明的发明人发现，胞壁质酶可在饲料中使用以改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力。随着人们对动物蛋白需求的不断增加，这种改善动物健康的解决方案一直是农户所感兴趣的。

发明内容

因此，本发明提供了一种改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的方法，该方法包括向该动物施用含有一种或多种微生物胞壁质酶的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂。

SEQ ID NO:1是如在WO 2013/076253中所述的来自嗜碱枝顶孢菌(Acremoniumalcalophilum)的野生型GH25胞壁质酶的具有N末端SPIRR的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是从囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)中分离的GH24胞壁质酶的基因序列。

SEQ ID NO:3是从SEQ ID NO:2推导出的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是来自囊状长毛盘菌的野生型GH24胞壁质酶的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是来自原鸡(Gallus gallus)的野生型GH22胞壁质酶(母鸡卵清胞壁质酶)的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是引物F-80470。

SEQ ID NO:7是引物R-80470。

SEQ ID NO:8是引物8643。

SEQ ID NO:9是引物8654。

SEQ ID NO:10是如在WO 2013/076253中所述的来自嗜碱枝顶孢菌的野生型GH25胞壁质酶的成熟氨基酸序列。

定义

微生物胞壁质酶：术语“微生物胞壁质酶”是指从或可从微生物源获得的具有胞壁质酶活性的多肽。微生物源的示例是真菌；即胞壁质酶是从或可从真菌界获得，其中术语界是分类级别。具体地，微生物胞壁质酶是从或可从子囊菌门(phylum Ascomycota)，例如盘菌亚门(sub-phylum Pezizomycotina)获得，其中术语门和亚门是分类级别。

如果多肽的分类级别是未知的，则本领域技术人员可以通过对该多肽执行BLASTP搜索(使用例如国家生物技术信息中心(NCIB)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将该多肽与最接近的同源物进行比较来容易地确定该多肽。为已知多肽的片段的未知多肽被认为是同一分类物种。包含在至多10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为与已知多肽来自同一分类物种。

胞壁质酶活性：术语“胞壁质酶活性”是指对肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰-D-葡糖胺残基之间或壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键进行酶促水解，从而导致由于渗透压引起的溶菌作用。胞壁质酶属于酶类别EC 3.2.1.17。通常通过浊度测定来测量胞壁质酶活性。该方法基于由胞壁质酶的溶解作用诱导的藤黄微球菌ATCC 4698悬浮液的浊度变化。在适当的实验条件下，这些变化与培养基中的胞壁质酶的量成比例(参阅联合国粮农组织食品添加剂标准综合纲要INS 1105(www.fao.org))。出于本发明的目的，根据实施例5中所述的浊度测定(“胞壁质酶活性测定”)来测定胞壁质酶活性。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:1的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:4的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:10的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

片段：术语“片段”是指在成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端有一个或多个(例如，几个)氨基酸缺乏的多肽或催化结构域；其中该片段具有胞壁质酶活性。在一个方面中，片段包含SEQ ID NO:1的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并具有胞壁质酶活性。

在另一方面中，片段包含SEQ ID NO:4的至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸，并且具有胞壁质酶活性。

在一个方面中，片段包含SEQ ID NO:10的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并具有胞壁质酶活性。

分离的：术语“分离的”是指以在自然界中环境中不存在的形式存在的物质。分离的物质的非限制性示例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，这些物质至少部分地从在自然界中与这些物质缔合的天然存在的成分中的一种或多种或全部天然存在的成分中取出；(3)任何物质，该物质相对于自然界中存在的该物质通过人工方式修饰；或(4)任何物质，该物质通过增加该物质相对于与其天然缔合的其他组分的量而被修饰(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然缔合的启动子更强的启动子)。在发酵液样品中可存在分离的物质。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指处于在翻译和任何翻译后修饰(例如N末端处理、C末端截断、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式下的多肽。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)，优选地5.0.0或更高版本中实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是为10的空位开放罚分、为0.5的空位延伸罚分，以及EBLOSUM62(EBLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得的)的Needle输出用作同一性百分比，并且计算如下：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中总空位数)

变体：术语“变体”意味着具有胞壁质酶活性的多肽，该多肽包含在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个(若干个)氨基酸残基的变化(即，取代、插入和/或缺失)。取代意味着用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；缺失意味着去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意味着在占据该位置的氨基酸旁边或紧接着占据该位置的氨基酸加入1个、2个或3个氨基酸。

在一个方面中，根据本发明的胞壁质酶变体可包含1个至5个；1个至10个；1个至15个；1个至20个；1个至25个；1个至30个；1个至35个；1个至40个；1个至45个；或1-50个，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个改变，并且具有亲本胞壁质酶(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:10)的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

单胃动物：“单胃动物”是指除人类以外的任何具有简单单腔胃的动物。单胃动物的示例包括猪(pig)或生猪(swine)(包括但不限于仔猪、生长猪和母猪)；家禽，例如火鸡、鸭子、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子(包括乳鸽)和鸡(包括但不限于肉用仔鸡(在此称为肉鸡)、雏鸡、蛋鸡、母鸡(在此称为蛋鸡))；宠物动物，例如猫和狗；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)；甲壳类动物(包括但不限于基围虾(shrimps)和对虾(prawns))；以及鱼类，(包括但不限于青甘鱼(amberjack)、巨滑舌鱼(arapaima)、鲃鱼(barb)、鲈鱼(bass)、扁鲹(bluefish)、鲮脂鲤科(bocachico)、鳊鱼(bream)、大头鱼(bullhead)、大盖巨脂鲤(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉魮(catla)、虱目鱼(chanos)、红点鲑(char)、丽鱼科鱼(cichlid)、军曹鱼、鳕鱼、莓鲈(crappie)、金头鲷(dorada)、石首鱼(drum)、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼(goldfish)、丝足鱼(gourami)、石斑鱼、花身副丽鱼(guapote)、大比目鱼(halibut)、爪哇鱼(java)、野鲮属(labeo)、濑鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼(mackerel)、遮目鱼(milkfish)、银鲈(mojarra)、泥鱼(mudfish)、鲻鱼(mullet)、帕克鱼(paco)、绿腹丽鱼(pearlspot)、银汉鱼(pejerrey)、河鲈鱼(perch)、梭子鱼(pike)、鲳参鱼(pompano)、斜齿鳊(roach)、长丝异鳃鲶(sampa)、大眼鰤鲈(sauger)、海鲈鱼(sea bass)、海鲷(seabream)、闪光鱼(shiner)、鲈塘鳢(sleeper)、黑鱼(snakehead)、鲷鱼(snapper)、锯盖鱼(snook)、鳎(sole)、蓝子鱼(spinefoot)、鲟鱼(sturgeon)、翻车鱼、香鱼、丁鲷(tench)、皇冠鱼(terror)、罗非鱼(tilapia)、鳟鱼(trout)、金枪鱼(tuna)、大菱鲆(turbot)、白鳟鱼(vendace)、玻璃梭鲈(walleye)和白鲑鱼(whitefish))。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合或旨在被动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。用于单胃动物的动物饲料通常包含浓缩物以及维生素、矿物质、酶、直接饲喂的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(诸如在预混物中)，而用于反刍动物的动物饲料通常包含草料(包括粗饲料和青贮料)并且还可以包含浓缩物以及维生素、矿物质、酶、直接饲喂的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(诸如在预混物中)。

浓缩物：术语“浓缩物”是指具有高蛋白质和能量浓度的饲料，诸如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(整粒玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦，或通过压碎、碾磨等从例如玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦制成)、油料压榨饼(例如，来自棉籽、红花、向日葵、大豆(诸如豆粕)、油菜籽/低芥酸菜籽、花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和蒸馏酒粕(诸如湿蒸馏酒粕(wet distillers grains,WDS))和具有可溶物的干蒸馏酒粕(dried distillers grainswith solubles,DDGS)。

草料：如本文所定义的术语“草料”也包括粗饲料。草料是来自饲用植物、禾草和其他饲用植物、海藻、发芽谷物和豆类或它们的任何组合的新鲜植物材料，例如干草和青贮料。饲用植物的示例为苜蓿(紫花苜蓿)、百脉根(birdsfoot trefoil)、芸苔属(例如羽衣甘蓝、油菜(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、芜菁(turnip))、三叶草(例如杂种车轴草、红车轴草、地三叶草、白三叶草)、禾草(例如狗牙根、雀麦草、假燕麦草、羊茅草(fescue)、欧石楠草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅草(orchard grass)、黑麦草、提摩西草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦以及蔬菜(例如甜菜)。草料还包括来自粮食生产的作物残茬(例如玉米秸秆；来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)；来自蔬菜的残余物，如甜菜缨(beet tops)；来自油籽生产的残余物，如来自大豆、油菜籽和其他豆类的茎和叶；以及来自供动物或人食用的谷物的提炼或来自燃料生产或其他工业的级分。

粗饲料：术语“粗饲料”是指具有高纤维水平的干燥植物材料，例如纤维、麸皮、来自种子和谷粒的外皮以及作物残茬(例如秸秆、干椰子肉、糠秕、甜菜渣)。

具体实施方式

改善免疫力和/或抗炎能力的方法

已经令人惊讶地发现，与不含微生物胞壁质酶的动物饲料相比，用微生物胞壁质酶补充动物饲料导致了改善单胃动物的免疫力的显著益处。在肉鸡体内试验中，令人惊讶地发现：

(a)用胞壁质酶处理导致了空肠中更高的上皮内淋巴细胞(IEL)和杯状细胞(GC)；和/或

(b)用胞壁质酶处理导致了对传染性法氏囊疫苗接种(Gumboro vaccination)的更低的响应。

已经进一步令人惊讶地发现，与不含微生物胞壁质酶的动物饲料相比，用微生物胞壁质酶补充动物饲料具有改善单胃动物的抗炎能力的效应。在肉鸡体内试验中，令人惊讶地发现：

(a)用胞壁质酶处理导致了空肠中更高的细胞因子LITAF、IL-10和/或TLR5；并且/或者

(b)用胞壁质酶处理导致了盲肠中减少的梭菌属(Clostridium)。

因此，本发明涉及一种改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的方法，所述方法包括向所述动物施用包含一种或多种微生物胞壁质酶的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂。

在本发明中，所述改善是与不存在微生物胞壁质酶的动物饲料或动物饲料添加剂(在本文称为阴性对照)相比而言。

优选地，空肠中的IEL和/或GC与阴性对照相比高了至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

优选地，对传染性法氏囊疫苗接种的响应与阴性对照相比低了至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

优选地，空肠中的细胞因子LITAF、IL-10和/或TLR5与阴性对照相比高了至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

在本发明中，微生物胞壁质酶可以100mg酶蛋白/kg动物饲料至1000mg酶蛋白/kg动物饲料，例如200mg酶蛋白/kg动物饲料至900mg酶蛋白/kg动物饲料、300mg酶蛋白/kg动物饲料至800mg酶蛋白/kg动物饲料、400mg酶蛋白/kg动物饲料至700mg酶蛋白/kg动物饲料、500mg酶蛋白/kg动物饲料至600mg酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合的水平投配。

在本发明中，所述单胃动物可选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、家禽、火鸡、鸭子、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡、猫、狗、马、甲壳类动物、基围虾、对虾、鱼类、青甘鱼、巨滑舌鱼、鲃鱼、鲈鱼、扁鲹、鲮脂鲤科、鳊鱼、大头鱼、大盖巨脂鲤、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉魮、虱目鱼、红点鲑、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、莓鲈、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、花身副丽鱼、大比目鱼、爪哇鱼、野鲮属、濑鱼、泥鳅、鲭鱼、遮目鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕克鱼、绿腹丽鱼、银汉鱼、河鲈鱼、梭子鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、长丝异鳃鲶、大眼鰤鲈、海鲈鱼、海鲷、闪光鱼、鲈塘鳢、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、鳎、蓝子鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼、丁鲷、皇冠鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、大菱鲆、白鳟鱼、玻璃梭鲈、和白鲑鱼。优选地，所述单胃动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、家禽、火鸡、鸭子、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡。更优选地，所述单胃动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、雏鸡、肉鸡、蛋鸡和小鸡。

在本发明中，可以从出生直到屠宰将微生物胞壁质酶饲喂给动物。优选地，从出生直到屠宰每天将微生物胞壁质酶饲喂给动物。更优选地，在动物的寿命期间每天将微生物胞壁质酶饲喂给该动物达至少10天，例如至少15天或至少20天(其中这些天可为连续或不连续的)。此外优选地，将微生物胞壁质酶饲喂给动物10-20天，之后是5-10天的非治疗期，并且将该循环在该动物的寿命期间重复。

在本发明中，可在肉鸡孵化后的前49天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。优选地，在孵化后的前36天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。更优选地，在孵化后的第22天至第36天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏前(pre-starter)期(第1-7天)期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏(第8-22天)期期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏前(第1-7天)期和育雏(第8-22天)期期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。优选地，从孵化开始的76周期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。更优选地，在产蛋期期间(从约第18周开始)将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。此外优选地，在产蛋期期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡，但在强制换羽期期间不饲喂所述酶。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。优选地，从孵化开始的24周期间将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。更优选地，在从孵化开始的前16周(对于雌火鸡来说)或从孵化开始的前20周(对于雄火鸡来说)将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给生猪。优选地，在从出生开始的27周期间将微生物胞壁质酶饲喂给生猪。更优选的是，从出生到断奶(在4周时)将微生物胞壁质酶饲喂给仔猪。此外优选地，从出生开始的前6周(4周的哺乳期和断奶后2周)将微生物胞壁质酶饲喂给仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶前期(pre-starter)(断奶后的第1-14天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶期(starter)(断奶后第15-42天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶前期(断奶后第1-14天)和断奶期(断奶后第15-42天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在猪的生长/育肥期(出生后第10周至约第27周)饲喂给生猪。

在本发明中，微生物胞壁质酶可为真菌来源的。优选地，微生物胞壁质酶是从或可从子囊菌门，例如盘菌亚门获得。优选地，所述微生物胞壁质酶包含一个或多个选自由GH24和GH25组成的列表的结构域。

在本发明中，微生物胞壁质酶可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在本发明中，微生物胞壁质酶可包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体；或者是其具有胞壁质酶活性的片段，其中该片段包含至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。优选地，所述微生物胞壁质酶包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:1的氨基酸序列或等位基因变体，以及N末端和/或C末端His标签和/或HQ标签。更优选地，该多肽包含以下物质或由以下物质组成：SEQID NO:1的氨基酸1至213。

或者，微生物胞壁质酶可包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体；或者是其具有胞壁质酶活性的片段，其中该片段包含至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸。优选地，所述微生物胞壁质酶包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:4的氨基酸序列或等位基因变体，以及N末端和/或C末端His标签和/或HQ标签。更优选地，该多肽包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:4的氨基酸1至245。

或者，微生物胞壁质酶可包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其等位基因变体；或者是其具有胞壁质酶活性的片段，其中该片段包含至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸。优选地，所述微生物胞壁质酶包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或等位基因变体，以及N末端和/或C末端His标签和/或HQ标签。更优选地，该多肽包含以下物质或由以下物质组成：SEQ ID NO:10的氨基酸1至208。

在本发明中，微生物胞壁质酶可为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的变体，其中该变体具有胞壁质酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或它们的任何组合。优选地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或它们的任何组合的位置数介于1个位置与45个位置之间，例如1-40个位置、1-35个位置、1-30个位置、1-25个位置、1-20个位置、1-15个位置、1-10个位置或1-5个位置。更优选地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中包含一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或它们的任何组合的位置数不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。此外优选地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中的取代、缺失和/或插入的数量不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。进一步优选地，SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中的取代，优选地保守取代的数量不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。进一步优选地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中的保守取代的数量不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

本领域技术人员可理解，微生物胞壁质酶的多肽可具有氨基酸变化。氨基酸变化可为微小性的，即不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列段(poly-histidine tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的示例在以下项的组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域中是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979在The Proteins,Academic Press,New York中所描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu，以及Asp/Gly。

多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的工序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989,Science 244:1081-1085)进行鉴定。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并测试所得突变分子的胞壁质酶活性以鉴定对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton等人，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物相互作用的活性位点也可以通过对如通过例如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术所确定的结构的物理分析结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等人，1992,Science 255:306-312；Smith等人，1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也可以从与有关多肽比对进行推断。

如在WO 2013/076253中所公开的，嗜碱枝顶孢菌CBS114.92胞壁质酶的晶体结构是以

在一个实施方式中，本发明涉及一种改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的方法，所述方法包括向所述动物施用包含一种或多种微生物胞壁质酶的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂，其中：

(a)所述微生物胞壁质酶是包含一个或多个选自由GH24和GH25组成的列表的结构域的微生物胞壁质酶，以300至500mg酶蛋白/kg动物饲料的水平投配；并且

(b)所述动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的方法，所述方法包括向所述动物施用包含一种或多种微生物胞壁质酶的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂，其中：

(a)所述微生物胞壁质酶是从或可从子囊菌门获得的GH24或GH25溶菌酶，并且以300至500mg酶蛋白/kg动物饲料的水平投配；并且

(b)所述动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡。

制剂

本发明的微生物胞壁质酶可配制为用于改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的组合物，所述组合物也是本发明意图覆盖的内容。本发明的微生物胞壁质酶可配制为液体或固体。

对于液体制剂，配制试剂可包括多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(例如氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(例如糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇)。因此，本发明的组合物可为液体组合物，该液体组合物包含本发明的微生物胞壁质酶，以及一种或多种配制试剂，该一种或多种配制试剂选自由以下项组成的列表：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇。液体制剂可以在饲料已经被制粒后喷涂到该饲料上，或者可以添加到给予动物的饮用水中。

对于固体制剂，本发明的组合物可以例如作为颗粒、喷雾干燥的粉末或团聚物。配制试剂可包括盐(有机或无机锌、钠、钾或钙盐，例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)。

例如，固体组合物为粒状形式的。所述颗粒可具有基质结构，组分在所述基质结构中均匀地混合。然而，所述颗粒通常包括核心粒子和一个或多个涂层，该一个或多个涂层通常是盐和/或蜡涂层。蜡的示例为聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物油脂，例如氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化大豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或双甘油酯，例如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；和脂肪酸，例如氢化线性长链脂肪酸及其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。所述核心粒子可为本发明的胞壁质酶任选地与一种或多种附加酶以及任选地与一种或多种盐一起组合的均匀共混物，或者具有本发明的胞壁质酶的惰性粒子任选地与施加到其上的一种或多种附加酶的组合。

在上述颗粒中，核心粒子的材料可选自由以下项组成的组：无机盐(例如例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、糖或糖衍生物(例如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及黏土矿物(也称为水合页硅酸铝)。优选地，所述芯包含粘土矿物，例如高岭石或高岭土。

盐涂层通常为至少1μm厚，并且既可以是一种特定的盐，也可以是盐(例如Na

优选地，本发明的组合物是固体组合物，该固体组合物包含本发明的胞壁质酶，以及一种或多种配制试剂，该一种或多种配制试剂选自由以下项组成的列表：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉和纤维素。更优选地，所述配制试剂选自以下化合物中的一种或多种化合物：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。此外优选地，所述固体组合物为粒状形式的。更进一步优选地，所述固体组合物为粒状形式的，并且包含核心粒、包含本发明的胞壁质酶的酶层以及盐涂层。

优选地，所述配制试剂选自以下化合物中的一种或多种化合物：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。更优选地，所述配制试剂选自以下化合物中的一种或多种化合物：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。

动物饲料和动物饲料添加剂

本发明的微生物胞壁质酶还可配制为用于改善动物的免疫力和/或抗炎能力的动物饲料或动物饲料添加剂，所述动物饲料或动物饲料添加剂也是本发明意图覆盖的内容。

动物饲料组合物或日粮具有相对较高的蛋白质含量。可以如WO 2001/058275的表B的第2列至第3列中所示表征家禽和猪的日粮。可如在该表B的第4列中所示表征鱼日粮。此外，此类鱼日粮的粗脂肪含量通常为200-310g/kg。

根据本发明的动物饲料组合物的粗蛋白含量可介于50g/kg与800g/kg之间，并且还包含如本文所述的一种或多种微生物胞壁质酶。

此外，或者作为替代方案(相对于上述粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物可具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

具体地，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量可在WO 2001/058275的表B中的范围2、3、4或5(范围2-5)中的任一者内。

通过Kjeldahl方法(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis，第14版，Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)测定氮含量，并且粗蛋白计算为氮(N)乘以因子6.25(即粗蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)×6.25)。

可以根据NRC出版物Nutrient requirements in swine，1988年第9次修订版，国家研究委员会农业委员会动物营养分会猪营养小组(subcommittee on swine nutrition,committee on animal nutrition,board of agriculture,national researchcouncil)，National Academy Press,Washington,D.C.，第2-6页和European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs,斯皮尔德霍尔特家禽研究和推广中心(Spelderholt centre for poultry research and extension),7361 DA Beekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,Wageningen.ISBN 90-71463-12-5来计算可代谢能量。

全饲动物日粮中钙、有效磷和氨基酸的日粮含量是根据饲料表计算的，诸如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219 pkLelystad.ISBN 90-72839-13-7。

本发明的动物饲料组合物可含有如上所定义的至少一种植物蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可含有动物蛋白，诸如肉粉和骨粉、羽毛粉和/或鱼粉，通常含量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可包含通常量为0-30％的具有可溶物的干蒸馏酒粕(DDGS)。

优选地，本发明的动物饲料组合物含有0-80％的玉蜀黍；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的豆粕；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉粉和骨粉；和/或0-20％的乳清。

优选地，本发明的动物饲料包含植物蛋白。植物蛋白的蛋白质含量为至少10％(w/w)、20％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)或90％(w/w)。

在本发明中，植物蛋白可源自植物蛋白源，诸如豆类和谷类，例如来自豆科(豆科植物类)、十字花科、藜科和禾本科的材料，诸如大豆粉、羽扇豆粉、菜籽粉，以及它们的组合。

植物蛋白源可以是来自豆科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。植物蛋白源也可以是来自藜科的一种或多种植物(例如甜菜、糖用甜菜、菠菜或藜麦)的材料。植物蛋白来源的其他示例是油菜籽和卷心菜。大豆是优选的植物蛋白源。植物蛋白源的其他示例是谷类，诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻米和高粱。

动物日粮可以例如制成糊状饲料(非粒状)或粒状饲料。通常，将研磨的饲料原料混合，并根据所涉及的种类的规格要求添加足够量的必要维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶制剂添加。例如，对于糊状饲料，可以在成分混合步骤之前或期间添加固体或液体酶制剂。对于粒状饲料，也可以在饲料成分步骤之前或期间添加(液体或固体)胞壁质酶/酶制备物。通常，液体酶制剂包含本发明的微生物胞壁质酶，任选地以及多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且在造粒步骤之后添加，例如通过将液体制剂喷涂到丸粒上。胞壁质酶也可掺入到饲料添加剂或预混物中。

或者，可通过将液态酶溶液与填充剂(例如经研磨的豆粕)的混合物冷冻，然后将该混合物冻干，来制备本发明的微生物胞壁质酶。

在本发明中，动物饲料组合物还可包含一种或多种附加酶、微生物、维生素、矿物质、氨基酸，和/或其他饲料成分。

优选地，该组合物包含：本发明的微生物胞壁质酶中的一种或多种微生物胞壁质酶、一种或多种配制试剂，以及选自由以下项组成的列表的一种或多种组分：一种或多种附加酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分。

本发明的动物饲料组合物中的最终胞壁质酶浓度可在0.01-200mg酶蛋白/kg动物饲料，例如0.1mg酶蛋白/kg动物饲料至150mg酶蛋白/kg动物饲料、0.5mg酶蛋白/kg动物饲料至100mg酶蛋白/kg动物饲料、1mg酶蛋白/kg动物饲料至75mg酶蛋白/kg动物饲料、2mg酶蛋白/kg动物饲料至50mg酶蛋白/kg动物饲料、3mg酶蛋白/kg动物饲料至25mg酶蛋白/kg动物饲料、2mg酶蛋白/kg动物饲料至80mg酶蛋白/kg动物饲料、5mg酶蛋白/kg动物饲料至60mg酶蛋白/kg动物饲料、8mg酶蛋白/kg动物饲料至40mg酶蛋白/kg动物饲料、或10mg酶蛋白/kg动物饲料至30mg酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合的范围内。

目前设想的是将微生物胞壁质酶以以下量(剂量范围)中的一种或多种量施用：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；5-50；10-100；0.05-50；5-25；或0.10-10—所有这些范围都是以mg胞壁质酶/kg饲料(ppm)计的。

为了测定每kg饲料中的胞壁质酶蛋白的mg量，将胞壁质酶从饲料组合物中纯化出，并使用相关测定测定纯化的胞壁质酶的比活性(参见胞壁质酶活性)。还照此使用相同的测定测定了饲料组合物的胞壁质酶活性，并且基于这两种测定结果计算了以mg胞壁质酶蛋白/kg饲料计的剂量。

本发明的动物饲料添加剂旨在以0.01％至10.0％；更具体地0.05％至5.0％；或0.2％至1.0％(％意味着每100g饲料的添加剂的g数)的水平包含(或规定为必须被包含)在动物日粮或饲料中。这对于预混物来说尤其如此。

同样的原理适用于测定饲料添加剂中的胞壁质酶蛋白的mg数。当然，如果可获得用于制备饲料添加剂或饲料的胞壁质酶的样品，则从该样品测定比活性(不需要从饲料组合物或添加剂中纯化出胞壁质酶)。

附加酶

在本发明中，本文所述的组合物或动物饲料或动物饲料添加剂任选地包含一种或多种酶。可以基于来自NC-IUBMB，1992的酶命名法手册(handbook Enzyme Nomenclature)对酶进行分类，另请参见Internet上http://www.expasy.ch/enzyme/处的ENZYME网站。ENZYME是与酶命名法有关的信息库。其主要基于国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology,IUB-MB)，Academic Press,Inc.,1992的建议，并且其描述已经提供了EC(酶委员会)编号的每种类型的表征酶(Bairoch A.，ENZYME数据库，2000，Nucleic AcidsRes 28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于其底物特异性，有时是基于其分子机理；此类分类未反映这些酶的结构特征。

在Henrissat等人，“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)，2013”,Nucl.Acids Res.(2014年1月1日)42(D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、胞壁质酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见www.cazy.org。

因此，本发明的组合物或动物饲料或动物饲料添加剂还可包含至少一种选自由以下项组成的组的其他酶：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，诸如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或它们的任何组合。

可商购获得的植酸酶的示例包括Bio-Feed

可商购获得的木聚糖酶的示例包括

可商购获得的蛋白酶的示例包括

微生物

在本发明中，该组合物或动物饲料或动物饲料添加剂还可包含一种或多种附加微生物。例如，该组合物或动物饲料还包含来自以下属中的一种或多种属的细菌：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)和巨型球菌属(Megasphaera)，或它们的任何组合。

优选地，本发明的组合物或动物饲料或动物饲料添加剂还包含来自以下菌株中的一种或多种菌株的细菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肠球菌属(Enterococcus spp)、和片球菌属(Pediococcus spp)、乳杆菌属(Lactobacillus spp)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalisssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸杆菌属(Propionibacteria sp)。

更优选地，本发明的组合物或动物饲料或动物饲料添加剂还包含来自以下枯草芽孢杆菌菌株中的一种或多种菌株的细菌：3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-501 05)、BS 18(NRRL B-50633)、BS 278(NRRL B-50634)、DSM 29870、DSM 29871、NRRL B-50136、NRRL B-50605、NRRL B-50606、NRRL B-50622和PTA-7547。

更优选地，本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂还包含来自以下短小芽孢杆菌菌株中的一种或多种菌株的细菌：NRRL B-50016、ATCC 700385、NRRL B-50885或NRRL B-50886。

更优选地，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料还包含来自以下地衣芽孢杆菌菌株中的一种或多种菌株的细菌：NRRL B 50015、NRRL B-50621或NRRL B-50623。

更优选地，本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂还包含来自以下解淀粉芽孢杆菌菌株中的一种或多种菌株的细菌：DSM 29869、DSM 29872、NRRL B 50607、PTA-7543、PTA-7549、NRRL B-50349、NRRL B-50606、NRRL B-50013、NRRL B-50151、NRRL B-50141、NRRL B-50147或NRRL B-50888。

本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂中的细菌菌株中的每种细菌菌株的细菌计数介于1×10

本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂中的细菌菌株中的每种细菌菌株的细菌计数介于1×10

在本发明中，一种或多种细菌菌株可以以稳定孢子的形式存在。

预混物

在本发明中，组合物、动物饲料或动物饲料添加剂可包含预混物，该预混物包含例如维生素、矿物质、酶、氨基酸、防腐剂、抗生素、其他饲料成分或它们的任何组合，这些物质被混合到动物饲料中。

氨基酸

本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂还可包含一种或多种氨基酸。所述氨基酸的示例包括但不限于赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

维生素和矿物质

本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂可包含一种或多种维生素，例如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。任选地，本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂可包含一种或多种矿物质，例如一种或多种微量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。

通常脂溶性维生素和水溶性维生素以及微量矿物质形成了旨在添加到饲料中的所谓预混物的一部分，而常量矿物质通常单独添加到饲料中。

脂溶性维生素的非限制性示例包括维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的非限制性示例包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

微量矿物质的非限制性示例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒和锌。

常量矿物质的非限制性示例包括钙、镁、钾和钠。

这些组分(以家禽和仔猪/猪例示)的营养需求列于WO2001/058275的表A中。营养需求意味着应在日粮中以指定的浓度提供这些组分。

或者，本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂包含WO01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种组分。至少一种是指以下中的一种或多种：一种或两种、三种、或四种等等直至全部十三种，或直至全部十五种单独组分。更具体地，该至少一种单独组分以特定量包含在本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂中，以提供在表A的第四列、第五列或第六列所示范围内的饲料内浓度。

优选地，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种维生素，以提供在下表1中规定的范围内的饲料内浓度(分别用于仔猪和肉鸡日粮)。

其他饲料成分

本发明的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂还可包含着色剂、稳定剂、促生长添加剂和芳香化合物/调味剂、多不饱和脂肪酸(PUFA)；产活性氧的物质、抗微生物肽和抗真菌多肽。

着色剂的示例是类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素。

稳定剂(例如酸化剂)的示例是有机酸。这些有机酸的示例是苯甲酸(

芳香化合物/调味剂的示例是甲酚、茴香脑、十内酯、十一内酯和/或十二内酯、紫罗酮、鸢尾酮、姜醇、哌啶、亚丙基苯并呋喃酮(propylidene phatalide)、亚丁基苯并呋喃酮、辣椒素和单宁。

多不饱和脂肪酸的示例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸和γ-亚油酸。

产活性氧的物质的示例是化学物质，例如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；以及酶，例如氧化酶、加氧酶或合成酶。

抗微生物肽(AMP's)的示例是CAP18、林可霉素A、三丁酸甘油酯，Protegrin-1、Thanatin、防御素、乳铁蛋白、乳铁素和Ovispirin(例如Novispirin)(Robert Lehrer,2000)、菌丝霉素和他汀类，包括WO 03/044049和WO 03/048148中所公开的化合物和多肽，以及上述的保留抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP's)的示例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)肽和黑曲霉(Aspergillus niger)肽，以及它们的保留抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/090384中所公开的。

微生物溶菌酶的用途

在另一方面中，本发明涉及组合物、动物饲料或动物饲料添加剂用于改善单胃动物的免疫力和/或抗炎能力的用途，其中所述组合物、所述动物饲料或所述动物饲料添加剂包含一种或多种微生物胞壁质酶。

在本发明中，微生物胞壁质酶可以100mg酶蛋白/kg动物饲料至1000mg酶蛋白/kg动物饲料，例如200mg酶蛋白/kg动物饲料至900mg酶蛋白/kg动物饲料、300mg酶蛋白/kg动物饲料至800mg酶蛋白/kg动物饲料、400mg酶蛋白/kg动物饲料至700mg酶蛋白/kg动物饲料、500mg酶蛋白/kg动物饲料至600mg酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合的水平投配。

在本发明中，所述单胃动物可选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、家禽、火鸡、鸭子、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡、猫、狗、马、甲壳类动物、基围虾、对虾、鱼类、青甘鱼、巨滑舌鱼、鲃鱼、鲈鱼、扁鲹、鲮脂鲤科、鳊鱼、大头鱼、大盖巨脂鲤、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉魮、虱目鱼、红点鲑、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、莓鲈、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、花身副丽鱼、大比目鱼、爪哇鱼、野鲮属、濑鱼、泥鳅、鲭鱼、遮目鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕克鱼、绿腹丽鱼、银汉鱼、河鲈鱼、梭子鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、长丝异鳃鲶、大眼鰤鲈、海鲈鱼、海鲷、闪光鱼、鲈塘鳢、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、鳎、蓝子鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼、丁鲷、皇冠鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、大菱鲆、白鳟鱼、玻璃梭鲈、和白鲑鱼。优选地，所述单胃动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、家禽、火鸡、鸭子、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、雏鸡、肉鸡、蛋鸡、小母鸡和小鸡。更优选地，所述单胃动物选自由以下项组成的组：生猪、仔猪、生长猪、母猪、雏鸡、肉鸡、蛋鸡和小鸡。

在本发明中，可以从出生直到屠宰将微生物胞壁质酶饲喂给动物。优选地，从出生直到屠宰每天将微生物胞壁质酶饲喂给动物。更优选地，在动物的寿命期间每天将微生物胞壁质酶饲喂给该动物达至少10天，例如至少15天或至少20天(其中这些天可为连续或不连续的)。在一个实施方式中，将微生物胞壁质酶饲喂给动物10-20天，之后是5-10天的非治疗期，并且将该循环在该动物的寿命期间重复。

在本发明中，可在孵化后的前49天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。优选地，在孵化后的前36天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。更优选地，在孵化后的第22天至第36天将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏前(pre-starter)期(第1-7天)期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏(第8-22天)期期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。此外优选地，在育雏前(第1-7天)期和育雏(第8-22天)期期间将微生物胞壁质酶饲喂给肉鸡。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。优选地，在从孵化开始的76周期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。更优选地，在产蛋期期间(从约第18周开始)将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡。此外优选地，在产蛋期期间将微生物胞壁质酶饲喂给蛋鸡，但在强制换羽期期间不饲喂所述酶。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。优选地，在从孵化开始的24周期间将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。更优选地，在从孵化开始的前16周(对于雌火鸡来说)或从孵化开始的前20周(对于雄火鸡来说)期间将微生物胞壁质酶饲喂给火鸡。

在本发明中，可在动物的寿命期间将微生物胞壁质酶饲喂给生猪。优选地，在从出生开始的27周期间将微生物胞壁质酶饲喂给生猪。更优选的是，从出生到断奶(在4周时)将微生物胞壁质酶饲喂给仔猪。此外优选地，在从出生开始的前6周(4周的哺乳期和断奶后2周)期间将微生物胞壁质酶饲喂给仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶前期(pre-starter)(断奶后的第1-14天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶期(starter)(断奶后第15-42天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在断奶前期(断奶后第1-14天)和断奶期(断奶后第15-42天)期间饲喂给断奶仔猪。此外优选地，将微生物胞壁质酶在猪的生长/育肥期(出生后第10周至约第27周)饲喂给生猪。

在本发明中，微生物胞壁质酶可为真菌来源的。优选地，微生物胞壁质酶是从或可从子囊菌门，例如盘菌亚门获得。优选地，所述微生物胞壁质酶包含一个或多个选自由GH24和GH25组成的列表的结构域。

实施例

菌株

囊状长毛盘菌CBS804.70购自Centraalbureau voor Schimmelcultures(Utrecht,the Netherlands)。根据Central Bureau vor Schnimmelkulture，囊状长毛盘菌CBS804.70是在1968年5月从英国斯塔福德郡的煤矸石表土中分离出的。

根据Central Bureau vor Schnimmelkulture，嗜碱枝顶孢菌CBS 114.92是由A.Yoneda在1984年从日本津久井湖附近的猪粪堆肥的污泥中分离出的。

培养基和溶液

YP+2％葡萄糖培养基由1％的酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的葡萄糖构成。

YP+2％麦芽糖糊精培养基由1％的酵母提取物、2％的蛋白胨和2％的麦芽糖糊精构成。

PDA琼脂平板由马铃薯浸出液(马铃薯浸出液是通过将300g切片的(洗净但未去皮)的马铃薯在水中煮30分钟，然后经由粗棉布(cheesecloth)倾析或过滤)制成的)构成。然后添加蒸馏水直到悬浮液的总体积为1升，之后添加20克的右旋糖和20g的琼脂粉。将培养基在15psi下高压灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual，第8版，A修订版，1998)。

LB平板由10g的Bacto-Tryptone、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的Bacto-agar和补足至1升的去离子水构成。

LB培养基由10g的Bacto-Tryptone、5g的酵母提取物、10g的氯化钠和补足至1升的去离子水构成。

COVE蔗糖平板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液和补足至1升的去离子水构成。将培养基在15psi下高压灭菌15分钟(Bacteriological Analytical Manual，第8版，A修订版，1998)。将培养基冷却至60℃，并添加10mM乙酰胺、15mM CsCl、

COVE盐溶液由26g MgSO4·7H2O、26g KCL、26g KH2PO4、50ml COVE微量金属溶液和补足至1升的去离子水构成。

COVE微量金属溶液由0.04g Na2B4O7·10H2O、0.4g CuSO4·5H2O、1.2g FeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO4·2H2O、10g ZnSO4·7H2O和补足至1升的去离子水构成。

实施例1：来自嗜碱枝顶孢菌CBS 114.92的GH25胞壁质酶的克隆、表达和纯化

将来自嗜碱枝顶孢菌CBS 114.92的GH25胞壁质酶(SEQ ID NO:1)如在WO 2013/076253的实施例8中所述进行克隆和表达，并如在WO 2013/076253的实施例5中所述进行纯化。或者，可将SEQ ID NO:10如在WO 2013/076253的实施例2中所述进行克隆和表达。

实施例2：来自囊状长毛盘菌的GH24胞壁质酶的表达

将该真菌菌株在1000ml锥形摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中在20℃下培养5天。通过将培养基滤过衬有

由Illumina MySeq公司(Illumina Inc.,San Diego,CA)生成基因组序列信息。根据制造商的使用说明，用5μg的分离出的囊状长毛盘菌基因组DNA进行文库制备和分析。采用100bp的配对末端策略以及200-500bp的文库插入大小。使用HiSeq运行的一半来获得总共95,744,298，100bp的原始读段。随后将所述读段分割为25％，之后进行剪切(提取Phred得分为10分或更高的最长子序列)。使用Idba版本0.19装配这些读段。将短于400bp的重叠群丢弃，从而产生具有10,035的N-50的8,954,791,030bp。使用GeneMark.hmm ES版本2.3c对基因进行调用，并使用由Pfam提供的“噬菌体胞壁质酶PF00959”进行催化结构域的鉴定。如下所述，通过使用引物F-80470和R-80470(分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)的PCR，从囊状长毛盘菌CBS804.70基因组DNA克隆出整个编码区的多肽编码序列。

5'-ACACAACTGG

5'-CTAGATCTCGAG

粗体字表示囊状长毛盘菌的酶编码序列。限制性位点是带下划线的。限制性位点左侧的序列与pDau109的插入位点同源(WO 2005/042735)。

使用2倍浓度的Extensor HIFI PCR混合物(Thermo Scientific产品目录号AB-0795)进行实验。

根据制造商的使用说明(Thermo Scientific产品目录号AB-0795)，使用以下最终浓度执行扩增反应(25μl)：

PCR混合物：

0.5μm的引物F-80470

0.5μm的引物R-80470

12.5μl的Extensor HIFI PCR混合物，2倍浓度

11.0μl的H2O

10ng的囊状长毛盘菌CBS804.70基因组DNA。

将PCR反应在

通使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mMEDTA二钠(TAE)缓冲液进行1％琼脂糖凝胶电泳来分析3μl的PCR反应。观察到了约946bp的主条带。剩余的PCR反应直接根据制造商的说明用ILLUSTRA

将2μg的质粒pDau109用Bam HI和Hind III进行酶切消化，将经酶切消化的质粒在使用50mM Tris碱-50mM硼酸-1mMEDTA二钠(TBE)缓冲液的1％琼脂糖凝胶上跑样，以便从受限质粒中去除填充片段。通过添加

使用下面描述的pDau109载体引物，通过克隆PCR选择几个菌落用于进行分析。用黄色接种针(Nunc A/S,Denmark)将四个菌落从每ml补充有50μg氨苄青霉素的LB平板转移到新的每ml补充有50μg氨苄青霉素的LB平板，并在37℃下孵育过夜。

引物8653：5'-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3'(SEQ ID NO:8)

引物8654：5'-CATATAACCAATTGCCCTC-3'(SEQ ID NO:9)

将三个菌落中的每个菌落直接转移到200μl PCR试管中，所述PCR试管由5μl的2XExtensor HIFI PCR混合物(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)、0.5μl的引物8653(10pm/μl)、0.5μl的引物8654(10pm/μl)和4μl的去离子水构成。将每个菌落PCR在

将3μl的每个完成的PCR反应提交到使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。所有四个大肠杆菌转化体均显示出约980bp的PCR条带。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN GMBH,Hilden Germany)从四个菌落中的每个菌落中分离出质粒DNA。使用采用3.1版BIG-DYE

使含有pKKSC0312-2的大肠杆菌3701根据制造商的使用说明(Genomed)生长过夜，并使用质粒Midi Kit(Genomed JETquick试剂盒，产品目录号400250,GENOMED GmbH,Germany)根据制造商的使用说明分离pKKSC0312-2的质粒DNA。将经纯化的质粒DNA转化到米曲菌MT3568中。根据Christensen等人，1988,Bio/Technology 6:1419-1422的方法制备米曲霉MT3568原生质体。选择平板由具有+10mM乙酰胺+15mM

然后通过根据制造商的建议使用

实施例3：来自囊状长毛盘菌的GH24胞壁质酶的纯化

将来自实施例2的具有GH24胞壁质酶的发酵上清液滤过具有0.22μm截止限的快速PES瓶盖过滤器。将所得溶液用5mM的乙酸钠，pH 4.5进行渗滤，并在具有10kDa截止膜的超滤装置(Sartorius)上浓缩(体积减少了10倍)。

在预处理后，将约275mL的含胞壁质酶的溶液通过以下方式进行纯化：在XK26柱中的SP琼脂糖凝胶(约60mL)上进行层析，用0％至100％梯度的缓冲液A(50mM乙酸钠，pH 4.5)和缓冲液B(50mM乙酸钠+1M NaCl，pH 4.5)在10个柱体积上洗脱结合的胞壁质酶。基于色谱图(280nm和254nm处的吸收)和SDS-PAGE分析，将来自柱的级分进行合并。

如从SDS-PAGE所估计的，分子量为约27kDa并且纯度>90％。

实施例4：来自囊状长毛盘菌的GH24胞壁质酶的其他特性

N末端序列的测定如下：YPVKTDL。

来自该成熟序列的计算分子量为26205.5Da(M+H)

通过完整分子量分析测定的分子量为26205.3Da。(M+H)

成熟序列(来自EDMAN N末端测序数据、完整分子量分析和蛋白质组学分析)：

YPVKTDLHCRSSPSTSASIVRTYSSGTEVQIQCQTTGTSVQGSNVWDKTQHGCYVADYYVKTGHSGIFTTKCGSSSGGGSCKPPPINAATVALIKEFEGFVPKPAPDPIGLPTVGYGHLCKTKGCKEVPYSFPLTQETATKLLQSDIKTFTSCVSNYVKDSVKLNDNQYGALASWAFNVGCGNVQTSSLIKRLNAGENPNTVAAQELPKWKYAGGKVMPGLVRRRNAEVALFKKPSSVQAHPPKC(SEQ ID NO:4)。

实施例5：胞壁质酶活性的测定

胞壁质酶活性是通过测量在540nm处在分光光度计中测量的重悬的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)ATTC编号4698(Sigma-Aldrich M3770)或不死微小杆菌(Exiguobacterium undea)(DSM14481)溶液的吸光度/光密度的降低(下降)而测定的。

在使用前，将细胞在柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5中重新悬浮至浓度为0.5mg细胞/mL，并测量540nm处的光密度(OD)。然后调整细胞悬液，使细胞浓度等同于OD540＝1.0。然后将经调整的细胞悬液在使用前冷藏。重悬的细胞在4小时内使用。

使不死微小杆菌的培养物(DSM14481)在500mL摇瓶中的100mL LB培养基(Fluka51208，25g/L)中在30℃、250rpm下生长过夜。然后将过夜培养物在20℃和5000g下离心10分钟，并将沉淀用无菌milliQ水洗涤两次，并在Milli-Q水中重悬。将经洗涤的细胞在13000rpm下离心1分钟，并将尽可能多的上清液倾析出。将经洗涤的细胞在真空离心机中干燥1小时。将细胞团块在柠檬酸-磷酸盐缓冲液pH 4、pH 5或pH 6中重悬，使得540nm处的光密度＝1。

将待测量的胞壁质酶样品在柠檬酸-磷酸盐缓冲液pH 4、pH 5或pH 6中稀释至100-200mg酶蛋白/L的浓度，并且在冰上保存直至使用。在96孔微量滴定板(Nunc)中，将200μL的底物添加到每个孔中，并将平板在VERSAmax酶标仪(Molecular Devices)中在37℃下孵育5分钟。在培养后，在540nm处测量每个孔的吸光度(开始值)。为了开始活性测量，将20μL稀释的胞壁质酶样品添加到每种底物(200μL)中，并在37℃下开始对540nm处的吸光度的动力学测量达最少30分钟至24小时。监测每个孔的所测量的在540nm处的吸光度，并且如果胞壁质酶具有胞壁质酶活性，则随着时间推移看到吸光度下降。结果呈现在下表2中。

数据证明，来自原鸡的GH22胞壁质酶、来自囊状长毛盘菌的GH24胞壁质酶和来自嗜碱枝顶孢菌的GH25胞壁质酶均具有胞壁质酶活性。

实施例6：肉鸡体内试验

该实验在巴塞罗那自治大学(Universitat Autònoma de Barcelona,UAB)的实验营地(Servei de Granges i Camps Experimentals)执行。

将动物在具有16个地面鸡圈的单个房间(在房间的每一侧处有8个鸡圈(1.5m×1m))中笼养。根据Ross肉鸡管理指南控制环境条件(温度、相对湿度和通风率)。动物设置有乳头式饮水器(3只饮水器/鸡圈)和手动盘式喂食器(1只盘/鸡圈)。

使用408只1日龄的肉用小公鸡(Ross 308)(30只/鸡圈)。它们从当地孵化场获得，称重，单独进行翅膀标记，并分配为完全随机设计的日粮处理。动物在卵内接种针对传染性法氏囊(Gumboro)和马立克氏病(Marek)并且还针对球虫病(Hypracox，在1天时粗喷)和支气管炎(细喷)的疫苗。

每个鸡圈被分配到两种实验处理中的一种实验处理：对照日粮(T1)或包含胞壁质酶的相同日粮(T2)。

基础实验粮被配制为满足或超过Ross肉鸡的推荐营养要求。各成分、矿物质-维生素预混物、日粮的计算和实际分析如表3所示。基础日粮不含任何酶或饲料添加剂(除了胞壁质酶以外)、抗球虫药、兽用抗生素或任何其他生长促进剂。所有日粮都包含60mg/kg的加丽素黄(Carophyll Yellow)类胡萝卜素(10％)。

将动物随机分配到两种实验处理中，该两种实验处理由补充有35,000LSU(F)/kg饲料的胞壁质酶(534mg胞壁质酶/kg饲料)或不补充胞壁质酶的均衡日粮组成。在实验时段期间，动物接受两种日粮(第0-21天的育雏期和第21-35天的生长期)，育雏期日粮是磨碎形式并且生长期日粮是丸粒形式。所有的日粮都包含二氧化钛(0.5％)作为消化性指标。

家禽在到达当天都单独进行翅膀标记。在第0天、第9天(第一次处死)、第21天(日粮改变)和第36天(最后一天-第二次处死)记录动物的个体重量和饲料残留(按照鸡圈)。

在第9天，将每笼21只家禽(随机选择的)处死，并将剩余9只在实验结束时(第五周)处死(在这两天都通过断头进行处死)。在每个屠宰日，从每个笼子取样出一只家禽以用于基因表达(免疫力)和组织形态学分析，从每个笼子取样出另一只家禽以用于传统微生物学分析。从每个笼子中单独取样出其他三只动物以用于分子微生物学分析，并刮取分泌性免疫球蛋白(Ig)A。对这三只家禽和剩余动物(第一次屠宰总共19只动物，最后一次屠宰共7只动物)进行取样以用于回肠消化率分析，合并每个鸡圈的所有回肠消化物样品。

此外，在第36天，还对每组中的三只动物(指定的或进行粘膜刮取的那些)进行抽血以用于血清Ig滴定。

传统微生物学

通过选择性生长培养基执行肠杆菌(enterobacteria)、乳酸杆菌(lactobacilli)和梭状芽胞杆菌(clostridia)的计数。所分析的切片包括(随机选择的)每笼一只动物的嗉囊(crop)、回肠和盲肠内容物。在MacKONKEY琼脂中培养24-48h后进行肠杆菌计数，在MRS琼脂中测定乳酸菌，并在针对该种属的选择性琼脂中测定梭菌属。

组织形态学

取来自空肠的组织样品，并对其进行分析以用于组织形态学研究。所分析的参数包括：上皮内淋巴细胞(IEL)(每绒毛的细胞和细胞/100μm)和杯状细胞(每绒毛的细胞和细胞/100μm)。

先天性免疫应答-基因表达

将来自空肠(来自每个笼子的中等重量的家禽)的小组织样品(0.5cm的立方体)用

将来自空肠的RNA纯化并翻译成cDNA以用于使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen,Germany)和QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen,Germany)进行基因表达研究。使用商购可得的Taqman基因表达测定(Applied Biosystems,USA)执行qPCR反应。本研究中包括的引物和探针是LPS诱导的TNF-α因子(LITAF)、白细胞介素-10(IL10)和toll样受体5(TLR5)。LITAF被认为是促炎细胞因子；IL-10被认为是抗炎细胞因子；并且TLR-5识别细菌鞭毛蛋白。先天免疫相关基因的平均周期阈值(Ct)被归一化为持家基因(ACTβ)，并借助于2-ΔΔCT方法与对照动物进行比较。按照Schmittgen和Livak(2008)，结果也被表示为单独的数据点。

适应性免疫应答-传染性法氏囊滴度

通过在第36天测量针对传染性法氏囊(传染性粘液囊炎病病毒，IBDV)的抗体滴度，以及在第9天和第36天测量粘膜s-IgA的产量，检查日粮处理对体液免疫应答的影响。

通过使用商业ELISA试剂盒(IDEXX Europe B.V,2132 PV Hoofddorp,TheNetherlands)在血清样品中测定针对IBDV的抗体滴度。按照制造商的使用说明，当滴度值高于396时，动物被认为对疫苗接种呈阳性。动物已经在卵内接种了针对传染性法氏囊的疫苗。

除非另有说明，否则结果表示为平均值及其标准误差。考虑实验日粮作为主要影响因子，用ANOVA，使用GLM程序对数据进行分析。当分析频率时，使用费希尔精确检验(Fisher's exact test)。所有的统计分析都是使用统计分析软件SAS 9.2版执行的。用于确定所有分析的显著性的α水平为P＝0.05。还针对P值>0.05和<0.10考虑了统计趋势。

肠架构

空肠样品的组织形态学如表4所示。

在第36天，在上皮内淋巴细胞(IEL)和杯状细胞(GC)中检测到了胞壁质酶的显著增加，无论它们是以绝对方式还是相对方式表达的。

在IEL中观察到的增加在生理水平范围内，并且可反映动物免疫应答的增加，而不意味着炎症。IEL被认为是肠道相关联的淋巴组织的一部分，并且提供了抵御肠道微生物入侵的第一道防线。这些位于上皮层内的前线淋巴细胞在它们的功能和表型方面是难以置信地异源的。IEL亚群可在上皮屏障处提供免疫监视，以通过先天样机制或作为抗原特异性效应物或记忆CD8αβ+ T细胞来预防或削弱肠道中的感染。

类似地，杯状细胞通过合成和分泌被称为粘蛋白的高分子量糖蛋白来产生和维持保护性粘液毯，从而有助于保护肠上皮。杯状细胞功能和肠粘液化学组成的变化已被描述为响应于广泛的腔损伤，包括正常微生物菌群的改变。可得数据表明，肠道微生物可通过生物活性因子的局部释放直接地或通过宿主免疫细胞的激活间接地影响杯状细胞动力学和粘液层(Deplancke和Gaskins，2001)。因此，由胞壁质酶在肠道生态系统或生物活性因子释放中促进的变化可能是观察到的效应背后的原因。

微生物群分析

表5显示了所分析的梭菌属群的平板计数(log cfu/gr FM)。对于梭菌属，在饲喂胞壁质酶的动物中在第9天发现了在盲肠中减少的趋势。

一些动物中的梭菌属平板计数低于该方法的最低检测水平。因为在用胞壁质酶处理时看到了较高数量的动物低于所述检测水平，所以还对值进行了如表6所示的频率分析。以这种方式，还可理解，胞壁质酶减少了在第9天在盲肠中具有可检测到的梭菌属的动物的数量。

空肠中的细胞因子和TLR基因表达

表7显示了与对照组相比，胞壁质酶组中不同研究基因(LITAF、IL-10和TLR5)的表达变化。观察到了LITAF、IL-10和TLR5的较高表达。

1)高于1的值表示BOND组中的表达增加，相反，低于1的值表示表达减少。

传染性法氏囊抗体

表8显示了在第36天，胞壁质酶如何降低针对传染性法氏囊疫苗接种的体液应答。

本试验中的动物在卵内接种了免疫复合物传染性法氏囊疫苗。这种疫苗的作用与幼鸡体内的IBDV母系源性抗体(MDA)水平相关，即在孵化时具有较高的IBDV MDA水平的雏鸡比在孵化时具有低IBDV MDA的雏鸡具有更晚的对疫苗的免疫应答。胞壁质酶组中对疫苗的较低应答可解释为在该特殊组中孵化时较高的IBDV MDA水平。

在研究中获得的结果表明，包含胞壁质酶可有效增加IEL和GC、减少梭菌属、增加细胞因子LITAF、IL-10和TLR5的表达，并降低肉鸡对传染性法氏囊疫苗接种的体液免疫应答。因此，胞壁质酶具有提高肉鸡的免疫力和抗炎能力并降低肉鸡的肠道产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)的效应。