一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用

技术领域

本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用。

背景技术

荧光成像技术是现代生命科学领域强最有力的工具之一，超分辨成像技术的出现更是将荧光成像分辨率提高至单分子尺度。依托超分辨技术在纳米尺度上对生命活动进行的长时间实时、动态跟踪与观察，是推动生命科学发展的强大动力。

为了实现更高的定位精度，超分辨显微成像技术要求单位时间内获得的光子数更多，这就对染料亮度提出了更高要求。此外，相比于传统的共聚焦荧光显微镜，超分辨显微镜所使用的激光器强度亦大幅度提高，因此更高光稳定性的染料不仅是实现高分辨成像的必要条件，也是满足长时间动态观察生命过程的必要条件。遗憾的是，目前大部分染料在亮度和光稳定性上都不足以满足长时间超分辨成像的要求。

花菁类染料是目前已知的吸光度最高，亮度最高的一类染料，在超分辨成像领域应用最为广泛。限制其应用的主要问题在于，这类染料的甲川链完全暴露，激发态极易受到单线态氧进攻而发生光漂白，不能满足长时间成像的需求。基于花菁类染料开发一类适用于长时间超分辨成像的荧光染料，是获得高亮度、可长时间成像的超分辨荧光染料的最有效途径。

发明内容

本发明涉及一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，该类荧光染料在五甲川菁染料母体上构建了分子内开关。此开关在绝大多数有机溶剂、固体状态及水溶液的酸性至碱性的较宽pH范围内均处于闭环状态，分子可在质子、盐离子、激光、蛋白质及细胞内其他物质的作用下开环。这类分子开环比例低，开环分子亮度高，光稳定性强，从而用于超分辨成像。

本发明公开了可用于超分辨成像的具有分子内开关荧光染料，是以五甲川菁染料为结构单元，其结构式如下所示，

其中，X、Y为是相同或不同的取代基，具体为H、COOH、SO

Z为R

同时，本发明还提供了用于超分辨成像的具有分子内开关荧光染料的合成方法，合成步骤如下：

具体合成步骤为：

步骤一：半菁的合成

将Y、Z取代基修饰的2,3,3-三甲基三氢吲哚与丙二醛衍生物按摩尔比1:1-1:1.1置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到红棕色产物半菁；

步骤二：X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

将X修饰的N-溴烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚和硫代乙酸钾按摩尔比1:1-10溶于N,N-二甲基乙酰胺中，25-90℃下搅拌1-12小时；减压除去溶剂，得到产物待用；

步骤三：花菁的合成

将步骤一得到的半菁，步骤二得到的X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚按及醋酸钠按摩尔比1:1-1.1:1-10置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到蓝色产物花菁；

步骤四：具有分子内开关的五甲川菁染料的合成

将步骤三得到的花菁染料与无水碳酸钾按摩尔比1:1-5加入圆底烧瓶中，向其中加入溶剂甲醇，室温下搅拌反应0.5-2小时；减压除去溶剂，色谱柱层析得到浅黄色产物即具有分子内开关的五甲川菁染料。

上述这类染料能够应用于活细胞的超分辨荧光成像，并作为探针用于荧光传感。

本发明具有以下特征：

这类染料具有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。

这类染料通过在五甲川菁染料的母体上构建分子内开关，使其具备了光稳定的性质。细胞内超分辨荧光成像条件下，相比于不加此修饰的五甲川菁染料，荧光强度降低至60％可成像帧数提高了九倍；溶液测试条件下，640nm激光照射10min-120min内荧光强度保持基本不变，不加修饰的五甲川菁染料荧光强度持续下降。

这类染料在生理条件下进行超分辨成像，可维持细胞内荧光分子浓度及荧光强度稳定，实现长时间超分辨荧光成像。

这类染料对细胞内质子环境、蛋白质及离子等有“关-开”响应，可作为探针用于活细胞超分辨荧光传感。

这类染料在固体、有机溶剂及pH>4.5的水环境中大部分分子为闭环保护状态，可维持环境中荧光分子总体数量的平衡，提高材料荧光性能的稳定性，延长材料的使用寿命。

附图说明

图1：为实施例1中中间体花菁CySA-4C的核磁氢谱；

图2：为实施例1中中间体花菁CySA-4C的核磁碳谱；

图3：为实施例1中目标化合物CyS-4C的核磁氢谱；

图4：为实施例2中目标化合物CyS-3C的核磁氢谱；

图5：为实施例3中中间体花菁CySA-2C的核磁氢谱；

图6：为实施例4中中间体花菁CySA-3C的核磁氢谱；

图7：为实施例4中中间体花菁CySA-3C的核磁碳谱；

图8：为实施例1中目标化合物CyS-4C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱；

图9：为实施例1中目标化合物CyS-4C在不同溶剂中的荧光发射图谱；

图10：为实施例1中目标化合物CyS-4C在水中和表面活性剂溶液中的紫外可见吸收图谱；

图11：为实施例1中目标化合物CyS-4C在水中和表面活性剂溶液中的荧光发射图谱；

图12：为实施例1中目标化合物CyS-4C染色的人宫颈癌细胞(HeLa)线粒体的结构光照明超分辨显微成像(SIM)；

图13：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱；

图14：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同溶剂中的荧光发射图谱；

图15：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的紫外可见吸收图谱；

图16：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的荧光发射图谱；

图17：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的645nm处的紫外可见吸收的强度及拟合曲线；

图18：为实施例2中目标化合物CyS-3C荧光对小牛血清白蛋白的响应；

图19：为实施例2中目标化合物CyS-3C对环境变化所导致的开环的动力学曲线；

图20：为实施例2中目标化合物CyS-3C与已知化合物Cy5在640nm的激光照射下的紫外可见吸收与荧光发射的变化曲线；

图21：为实施例2中目标化合物CyS-3C与已知化合物Cy5染色的细胞在结构光照明超分辨显微成像(SIM) 条件下视野内的荧光强度变化曲线；

图22：为实施例2中目标化合物CyS-2C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱。

具体实施方式

实施例1

染料CyS-4C的合成

中间体半菁的合成路线和产物结构如下：

称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(284mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至90℃搅拌2小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体N-硫乙酰丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

称取化合物N-(4-溴丁基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0,4mmol)，硫代乙酸钾(46mg，0.4mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺2mL，室温下搅拌12小时，减压蒸去溶剂直接用于下一步。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体花菁CySA-4C的合成

称取化合物N-硫乙酰丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.41mmol)，步骤一合成的半菁(140mg， 0.41mmol)，乙酸钠(45mg，0.54mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1 小时。减压争取溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体104mg，产率44％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱如图1所示，具体数据如下：

其核磁碳谱如图2所示，具体数据如下：

经检测，其结构如上式示。

目标化合物CyS-4C的合成

称取上一步获得的花菁染料(60mg，0.1mmol)，碳酸钾(15mg，0.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌20min。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体10mg，产率17％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱见图3，具体数据如下：

经检测，其结构如上式示。

将本实施例得到的化合物CyS-4C溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其不同溶剂中的光谱、对离子及pH等的响应，活细胞长时间超分辨成像性质进行检测。

CyS-4C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。

CyS-4C对pH响应的测试。取20μL母液置于40mL表面活性剂的水溶液(2mM的曲拉通100)中配制成5μM的荧光探针测试液。用0.1M的盐酸水溶液或0.1M的氢氧化钠水溶液调节测试液的pH在 3-12的范围内均匀变化，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。

CyS-4C对活细胞的结构光照明显微成像(SIM)。取1μL母液置于1mL人宫颈癌细胞(HeLa)培养液中，培养箱中孵育60min，随后用于结构光照明显微成像。

CyS-4C在活细胞内SIM成像条件下的稳定性实验。将染色好的人宫颈癌细胞(HeLa)在SIM拍照条件下，用相同成像模式每隔30S成像一帧，连拍数十张，统计成像时细胞内的荧光强度成像帧数的变化情况。

实施例2

染料CyS-3C的合成

中间体半菁的合成路线和产物结构如下：

称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(312mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至110℃搅拌1小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

称取化合物N-(3-溴丙基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(300mg，0.8mmol)，硫代乙酸钾(1.14mg，10mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺2mL，90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂直接用于下一步。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体花菁CySA-3C的合成

称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.41mmol)，步骤一合成的半菁(150mg， 0.45mmol)，乙酸钠(45mg，0.54mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至110℃搅拌 1小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体104mg，产率44％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱具体数据如下：

经检测，其结构如上式所示。

目标化合物CyS-3C的合成

称取上一步获得的花菁染料(50mg，0.09mmol)，碳酸钾(64mg，0.45mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，90℃搅拌0.5h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体5mg，产率13％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱数据如图4所示，具体数据如下：

经检测，其结构如上式所示。

将本实施例得到的化合物CyS-3C溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱、光稳定性，活细胞长时间超分辨成像性质进行检测。

实施例3

染料CyS-2C的合成

中间体半菁的合成路线和产物结构如下：

称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(284mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至110℃搅拌2小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体2-硫乙酰基-溴乙烷的合成

取化合物1,2-二溴乙烷(500μL，5.8mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺中配成溶液(S1)，化合物硫代乙酸钾(726mg，6.4mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺中配成溶液(S2)，将溶液S2缓慢滴入S1中，迅速析出大量白色固体，室温下继续搅拌一个小时，旋干反应液，硅胶柱层析(石油醚/二氯甲烷＝3/1，V/V)，得无色透明液体840mg，产率79％。

其核磁氢谱具体数据如下：

中间体N-硫乙酰乙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

取化合物2,3,3-三甲基三氢吲哚(50mg，0.3mmol)，2-硫乙酰基-溴乙烷(170mg，0.9mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙腈2mL，90℃搅拌过夜，减压蒸去溶剂直接用于下一步。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检测，其结构如上式示。

中间体花菁CySA-2C的合成

称取化合物N-硫乙酰乙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(26mg，0.1mmol)，步骤一合成的半菁(33mg，0.1 mmol)，乙酸钠(10mg，0.12mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌2小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体21mg，产率50％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱具体数据如下：

经检测，其结构如上式所示。

目标化合物CyS-2C的合成

称取上一步获得的花菁染料(20mg，0.04mmol)，碳酸钾(5mg，0.04mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌2h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得浅黄色固体2.6mg，产率15％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁氢谱如图5所示，其数据如下：

经检测，其结构如上式所示。

实施例4

化合物CyDS-3C的合成

中间体花菁CyDSA-4C的合成

称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(390mg，1.1mmol)，丙二醛衍生物(129mg，0.5 mmol)，乙酸钠(90mg，1.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)得蓝色粉末200mg，产率60％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经验证，其结构如上式所示。

目标化合物CyDS-2C的合成

称取上一步获得的花菁染料(20mg，0.03mmol)，碳酸钾(12mg，0.09mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌20min。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体1.7mg，产率11％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经验证，其结构如上式所示。

实施例5

化合物CySMito-3C的合成

中间体N-(4-三苯基膦)丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

称取化合物N-(4-溴丙基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(100mg，0.27mmol)，三苯基膦(702mg，2.7mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙腈2mL，90℃搅拌过夜。旋干反应液，用正己烷分散残余液，四氢呋喃洗涤，抽滤得肉粉色固体140mg，产率99％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁数据如下：

经检测，其结构如上式示。

中间体半菁的合成

称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

中间体花菁的合成

称取化合物N-(4-三苯基膦)丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(97mg，0.20mmol)，上一步制得的半菁(75 mg，0.15mmol)置于圆底烧瓶中，向其中加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1小时。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得蓝色固体20mg，产率10％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

目标化合物CySMito-3C的合成

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

实施例6

化合物CySMB-3C的合成

中间体半菁的合成

称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至110℃搅拌2小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

中间体N-十六烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

取化合物2,3,3-三甲基三氢吲哚(550μL，3mmol)，碘十六烷(1.3g，3mmol)置于密封管中，加热至90℃搅拌48小时。充分冷却反应液，将固体分散于正己烷中，抽滤得紫色蜡状固体1.36g，产率38％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

其核磁数据如下：

经检验，其结构如上式所示。

中间体花菁的合成

称取化合物N-十六烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(97mg，0.20mmol)，上一步制得的半菁(75mg，0.15 mmol)置于圆底烧瓶中，向其中加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌2小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得蓝色固体20mg，产率10％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

目标化合物CySMB-3C的合成

称取上一步获得的花菁染料(60mg，0.1mmol)，碳酸钾(15mg，0.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温搅拌2h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得浅黄色固体10mg，产率17％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M+H]

经检验，其结构如上式所示。

实施例7

化合物CySCB-3C的合成

中间体N-丙酸甲酯基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成

取化合物2,3,3,-三甲基三氢吲哚(1.5mL,9mmol)，化合物3-溴丙酸甲酯(1.2mL，11mmol)置于圆底烧瓶中，加热至90℃搅拌过夜。向粘稠的反应液中加入丙酮，充分超声使其分散，抽滤得白色砂质固体1.3g，产率45％。

其核磁数据如下：

中间体半菁的合成

称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经检验，其结构如上式所示。

中间体花菁的合成

取化合物N-丙酸甲酯基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.46mmol)，上一步合成的半菁(200mg，0.41 mmol)，醋酸钠(41mg，0.5mmol)置于圆底烧瓶中，升温至90o搅拌一个小时。减压蒸干反应液，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝30/1，V/V)得蓝色化合物64mg，产率22％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

该化合物核磁氢谱如图6，具体数据如下：

该化合物核磁碳谱如图7，具体数据如下：

经检验，其结构如上式所示。

目标化合物CySCB-3C的合成

取上一步得到的花菁染料(23mg，0.04mmol)溶于乙醇中，向其中滴入1M氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应30分钟。减压蒸干反应液，色谱柱分离得浅黄色化合物3.6mg。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)：m/z：[M]

经验证，其结构如上式所述。

实施例8

实施例1中制得的化合物CyS-4C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。

如图8、图9所示，在有机溶剂中，该化合物的最大吸收位于645nm左右，荧光位于675nm左右。在水中，该化合物出现明显的H聚集，荧光淬灭。在PBS中，该化合物出现无序聚集，荧光淬灭。

实施例9

CyS-4C对活细胞的结构光照明显微成像(SIM)。取1μL母液置于1mL人宫颈癌细胞(HeLa)培养液中，培养箱中孵育60min，随后用于结构光照明显微成像。

如图10所示，HeLa细胞的线粒体轮廓明确，线粒体嵴清晰可见。化合物CyS-4C可实现活细胞线粒体超分辨成像。

实施例10

实施例2中制得的化合物CyS-3C在多种溶剂中的光谱测试。取3μL母液，加入3mL溶剂中，配制成2μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。

如图11所示，化合物CyS-3C在有机溶剂中大部分处于闭环状态，300-400nm之间的闭环吸收峰较强，而位于600-700nm之间的开环吸收峰较弱，开环分子的最大吸收峰位于650nm左右。如图12 所示，该化合物的开环形式在有机溶剂中的最大发射峰位于675nm左右。

实施例11

实施例2制得的化合物CyS-3C对pH响应的测试。取20μL母液置于40mL表面活性剂的水溶液 (2mM的曲拉通100)中配制成5μM的荧光探针测试液。用0.1M的盐酸水溶液或0.1M的氢氧化钠水溶液调节测试液的pH在3至12的范围内均匀变化，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。

如图13、14所示，溶液pH由4变到12的过程中，化合物的最大吸收和最大发射均逐渐降低，而300-400nm之间的宽峰随着碱性增加逐渐增强。说明该化合物在碱性条件下，巯基进攻到吲哚碳上形成闭环结构。

如图15所示，对化合物CyS-3C在不同pH条件下的最大吸收强度进行采集和拟合，判断该化合物的pK-cycle位于5.5。从图中可以看出，在生理pH条件下(pH＝7.4)该化合物基本处于完全闭环状态，可以保证在成像时未与目标结合的分子处于暗态，并能起到对消耗的开环分子实时补充的效果，极大地降低了成像的背景荧光、延长成像时间。

实施例12

实施例2制得的化合物CyS-3C对蛋白质响应的测试。分别取3μL母液，加入3mL磷酸缓冲溶液或4mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲溶液中，迅速混匀检测其荧光随时间的变化。

如图16所示，将化合物与牛血清白蛋白混匀120分钟以后，荧光强度出现了大约11倍的提升。相同条件下与PBS混匀的化合物，荧光强度未发生明显改变。该化合物在正常生理条件下处于闭环状态，与蛋白质靠近或结合后，受蛋白影响会发生由闭环到开环状态的改变。

实施例13

实施例2制得的化合物CyS-3C在活细胞内SIM成像条件下的稳定性实验。将染色好的人宫颈癌细胞(HeLa)在SIM拍照条件下，用相同成像模式每隔30S成像一帧，连拍数十张，统计成像时细胞内的荧光强度随成像帧数的变化情况。

如图17所示，连续成像50帧后视野内荧光强度平均下降至初始值的80％，已知化合物Cy5相同条件下荧光强度下降至初始值的20％。

实施例14

实施例3中制得的化合物CyS-2C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。

如图18所示，化合物CyS-2C在有机溶剂中大部分处于闭环状态，主要吸收峰为位于300-400nm 之间的闭环部分的特征吸收，位于600-700nm之间的开环吸收峰较弱，开环分子的最大吸收峰位于650nm 左右。如图19所示，该化合物的开环形式在有机溶剂中的最大发射峰位于675nm左右。

实施例15

实施例3中制得的化合物CyS-2C对pH响应的测试取7.5μL母液，加入3mL不同pH的缓冲溶液中，配制成5μM的荧光探针测试液，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。

如图20、21所示，溶液pH由2变到8的过程中，化合物的最大吸收和最大发射均逐渐降低，而 300-400nm之间的宽峰随着碱性增加逐渐增强，即该化合物在碱性条件下形成闭环结构。

如图22所示，对化合物CyS-3C在不同pH条件下的最大吸收强度进行采集和拟合，判断该化合物的pK- cycle位于pH＝4。从图中可以看出，在生理pH条件下(pH＝7.4)该化合物处于完全闭环状态，可以保证在成像时未与目标结合的分子处于暗态，样本内闭环分子数量多，开环分子数量少，极大地降低了成像的背景荧光。同时可通过开关环平衡维持活细胞内开环分子数量和荧光强度总体平衡，适用于超分辨成像。