一种含季铵碱修饰的多肽合成方法

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种含季铵碱修饰的多肽合成方法。

背景技术

季铵碱是一类含有季铵(-N

存在两性离子特性的物质多具备表面活性剂的特点，在化妆品及医药领域中通常具有洗涤、乳化、杀菌、抑菌的作用。在两性离子中的带正电荷端可使其通过吸附在带负电荷细菌胞膜的表面，改变细胞壁通透性达到抑制与杀菌的作用。

在一些条件下蛋白质或多肽容易形成聚合，并且在一些有机溶剂中其溶解度较低这会对其在工业或者医学领域的应用产生困难。2008年Xiao等人首次发现利用小分子甜菜碱(betaine)对蛋白质或者多肽进行化学修饰可以增加蛋白质溶解度，防止多肽聚合。通过蛋白质N端进行甜菜碱化学修饰，发现蛋白质溶解度得到明显的改善。这一研究成果提供了全新的提高酶溶解度的小分子修饰方法，为人们解决蛋白质或多肽溶解度低不利于工业或医学领域的应用问题提供了新方法。

Bioconjugate Chem.2008,19(6),pp 1113–1118报导了一种甜菜碱通过硫酯化后修饰N端半胱氨酸多肽的方法，但该方法使用的原料未商业化，不易获取。US5958886报导了一系列在多肽修饰L-左旋肉碱的化合物，但其中并未公布多肽修饰L-左旋肉碱的合成方法。EP0514359B1提供了一种液相中乙酰左旋肉碱修饰氨基酸N端的方法，但该合成方法反应时间较长，反应后处理分离纯化较复杂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种易于操作的在固相树脂上合成季铵碱修饰多肽衍生物的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种含季铵碱修饰的多肽的合成方法，包括如下步骤：

1)通过固相合成方法制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂；

2)含有季铵结构的季铵碱或季铵碱的衍生物与具有裸露氨基的多肽-固相树脂偶联得到季铵碱修饰的多肽树脂；

3)对季铵碱修饰的多肽树脂进行裂解得到季铵碱修饰的多肽粗肽，纯化得到季铵碱修饰的多肽精肽。

进一步的，步骤1)所述固相合成为Fmoc/tBu固相合成方法，载体树脂为Wang树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide-AM树脂中任意一种。

进一步的，步骤2)所述季铵衍生物具有式I所示结构，

其中n为0、1，R

进一步的，步骤2)所述季铵衍生物为左旋肉碱、甜菜碱、棕榈酰肉碱、月桂酰肉碱、乙酰左旋肉碱。

进一步的，步骤2)所述季铵碱及季铵碱衍生物原料与多肽摩尔比为(1-8)：1。

进一步的，步骤2)所述偶联反应的溶剂为DMF、NMP、二氯甲烷、DMSO中任一种或几种的任意比例的混合溶液。

进一步的，步骤2)所述偶联反应的偶联剂为DIPEA+A+B或DIC+A，其中A为HOBT或HOAT，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU中任一种。

进一步的，步骤2)所述偶联反应的反应温度20-30℃，反应时间1-4h小时。

进一步的，步骤3)所述裂解的裂解液为TFA、H2O、PhOMe和TIS中的两种以上的混合物。

进一步的，步骤3)所述纯化为反相高效液相色谱纯化。

由上述技术方案可知，本发明所述含季铵碱修饰的多肽的合成方法通过固相合成方法制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂；含有季铵结构的季铵碱或季铵碱的衍生物与具有裸露氨基的多肽-固相树脂偶联得到季铵碱修饰的多肽树脂；对季铵碱修饰的多肽树脂进行裂解得到季铵碱修饰的多肽粗肽，纯化得到季铵碱修饰的多肽精肽。本发明所述合成方法具有合成收率高、合成条件温和、工艺简单、原料易得、环境友好、且工艺稳定等特点，适合于含季铵碱修饰的多肽的大规模产业化生产，并且制得的含季铵碱修饰的多肽纯度高、杂质含量低，在工业或医学领域具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明所述合成方法的合成路线图；

图2示实施例1betaine-GIACL-CONH

图3示实施例1betaine-GIACL-CONH

图4示实施例1betaine-GIACL-CONH

图5示实施例2 L-carnitine-IIGAC-CONH

图6示实施例2 L-carnitine-IIGAC-CONH

图7示实施例2 L-carnitine-IIGAC-CONH

图8示实施例3 Palmitoyl-L-carnitine-LCQATL-COOH色谱图；

图9示实施例3 Palmitoyl-L-carnitine-LCQATL-COOH质谱图。

具体实施方式

本发明公开了一种含季铵碱修饰的多肽合成方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种含季铵碱修饰的多肽的合成方法，包括如下步骤：

1)通过固相合成方法制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂；

2)含有季铵结构的季铵碱或季铵碱的衍生物与具有裸露氨基的多肽-固相树脂偶联得到季铵碱修饰的多肽树脂；

3)对季铵碱修饰的多肽树脂进行裂解得到季铵碱修饰的多肽粗肽，纯化得到季铵碱修饰的多肽精肽。

本发明所述合成方法的合成路线如图1所示。

进一步的，步骤1)所述固相合成为Fmoc/tBu固相合成方法，载体树脂为Wang树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide-AM树脂中任意一种。

在一些实施方案中，具有裸露氨基的多肽-固相树脂以Rink Amide-AM树脂为载体树脂，通过Fmoc/tBu固相合成方法制备。

进一步的，步骤2)所述季铵衍生物具有式I所示结构，

其中n为0、1，R

在一些实施方案中，所述季铵衍生物中n＝0，R

在一些实施方案中，所述季铵衍生物中n＝1，R

在一些实施方案中，所述季铵衍生物中n＝1，R

在一些实施方案中，所述季铵衍生物中n＝1，R

在一些实施方案中，所述季铵衍生物中n＝1，R

进一步的，步骤2)所述季铵碱及季铵碱衍生物原料与多肽摩尔比为(1-8)：1。在一些实施方案中，为3：1。

进一步的，步骤2)所述偶联反应的溶剂为DMF、NMP、二氯甲烷、DMSO中任一种或几种的任意比例的混合溶液。在一些实施方案中，所述偶联反应的溶剂为DMSO：NMP＝1:1的混合溶液。

进一步的，本发明所述合成方法步骤2)所述偶联反应的偶联剂为DIPEA+A+B或DIC+A，其中A为HOBT或HOAT，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU中任一种。

在一些实施方案中，偶联甜菜碱、乙酰左旋肉碱、棕榈酰肉碱或月桂酰肉碱时，偶联剂为DIPEA+HOBT+HBTU。甜菜碱、乙酰左旋肉碱、棕榈酰肉碱或月桂酰肉碱等季铵碱衍生物DIPEA、HOBT、HBTU的摩尔比为1：2.5：1.5：1.5。

在一些实施方案中，偶联左旋肉碱时，偶联剂为DIC+HOBT，左旋肉碱与DIC、HOB的摩尔比为为1：1.5：1.5。

进一步的，本发明所述合成方法步骤2)所述偶联反应的反应温度20-30℃，反应时间1-4h小时。在一些实施方案中，所述偶联反应3h偶联效果最佳。

进一步的，本发明所述合成方法步骤3)所述裂解的裂解液为TFA、H

在一些实施方案中，采用棕榈酰肉碱、月桂酰肉碱等分子量较大季铵碱修饰多肽时，所述裂解的裂解液为TFA:H

在一些实施方案中，采用左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、甜菜碱等分子量较小的季铵碱修饰时，所述裂解的裂解液为TFA:H

本发明所述制备方法步骤3)裂解得到的粗肽进一步纯化得到精肽，所述纯化优选为反相高效液相色谱纯化。

在一些实施方案中，所述纯化具体为：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱。

本发明所述含季铵碱修饰的多肽的合成方法通过固相合成方法制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂；含有季铵结构的季铵碱或季铵碱的衍生物与具有裸露氨基的多肽-固相树脂偶联得到季铵碱修饰的多肽树脂；对季铵碱修饰的多肽树脂进行裂解得到季铵碱修饰的多肽粗肽，纯化得到季铵碱修饰的多肽精肽。本发明所述合成方法具有合成收率高、合成条件温和、工艺简单、原料易得、环境友好且工艺稳定等特点，适合于含季铵碱修饰的多肽的大规模产业化生产，并且制得的含季铵碱修饰的多肽纯度高、杂质含量低，在工业或医学领域具有广泛的应用前景。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明书及实施例中的缩写及英文含义如下：

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：合成betaine-GIACL-CONH

步骤1)：制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂

取替代度为0.41mmol/g的Rink Amide-AM树脂12.2g，加入到反应器中，加入DMF洗涤两次后用DMF溶胀30分钟，用20％哌啶/DMF溶液(DBLK)脱除Fmoc保护基团两次，每次10分钟，脱保护后DMF洗涤六次。称取5.3g(15mmol)Fmoc-Leu-OH、3.05g(22.5mmol)HOBT和8.55gHBTU(22.5mmol)用NMP＝1:1的混合溶液35ml溶解，冰水浴下加入4.85g(35.5mmol)DIPEA活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用35mLDMF洗涤树脂3次，加入20mLDBLK脱保护5min+10min，35mLDMF洗涤树脂6次，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-OH，每种氨基酸投料15mmol、HOBT投料22.5mmol、HBTU投料22.5mmol、DIPEA投料35.5mmol。偶联结束，等待下一步季铵碱修饰反应。

步骤2)：向多肽氮端引入甜菜碱

称取3.5g(30mmol)甜菜碱、6.1g(45mmol)HOBT和17.1gHBTU(45mmol)用35mlDMSO:NMP＝1：1混合溶液溶解，冰水浴下加入9.7g(75mmol)DIPEA活化3min后，加入反应器中，反应三小时，反应结束后用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用35mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂16.3克。

步骤3)：甜菜碱-多肽制备

将步骤2)得到的树脂16.3g加入到250mL三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:TIS:PhOMe＝90:5:4:1(v/v)160mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.6L冰甲基叔丁基醚中沉淀，离心，冰甲基叔丁基醚1.0L洗涤3次，减压干燥得到2.92g克甜菜碱-多肽衍生物，粗肽纯度85.24％(图2)。

步骤4)：精肽制备

将实步骤3中得到的粗肽通过15cm×25cm制备柱使用高效液相色谱纯化。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱梯度A相：70％-30％，洗脱制备流速：70-80ml/min；检测波长：220nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品2.41g，纯度为99.57％、收率82.5％、分子量FW:574.32(图3和4)。

实施例2：合成L-carnitine-IIGAC-CONH

步骤1)：制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂

取替代度为0.41mmol/g的Rink Amide-AM树脂24.4g，加入到反应器中，加入DMF洗涤两次后用DMF溶胀30分钟，用20％哌啶/DMF溶液(DBLK)脱除Fmoc保护基团两次，每次10分钟，脱保护后DMF洗涤六次。称取17.57g(30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、6.10g(45mmol)HOBT用60ml DMF溶解，冰水浴下加入5.7g(45mmol)DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用70mLDMF洗涤树脂3次，加入70mLDBLK脱保护5min+10min，70mLDMF洗涤树脂6次，按照肽序继续依次偶联、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ile-OH，每种氨基酸投料30mmol、HOBT投料45mmol、DIC投料45mmol。偶联结束，等待下一步季铵碱修饰反应。

步骤2)：向多肽氮端引入左旋肉碱

称取4.84g(30mmol)左旋肉碱、6.10g(45mmol)HOBT，60ml DMSO:NMP＝1：1混合溶液溶解，冰水浴下加入5.7g(45mmol)DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应3小时。反应结束后用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用70mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂31.4克。

步骤3)：左旋肉碱-多肽制备

将步骤3得到的树脂31.4g加入到500mL三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:TIS:PhOMe＝90:5:4:1(v/v)350mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入3.5L冰甲基叔丁基醚中沉淀，离心，冰甲基叔丁基醚1.0L洗涤3次，减压干燥得到6.5g克左旋肉碱-多肽衍生物，粗肽纯度75.75％(图5)。

步骤4)：精肽制备

将步骤4中得到的粗肽通过15cm×25cm制备柱使用高效液相色谱纯化。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，洗脱梯度A相：65％-25％，洗脱制备流速：70-80ml/min；检测波长：220nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品5.8g，纯度为98.35％、收率93.85％、分子量M＝618.34(图6和7)。

实施例3：合成Palmitoyl-L-carnitine-LCQATL-COOH(FW:1031.37)

步骤1)：制备具有裸露氨基的多肽-固相树脂

取替代度为0.40mmol/g的Fmoc-Leu-wang resin树脂1.22g，加入到反应器中，加入DMF洗涤两次后用DMF溶胀30分钟，用20％哌啶/DMF溶液(DBLK)脱除Fmoc保护基团两次，每次10分钟，脱保护后DMF洗涤六次。称取0.596g(1.5mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、0.304g(2.25mmol)HOBT用5ml DMF溶解，冰水浴下加入0.28g(2.25mmol)DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用10mLDMF洗涤树脂3次，加入10mLDBLK脱保护5min+10min，10mLDMF洗涤树脂6次，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH，每种氨基酸投料1.5mmol、HOBT投料2.25mmol、DIC投料2.25mmol。偶联结束，等待下一步季铵碱修饰反应。

步骤2)：向多肽氮端引入棕榈酰-L-肉碱

称取0.60g(1.5.mmol)棕榈酰-L-肉碱盐酸盐0.304g(2.25mmol)HOBT，5ml DMSO:NMP＝1：1混合溶液溶解，冰水浴下加入0.28g(2.25mmol)DIC活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应3小时。反应结束后用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用10mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂1.93克。

步骤3)：棕榈酰-L-肉碱-多肽制备

将步骤3得到的树脂1.93g加入到50mL三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O＝95:5(v/v)20mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入200mL冰甲基叔丁基醚中沉淀，离心，冰甲基叔丁基醚50mL洗涤3次，减压干燥得到0.526g克棕榈酰-L-肉碱-多肽衍生物，粗肽纯度96.56％(图8和9)。