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一种提高酿酒酵母生物转化生产氢化可的松产量的方法

文献发布时间：2023-06-19 11:08:20

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高酿酒酵母生物转化生产氢化可的松产量的方法。

背景技术

在自然界中存在着以胆固醇及其类似物相关衍生物为代表的一大类化合物，该类化合物均以环戊烷多氢菲为母核，因携带不同侧链修饰基团而具有不同生理活性。自然界中发现的甾体化合物有接近300种，被广泛熟知的如：胆固醇，植物甾醇，雄烯二酮，氢化可的松等甾体类药物。随着甾体药物在疾病治疗和代谢调控等领域取得的成功，甾体药物的市场需求日益壮大，发展势态良好，常年保持稳定增长，雄踞第二大药物市场地位(Fernandez-Cabezon,Galan et al.2018)。

氢化可的松(Hydrocortisone，HC)化学名为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是肾上腺糖皮质激素药物，在激素类药物中占与重要地位，其结构式如图1中所示。HC能够影响糖代谢，具有抗病毒、消炎、抗过敏及抗休克等作用。主要用于肾上腺皮质功能不全引起的疾病及先天性肾上腺皮质功能增生等症状的治疗，也可用于支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风、风湿性发热等炎症性及过敏性疾病的治疗，还可以用于严重性感染和抗休克治疗等。

目前HC的合成方法主要分为三类：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法，其中应用最为广泛的是半合成法(Donova and Egorova 2012)。半合成法是指化学合成与生物转化相结合的方法，其关键在于甾体的C11位β羟基化酶。目前的C11β羟化酶主要有三个来源分别为：蓝色犁头霉，新月弯孢霉和哺乳动物等。如来源于蓝色犁头霉的CYP5311B2蛋白是一种C11β羟化酶，该蛋白是催化甾体化合物C11位发生β羟基化合成重要甾体药物氢化可的松的CYP450蛋白。但不同来源的C11β羟化酶都有一些不可避免的缺点例如：催化活性较低，立体选择性不强，空间选择性不强等(Donova 2017)。所以针对C11β羟化酶目前存在的问题提出相应的优化策略是具有重要意义的。

蛋白表达过程主要包括：蛋白的转录、翻译，蛋白的正确折叠，翻译后修饰以及蛋白的降解等几大过程(Young and Robinson 2014)。通过对蛋白表达过程的调控可以有效的提高酿酒酵母中异源蛋白的表达，提高其催化活性，为目标产物的生物合成提供帮助。酿酒酵母天然产物的生物合成过程通常涉及到异源CYP450蛋白的参与，而一系列的异源CYP450蛋白的活性也成为天然产物合成过程中的瓶颈性问题，所以通过理性的分析蛋白表达过程，找到影响其表达水平的关键靶点，对于提高酿酒酵母异源CYP450蛋白的活性和提高酿酒酵母天然化合物的合成能力具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，按照包括如下步骤的方法制备：提高底盘酿酒酵母中SRP14蛋白的活性或其编码基因的表达量，得到重组菌；

所述底盘酿酒酵母为表达氢化可的松合成系统蛋白编码基因的酿酒酵母；

所述氢化可的松合成系统相关蛋白编码基因包括CYP5311B2蛋白编码基因和AoCPR蛋白编码基因。

上述SRP14蛋白源自酿酒酵母；上述CYP5311B2蛋白和AoCPR蛋白均源自蓝色犁头霉。

上述重组菌中，所述提高底盘酿酒酵母中SRP14蛋白的活性或其编码基因的表达量为将所述SRP14蛋白编码基因或含有该编码基因的表达盒导入所述底盘酿酒酵母中。

上述重组菌中，所述SRP14蛋白编码基因或含有该编码基因的表达盒通过质粒形式导入。在本发明的实施例中，含有SRP14蛋白编码基因的表达盒包括TEF1启动子、SRP14基因和CYC1终止子；所述质粒为SRP14基因过表达质粒pRS313-Trp-SRP14，具体为将序列表中序列1第21-461位所示的SRP14基因插入pRS313-Trp载体的TEF1启动子和CYC1终止子间，得到的质粒。

上述重组菌中，所述底盘酿酒酵母按照如下方法制备：将含有CYP5311B2蛋白编码基因的DNA分子和含有AoCPR蛋白编码基因的DNA分子整合到宿主酿酒酵母的基因组中，得到的重组菌。

上述重组菌中，所述含有CYP5311B2蛋白编码基因的DNA分子整合在所述宿主酿酒酵母基因组的rDNA位点；

所述含有AoCPR蛋白编码基因的DNA分子的整合在所述宿主酿酒酵母基因组的Gal7位点。

宿主酿酒酵母在本实施例为酿酒酵母HC201菌株(又名HC005)。

上述含有CYP5311B2蛋白编码基因的DNA分子由上游同源臂(序列8)、pTDH3-CYP5311B2-eGFP-tTPI1(序列5)和下游同源臂(序列9)组成。

上述含有AoCPR蛋白编码基因的DNA分子由上游同源臂及marker(序列6)、Pgk启动子(序列10第1-750位)、AoCPR基因(序列10第751-2803位)、ADH1终止子(序列10第2804-2962位)和下游同源臂(序列7)组成。

本发明还有一个目的是提供一种制备第一个目的所述重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：为按照上述第一个目的中的方法制备；得到重组菌。

上述重组菌在如下至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)生产氢化可的松；

2)提高氢化可的松产量；

3)制备生产氢化可的松的产品；

4)制备提高氢化可的松产量的产品。

或，SRP14蛋白在提高底盘酿酒酵母的氢化可的松合成能力中的应用也是本发明保护的范围；

或，SRP14蛋白在通过提高底盘酿酒酵母中氢化可的松合成系统中CYP5311B2蛋白编码基因表达量实现提高所述底盘酿酒酵母的氢化可的松合成能力中的应用也是本发明保护的范围；

所述底盘酿酒酵母为表达氢化可的松合成系统蛋白编码基因的酿酒酵母。

本发明还提供了如下方法：

本发明提供了一种生产氢化可的松的方法，包括如下步骤：用第一个目的的所述重组菌催化底物17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Cortexolone-21-acetate,RSA)，得到氢化可的松。

或，本发明提供了一种提高酿酒酵母生产氢化可的松能力的方法，为如下A)或B)：

A)所示的方法为通过SRP14蛋白提高底盘酿酒酵母中氢化可的松合成系统中CYP5311B2编码基因的表达量，实现提高菌株的氢化可的松合成能力；

B)所示的方法为通过SRP14蛋白提高底盘酿酒酵母中氢化可的松合成系统中CYP5311B2蛋白的表达，实现提高菌株的氢化可的松合成能力；

所述底盘酿酒酵母为表达氢化可的松合成系统蛋白编码基因的酿酒酵母。

所述各种方法均包括如下步骤：

1)制备第一个目的中的所述重组菌；

2)用所述重组菌催化底物RSA，实现提高酿酒酵母生产氢化可的松能力。

本发明的实验证明，SRP14蛋白可以有效提高酿酒酵母氢化可的松合成中关键酶CYP5311B2蛋白的表达进而有效提高菌株的氢化可的松合成能力。证明SRP14是提高酿酒酵母氢化可的松合成能力的有效靶点，这也为提高酿酒酵母生物催化合成氢化可的松的产业化推进做出贡献。

附图说明

图1为氢化可的松的结构式。

图2为筛选模型功能验证。

图3为SRP14基因提高菌株氢化可的松合成能力。

图4为液相色谱HPLC结果和标曲。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中引物如表1所示：

表1为构建SRP14基因表达质粒引物

实施例1、酿酒酵母SRP14基因过表达质粒的构建

1、目标靶点的PCR扩增

以酿酒酵母BY4742基因组为模板，用引物TEF1-SRP14-up/SRP14-down-CYC1(见表1)扩增到目的基因。

上述扩增体系为TAKARA

上述扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。

所得扩增产物命名为TEF1-SRP14-CYC1(序列1，该片段包含TEF1启动子同源区(序列1第1-20)，CYC1终止子同源区(序列1第462-481位)以及SRP14基因序列(序列1第21-461位))。将得到的PCR扩增产物用上海生工生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化产物备用。

SRP14基因(野生型)序列如序列1第21-461位所示，编码蛋白质命名为SRP14蛋白。

2、表达载体的PCR扩增

以酿酒酵母通用表达载体pRS313-Trp为模板，用引物313-TEF-OL/313-CYC1-OL(见表1)扩增目标表达载体。扩增体系同步骤1。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。所得扩增产物命名为pRS313-Trp-vector(序列2，该片段包含TEF1启动子，CYC1终止子以及pRS313载体骨架，序列2第1-270位核苷酸为CYC1终止子，序列2第271-5391位核苷酸为Trp基因，序列2第5392-5812位核苷酸为TEF1启动子)。将得到的PCR扩增产物用上海生工生物工程有限公司的PCR胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物备用。

3、构建目标靶点表达质粒

用碧云天公司的无缝克隆试剂盒，以及步骤1获得的基因片段TEF1-SRP14-CYC1和步骤2获得的载体片段pRS313-Trp-vector，加入连接体系：5μL 2×Quick ligationBuffer(NEB公司)、0.5μL Quick ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至10μL，25度反应20min得到连接产物，转入Trans1-T1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μl LB培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pRS313-Trp上插入目的片段，得到质粒pRS313-Trp-SRP14。使用爱思进公司的质粒提取试剂盒，提取目标质粒备用。

SRP14基因过表达质粒pRS313-Trp-SRP14为将序列表中序列1第21-461位所示的SRP14基因插入pRS313-Trp载体(序列2)的TEF1启动子和CYC1终止子间，得到的质粒。

实施例2、以氢化可的松为目标产物的酿酒酵母C11β羟化酶(CYP5311B2)表达水平筛选模型的建立

1、CYP5311B2蛋白与eGFP蛋白的融合

第一步，通过overlap连接的方式实现CYP5311B2蛋白与eGFP蛋白的融合，首先以实验室已有的克隆载体M4-CYP5311B2为模板用引物Xp-M-pEASY-TDH3-F和CYP5311B2-OL-eGFP(见表2)进行扩增(方法同实施例1步骤1)，获得的片段命名为CYP5311B2-eGFP-OL-1(序列3，该片段包含TDH3启动子(序列3第1-800位)，CYP5311B2基因(序列3第801-2483位)以及eGFP同源区(序列3第2484-2504))；

第二步，以实验室已有的M4-eGFP质粒为模板用引物eGFP-OL-CYP5311B2和引物Xp-M-pEASY-CYC1-R(见表2)进行扩增(方法同实施例1步骤1)，获得的片段命名为CYP5311B2-eGFP-OL-2(序列4，该片段包含CYP5311B2同源区(序列4第1-25)，eGFP基因(序列4第26-739)以及CYC1终止子(序列4第740-1017))；

第三步，以前两步获得的片段为模板，使用引物Xp-M-pEASY-TDH3-F和Xp-M-pEASY-CYC1-R(见表2)进行扩增(方法同实施例1步骤1)，获得的片段命名为pTDH3-CYP5311B2-eGFP-tTPI1(序列5，该片段包含TDH3启动子(序列5第1-800)，CYC1终止子(序列5第3219-3496)以及CYP5311B2-eGFP融合片段(序列5第801-3218))。

对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。这样就获得了融合了eGFP的CYP5311B2蛋白的编码基因，可以通过荧光强度来对CYP5311B2的表达进行表征。

表2为CYP5311B2蛋白与eGFP蛋白融合引物

2、底盘菌株HC401的构建

1)菌株HC400

将实验室已有的酿酒酵母HC201菌株(又名HC005，记载在如下文献中：Chen,J.Fan,F.et al.Identification of Absidia orchidis steroid 11beta-hydroxylationsystem and its application in engineering Saccharomyces cerevisiae for one-step biotransformation to produce hydrocortisone.Metab Eng.2019，57,31-42.)在选择培养基(配方：酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu.，0.01％Ura.(各百分号均表示g/100mL))中培养，得到菌液。取1mL(OD约0.6-1.0)分装到1.5mL EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1mL处理液(10mM LiAc；10mMDTT；0.6M山梨醇；10mM Tris-HCl(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1mL 1M山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μL。

分别加入实验室已有的重组片段pPgk-Ac-CPR-ADH1t(序列10；该片段包含pgk启动子，AoCPR基因，以及ADH1终止子)、同源臂marker片段gal7S-URA3-up(序列6；该同源臂片段包含Gal7位点上游400bp同源区域，URA3marker基因，以及Pgk启动子400bp同源区域)和gal7S-URA3-down(序列7；该同源臂片段包含ADH1终止子200bp同源区域，以及Gal7位点下游300bp同源区域；实现将AoCPR,基因片段整合于酿酒酵母HC201的Gal7位点)各1μL，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1mL1M山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：酵母选择培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，0.005％His.，0.01％Leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。

用引物AoCPR-up-F和AoCPR-down-R进行PCR鉴定，条带大小为2052bp的为阳性克隆并命名为菌株HC400。

菌株HC400为将含有AoCPR蛋白编码基因的DNA分子整合于酿酒酵母HC201基因组中的Gal7位点得到的重组菌。

含有AoCPR蛋白编码基因的DNA分子由上游同源臂及marker(序列6)、Pgk启动子(序列10第1-750位)、AoCPR基因(序列10第751-2803位)、ADH1终止子(序列10第2804-2962位)和下游同源臂(序列7)组成。

2)菌株HC401

菌株HC401为将含有CYP5311B2-eGFP的DNA分子整合于酿酒酵母HC400的rDNA位点得到的重组菌。

含有CYP5311B2-eGFP的DNA分子由上游同源臂(序列8)、pTDH3-CYP5311B2-eGFP-tTPI1(序列5)和下游同源臂(序列9)组成。

具体如下：

方法同步骤1)：将pTDH3-CYP5311B2-eGFP-tTPI1(序列5)、rDNA-leu2-up(序列8；该同源臂片段包含rDNA位点上游400bp同源区域，Leu2marker基因，以及TDH3启动子400bp同源区域)和rDNA-leu2-down(序列9；该同源臂片段包含CYC1终止子200bp同源区域，以及rDNA位点下游300bp同源区域)电击转入HC400中，得到获得8个正确的阳性克隆，命名为菌株HC401(1-8)。

用引物CYP5311B2-up-F和eGFP-down-R进行PCR鉴定，条带大小为2418bp的为阳性克隆并命名为菌株HC401(1-8)。

这8个菌株的染色体上有不同拷贝的CYP5311B2-eGFP基因，所以显示出不同的荧光强度和氢化可的松产量差异。

2、筛选模型功能的基本验证

对菌株HC400和HC401(1-8)这9株菌进行荧光测定实验：在相应的固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)中活化HC400，HC401(1-8)总共9株酿酒酵母菌株，于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖；各百分号均表示g/100mL)中制备种子液(30℃，250rpm，12h)，随后按照初始OD

结果如图2所示，1-8分别为HC401(1-8)；可以看出8株菌的荧光强度高低不等，符合实验预期，也验证该筛选模型的可用性，可以通过该模型对后续的提高蛋白表达的相关靶点进行筛选。本研究中选取HC401(1-10)菌株中的4号菌株作为后续筛选的底盘菌株，将其命名为HC401-4。

实施例3、相关功能靶点提高菌株氢化可的松合成能力

以酿酒酵母菌株HC401-4为底盘菌株，将对照空质粒pRS313-Trp和实施例1中构建的质粒pRS313-Trp-SRP14分别转入到酿酒酵母菌株HC401-4中(转化方法同实施例2)，获得正确的阳性克隆，得到的菌株分别命名为菌株HC402和HC403。

对菌株HC401-4，HC402和HC403进行荧光测定和催化发酵合成氢化可的松，荧光测定方法同实施例2。

摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100mL)中活化HC401-4，HC402和HC403酿酒酵母菌株，于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基SD-Ura-His-Leu-Trp，2％葡萄糖；各百分号均表示g/100mL)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1mL的接种量分别各自接种于3瓶含100mL相应液体选择培养基的500mL三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用PBS缓冲液(配方：磷酸二氢钾(KH2PO4):0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.44g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g,加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L)洗涤最终重悬于含有30mL PBS的250mL三角瓶中，加入终浓度为850mg/L的底物RSA(购买于源叶生物)，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养1天，得到催化反应液。

产物萃取：全催化液萃取，取5mL的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4mL，装入10mL离心管中干燥，用1mL甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行HPLC检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(HPLC)分析产物,检测方法：色谱柱ShimadzuInertSustain 250mm*4.6mm*5um(广州绿百草生物有限公司)，流动相甲醇：水＝6:4(v/v)，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长254nm。

标准品氢化可的松购买自源叶生物。

图4A为液相色谱HPLC结果，上图为保留时间10.5min的标准品，下图为HC401-4，保留时间接近10.5min的即为目标产物氢化可的松。HC402和HC403的液相色谱HPLC结果与HC401-4类似，也是选取保留时间接近10.5min为目标产物氢化可的松。

图4B为标准品制备的标曲；

根据标曲获得氢化可的松产量(mg/L.D，表示每天催化反应液中氢化可的松的质量)，结果如图3所示，与对照菌HC402相比，过表达SRP14基因的菌株HC403其氢化可的松合成能力和荧光强度较对照菌株提升25％。该结果表明，SRP14蛋白可以有效提高酿酒酵母氢化可的松合成中关键酶CYP5311B2蛋白的表达进而有效提高菌株的氢化可的松合成能力。证明SRP14是提高酿酒酵母氢化可的松合成能力的有效靶点，这也为提高酿酒酵母生物催化合成氢化可的松的产业化推进做出贡献。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一种提高酿酒酵母生物转化生产氢化可的松产量的方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 481

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

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gagaataccc actattaatc agaatgtctt atggctcgca tgacaagaaa acaaaatgct 300

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g 481

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acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 2220

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 2280

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 2340

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 2400

tgctgcaatg ataccgcgtg atccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 2460

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 2520

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 2580

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 2640

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 2700

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 2760

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 2820

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 2880

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 2940

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 3000

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 3060

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 3120

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 3180

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 3240

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tataatttaa attttttaat ataaatatat aaattaaaaa tagaaagtaa aaaaagaaat 3360

taaagaaaaa atagtttttg ttttccgaag atgtaaaaga ctctaggggg atcgccaaca 3420

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tacatgtgta tatatgtata cctatgaatg tcagtaagta tgtatacgaa cagtatgata 5220

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<212> DNA

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gaccaggaga aagagcatac gttaacgctt actctaacca tagagatggt acaatccaaa 2220

aggttactga taatttgaaa tcattcgaac catacagatt cgttaaccaa gatagaaatt 2280

ctacaaaaat tggtgaagat ttcattttct ttggtatggg taaacatgca tgtccaggta 2340

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