生产维生素C的重组酿酒酵母菌株、构建方法及发酵方法

技术领域

本发明涉及酿酒酵母菌株发酵生产维生素C领域，特别涉及生产维生素C的酿酵母菌株、构建方法及发酵方法。

背景技术

维生素C(VC)是与人类密切相关的水溶性维生素。自从发现VC以来的80多年以来，人们不断深度挖掘其生理活性和生物学功能。由于VC具有很强的还原能力，它是一种重要的抗氧化剂，自由基清除剂，同时也是预防败血症的营养物质之一。到19世纪50年代，VC被认为具有抗癌作用，它可以参与氧化还原反应以影响癌细胞的生长甚至杀死癌细胞。最近，西湖大学常兴团队发现VC通过激活DNA脱甲基酶TET来增强浆液产生来促进浆细胞差异。多个意大利研究团队发现高剂量注射可增强抗体的效力，减缓甚至阻止癌症的生长。此外，VC还可以通过调节血液中造血干细胞的数量和功能以及减轻患者的疼痛来作为白血病的治疗药物，其原理目前普遍认为是VC是合成具有镇痛作用的物质(如神经递质)的辅助因子。

如今，VC的工业生产主要依靠经典的两步发酵方法(CTFR)将D-山梨醇转化为2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG，VC的直接前体)。之后，研究学者通过改善发酵过程和改造微生物的策略优化CTFR：例如外源添加辅因子或特定的复杂营养素，辅助伴生菌的改造，生产菌代谢路径的优化以及新混菌体系的设计等。此外，多年来，研究学者一直致力于探索一步发酵生产VC的方法。将CFTR相关的脱氢酶引入某种微生物似乎是一步发酵生产2-KLG的最直接方法。此外，由D-葡萄糖或D-山梨糖醇直接生物合成VC是一种切实可行的方法。尽管大多数微藻具有完整的合成VC的途径，但其培养成本却比微生物高得多，这极大地限制了其在工业上应用。酵母可以合成D-异抗坏血酸(D-EAA)，该物质与VC的结构和功能非常相似。酵母合成D-EAA的转化过程与植物合成VC相比，后两个步骤的分子构型变化非常相似。之后经过不断的探索，研究人员逐渐发现酵母中所缺少的植物合成VC路径酶，将其所缺少的植物的VC合成途径转移至乳酸克鲁维酵母。但是其遗传操作的成熟度和应用的广度不如酿酒酵母。Martani等人将该途径引入酿酒酵母中，使其能够以0.2mg/L的产量合成VC。作为一种模式真核生物，酿酒酵母细胞的遗传和生长特性已被研究透彻，并被广泛应用于表达外源基因，从而进行大规模工业生产。所以，以酿酒酵母为底盘细胞从葡萄糖合成VC是一种具有很大发展空间的方法。

此外，能够合成VC的酵母改善了其抗氧化剂性能，并提高了其对低pH和弱有机酸的耐受性，并且VC对癌症的积极治疗作用与其对ROS的影响有关。能够直接合成VC的重组酵母可以成为研究真核生物中ROS的发生和保护的细胞模型。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了生产维生素C的酿酵母菌株、构建方法及发酵方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了gme、vtc2、vtc4、galdh或gldh在合成维生素C中的应用。

本发明还提供了vtc2和/或gldh作为限速步骤相关基因在合成维生素C中的应用。

在上述研究基础上，本发明还提供了galdh和gldh融合过表达、gldh过表达或vtc2过表达在合成维生素C中的应用。

本发明还提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组工程菌株，转化有gme、vtc2、vtc4、galdh或gldh中的一种或两者以上的组合。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组工程菌株中galdh和gldh融合过表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组工程菌株中gldh过表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组工程菌株中vtc2过表达。

此外，本发明还提供了所述重组工程菌株在合成维生素C中的应用。

本发明还提供了维生素C的合成方法，基于所述重组工程菌株，添加外源物质，发酵制得。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外源物质包括GSH、L-半乳糖或L-半乳糖-1,4-内酯中的一种或两者以上的组合。

本发明公开了一种生产VC的重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)，其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VTC2-M及其发酵方法。本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有技术更为环保，为VC的生产提供了一种绿色高效的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组酿酒酵母合成VC路径图；未加粗字体表示酿酒酵母内源基因，加粗字体代表拟南芥外源基因；涉及以下酶：HK(己糖激酶)，PGI(6-磷酸葡萄糖异构酶)，PMI(6-磷酸甘露糖异构酶)，PMM(磷酸甘露糖突变酶)，GMP(GDP-甘露糖焦磷酸化酶)，GME(GDP-甘露糖-3,5-epimerase)，GGP(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)，GPP(L-半乳糖1-磷酸磷酸酶)，ARA(D-阿拉伯糖脱氢酶)，ALO(D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶)，L-GalDH(L-半乳糖脱氢酶)，L-GLDH(L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶)；

图2示VC生产菌株构建示意图；

图3示VC生产菌株VC合成相关基因转录水平图；

图4示利用蛋白融合过表达菌株构建示意图；

图5示潜在限速步骤相关基因过表达菌株构建示意图；

图6示VC生产菌株以及优化代谢路径菌株摇瓶发酵产量图；

图7示高产菌株添加外源中间代谢产物和谷胱甘肽下摇瓶发酵产量图；无外源添加(圆形)，外源添加L-半乳糖(方形)，外源添加L-半乳糖-1,4-内酯(菱形)，外源添加GSH(三角形)。

具体实施方式

本发明公开了生产维生素C的酿酵母菌株、构建方法及发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的是提供一种从葡萄糖直接合成VC的重组酿酒酵母菌株的构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种酿酒酵母生产VC的发酵方法。

本发明的技术方案概述如下：

提供了一株从葡萄糖直接合成VC的重组酿酒酵母菌株的构建及发酵方法，包括如下步骤：(1)以酿酒酵母菌株BY4741为底盘，构建VC生产菌株，然后选取5种拟南芥来源的还原酶，相应的5个编码还原酶基因经酿酒酵母密码子优化后，克隆于单拷贝质粒pRS416上，转化到底盘细胞中，通过摇瓶发酵确定基因能够异源表达，获得VC合成酿酒酵母菌株，并通过实时荧光定量PCR技术(qPCR)，分析路径中基因转录水平，确定可能的限速酶；(2)优化代谢路径提高VC产量。(3)外源添加中间代谢产物和谷胱甘肽(GSH)，提高VC产出。

本发明提供的一株过表达基因vtc2的生物合成VC的酿酒酵母菌株，其命名为VTC2-M。

我们所用的酿酒酵母菌株名称为BY4741，但酿酒酵母不止这一种，除了BY系列以外，还有CEN.PK系列等；此外，也不限于仅保护在酿酒酵母中的应用，其他酵母(如解脂属酵母、克鲁维属酵母等)、藻类、霉菌(链霉菌等)和细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)中的应用也可保护。

本发明的优点：

本发明提供了一种利用重组酿酒酵母菌株合成VC的方法，并探究了植物合成VC路径在酿酒酵母中的限速步骤和限速酶，优化了胞内VC提取和HPLC检测方法，为实现VC一步发酵生产做出贡献。

本发明提供的生产维生素C的酿酵母菌株、构建方法及发酵方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 VC生产菌株的构建

1、编码外源基因元件的构建

本发明提供5种编码拟南芥来源的VC合成路径相关酶的基因，分别是编码GDP-甘露糖3,5-磷酸酶(GME)的基因，编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP)的基因，编码L-半乳糖1-磷酸磷酸酶(GPP)的基因，编码L-半乳糖脱氢酶(L-GalDH)的基因，编码L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(L-GLDH)的基因，依次简写为gme、vtc2、vtc4、galdh和gldh。经过密码子优化后的每个基因搭配酵母内源组成型启动子和终止子，通过重叠延伸PCR获得五个外源基因元件。

2、VC生产菌株的构建

植物的VC合成途径始于葡萄糖，包括十个反应过程(图1)，酿酒酵母仅缺少VC合成的三种编码GME、GGP、GPP的基因gme、vtc2、vtc4。本说明将以上三个基因以及最后两步反应拟南芥来源的相应基因galdh和gldh也一同转化到酿酒酵母中。将上述构建获得的表达基因gme、vtc2、vtc4、galdh的元件，以及限制性内切酶KpnI和NotI线性化的载体pRS416片段，一同利用醋酸锂转化法转入酿酒酵母中(设计的同源臂为100-200bp)，经筛选得到阳性克隆，提酵母质粒反转大肠杆菌获得大肠质粒2-4-6-1。将表达基因gldh的元件经过NotI和SacI酶切，通过T4连接将其连在具有相同粘性末端的线性化载体pRS413中，转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆，提取质粒413-gldh。将获得的质粒2-4-6-1和413-gldh转入之前得到的阳性克隆酿酒酵母菌株中，获得VC生产菌株YLAA’。整个构建过程如图2所示。

3、VC生产菌株的发酵检测

实验材料：YLAA’

实验方法：

种子培养基：合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，亮氨酸0.1g/L，色氨酸0.02g/L，1MNaOH调节pH至6.0。

发酵培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖40g/L。

从固体划线平板上挑取单菌落接种于3ml种子培养基SC-Ura-His液体培养基中，在30℃、250rpm条件下过夜培养。然后以初始OD

VC提取方法：发酵结束后，取5ml发酵液到已预冷10ml离心管中，5,000rpm，4℃离心10min。倒掉上清，用移液枪取1mL已预冷ddH

VC的鉴定：通过高效液相色谱(Waters e2695-2489)进行VC的鉴定，使用的色谱柱型号是Hypersil GOLDTM HILIC(5-μm内径，250μmx 4.6μm)，流动相是85％乙腈以及15％0.1％磷酸，流速为1mL/min，UV检测设置为245nm，以纯VC作为标品。

实验结果：发酵结果如图6所示。样品出峰时间与标品出峰时间一致，表明将其VC合成所缺少的三个基因以及最后两步反应相关的两个基因转入酿酒酵母细胞中，成功构建了能够从葡萄糖直接合成VC的菌株，产量达到4.81mg/L。

4、菌株VC合成路径相关基因的转录水平的测定

RNA的提取：使用柱真菌RNAout(TIANDZ)试剂盒提取RNA。

cDNA的获得：使用SPARKscript II RT试剂盒(SparkJade)将近1μg总RNA反转录获得cDNA。

qPCR：使用Unique AptamerTM

实验结果：转录水平测定结果如图3所示。五个内源基因的转录水平比外源基因的转录水平高得多。在内源基因的转录水平中，最高的是sec53，最低的是psa1和ara1。对于外源基因，转录水平最高的基因是galdh，最低的两个基因是vtc2和gldh。以gldh的转录水平为参照，galdh的转录水平约是其9.78倍。ara1的转录水平约是45.68倍。总之，提高VC产量的关键之一是如何提高外源基因的转录水平和表达强度，尤其是基因vtc2和gldh。

实施例2优化代谢路径提高VC产量

1、galdh和gldh融合过表达菌株的构建

融合蛋白具有每个酶分子的完整编码序列，因此它具有组成该酶的酶分子各自的催化功能，利用(GGGGS)

2、潜在限速步骤相关基因过表达菌株的构建

qPCR结果表明，酿酒酵母中的潜在限速步骤相关基因是vtc2和gldh。一些研究表明，D-阿拉伯糖1,4-内酯氧化酶(ALO)可能是L-GLDH的同工酶。将这三个基因进行组合：vtc2；gldh；alo1；vtc2和gldh；alo1和vtc2；alo1和gldh；alo1、vtc2和gldh。通过重叠延伸PCR技术，获得片段GPM1p-vtc2-CTC1t、TEF2p-gldh-ENO2t、TDH3p-alo1-ENO2t、TEF1p-vtc2-CTC1t-TDH3p-gldh-ENO2t、GPM1p-alo1-HXT7t-TEF1p-vtc2-CYC1t、GPM1p-alo1-HXT7t-TDH3p-gldh-ENO2t。将片段GPM1p-vtc2-CTC1t和TEF2p-gldh-ENO2t经NotI和SacI酶切后，分别通过T4连接在具有相同粘性末端的线性化载体pRS425中，转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆，提取质粒425-vtc2和425-gldh，然后分别转化到酿酒酵母YLAA’中，获得菌株VTC2-M和GLDH-M。将片段TDH3p-alo1-ENO2t通过Gibson组装都克隆到用XhoI和SalI线性化的质粒PRS425，筛选得到阳性克隆，提取质粒425-alo1，将其转入YLAA’中，获得菌株ALO1-M。将片段TEF1p-vtc2-CTC1t-TDH3p-gldh-ENO2t、GPM1p-alo1-HXT7t-TEF1p-vtc2-CYC1t以及GPM1p-alo1-HXT7t-TDH3p-gldh-ENO2t分别通过Gibson组装都克隆到用XhoI和HindIII线性化的质粒PRS425中，筛选得到阳性克隆，提取质粒425-vtc2-gldh、425-alo1-vtc2以及425-alo1-gldh，将其分别转入YLAA’中，获得菌株YLAAM-1-YLAAM-3。将片段TDH3p-alo1-ENO2t通过Gibson组装都克隆到用XhoI和SalI线性化的质粒PRS423，筛选得到阳性克隆，提取质粒423-alo1，将其和425-vtc2-gldh一同转入YLAA’中，获得菌株YLAAM-4。整个构建过程如图5所示。

3、比较优化代谢路径菌株摇瓶发酵产量

实验材料：菌株YLAAMF-1、VTC2-M、GLDH-M、ALO1-M以及YLAAM-1-YLAAM-4。

实验方法：除种子培养基不添加亮氨酸，其余条件都和实施例1相同。

实验结果：发酵结果如图6所示。L-Galdh和L-GLDH的融合过表达增加了细胞内VC积累，达到16.97mg/L，是YLAA’的3.53倍。产量增加的原因可能有两个，一是相邻催化反应中酶的融合所表现出的邻近效应和反应的瞬时时间减少了；二是融合蛋白表达可以减少细胞内蛋白酶对中间代谢产物的降解。潜在限速步骤相关基因过表达菌株的发酵结果显示，仅过表达基因vtc2的菌株产量最高，达到23.83mg/L，是YLAA’的4.95倍，强调了基因vtc2在该路径中的重要性。产量第二高的是过表达基因gldh的菌株，达到19.85mg/L，显示了基因gldh也同等重要。而其他菌株产量并没有这么高的原因可能是过量表达基因会引起了酿酒酵母的生长和代谢紊乱，菌株细胞密度的下降导致产量的下降。

实施例3外源添加中间代谢产物及GSH对VC生产的影响

比较不同中间代谢产物及GSH对VC生产的影响

为了研究VC合成过程中仍缺少哪些中间代谢物，将250mg/L L-半乳糖或L-半乳糖-1,4-内酯外源添加至摇瓶中。此外，谷胱甘肽(GSH)可以促进了硫胺素/硫胺焦磷酸盐(TPP)和GSH转运，增加了三羧酸循环和戊糖磷酸途径的代谢，上调活性氧(ROS)排毒蛋白，同时它也是抗氧化剂，因此该说明也向摇瓶外源添加200mg/L GSH，希望其可以减少VC的损失。

实验材料：VTC2-M

实验方法：除种子培养基不添加亮氨酸，其余条件都和实施例1相同。

实验结果：如图7所示，所有三种外源物质在发酵后期对VC的生物合成均具有积极作用。在菌株VTC2-M添加GSH和(或)L-半乳糖在第五天在细胞内累积了近44mg/L VC，并且似乎在接下来仍呈上升趋势。而添加L-半乳糖-1,4-内酯后，第四天VC的积累达到最高值42.56mg/L。由于L-半乳糖是L-半乳糖-1,4-内酯的上游中间代谢产物，并且添加该物质的效果与vtc2过表达的效果一致，因此我们推断仍然需要重建和寻找比拟南芥来源的GPP更高效的酶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。