水稻1K SNP-Panel的开发方法与育种应用

技术领域

本发明涉及一种应用于分子育种领域的基因检测技术，具体涉及水稻1K SNP-Panel的开发方法与育种应用。

背景技术

“主要经济作物分子设计育种”项目是国家重点研发计划“七大农作物育种”重点专项第一批启动项目；分子设计育种技术将实现对农艺性状的精确改良，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向。水稻SNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现水稻分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国水稻育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；通过水稻SNP-Panel的技术开发积累，相关技术还可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种；满足不同物种的分子育种需求，加快优质品种的开发时间，满足人民对生活物质“量”和“质”的需求。

目前分子标记辅助育种的技术有SSR/InDel、KASP和基因芯片，SSR/InDel和KASP可用的标记少，单价高，不适合全基因组范围的分子标记辅助育种；基因芯片价格高且核心技术为国外所有，不能大规模应用且不能满足个性化的需求，同时存在技术壁垒，鉴于当前的国际形势，不利于国内育种的安全。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提供了一种低价且能满足个性化需求的全基因组水平的分子标记育种技术。

本发明一方面包括水稻1K SNP-Panel的开发方法，基于全基因组重测序技术获得特定SNP标记，设计扩增引物并选出检测特定SNP标记的特异性引物，通过多重PCR、二代测序和生物信息学分析软件“GKPanel”获得所有个体基因型。

该特定SNP标记为本发明所特指的1253个SNP(具体分布见附图)，其均匀覆盖水稻全基因组。

该扩增引物为特定SNP标记的扩增引物，每一个SNP标记均有一对相对应的特异性引物，以期高程度解读水稻基因组。

该1K SNP-Panel可实现10000个样品的同时检测，每个样品一次可检测1000个和1000个以上均匀覆盖水稻全基因组的SNP标记，该SNP标记的数量优选地为1253个。

该生物信息学分析软件“GKPanel”为自主开发的专门软件。

本发明另一方面提供了1K SNP-Panel在分子育种中的应用。

本发明所述水稻1K SNP-Panel开发与育种应用的方法主要包括以下几个步骤：

(1)提取水稻基因组DNA，包括提取干种子、幼嫩茎段、叶片、幼穗老叶、发芽幼苗中的DNA；

(2)设计目标位点扩增引物，包括从全基因组重测序技术鉴定得到的大量SNP标记中选择本发明所特指的1253个SNP，使用Primer3软件设计扩增引物并使用ePCR软件检测引物，最后挑选出特异性检测每个SNP标记的引物对；

(3)多重PCR扩增和文库构建，包括将1253个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel，使用特异性引物扩增目标SNP标记，添加测序接头并完成二代测序文库的构建；

(4)质控与定量，包括采用实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质控和定量，为上机测序做准备；

(5)二代测序上机，包括在illumina测序仪上完成PE150高通量测序获得序列数据；

(6)生物信息分析，包括开发专门的生物信息学分析软件“GKPanel”，自动化分析数据，获取各样品所标记的各位点的基因型，指导客户进行育种选择。

本发明的有益效果为：

1.由于解决了之前全基因组分子标记，成本过高不能使用的问题，同时解决了不同客户需求的个性化问题，该产品可以用于种质资源的DNA指纹图谱；遗传相似度分析与杂种优势群的划分；基因/QTL初步定位；GWAS分析；全基因组分子标记辅助育种，解决重要经济性状形成与调控、经济作物对环境的响应机制及优质丰产生理基础等科学问题。

2.水稻1KSNP-Panel是高效育种技术体系，能够实现水稻分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国水稻育种效率，缩短育种周期，促进农业发展；通过水稻1KSNP-Panel开发方法的积累，相关技术还可以应用于其他粮食作物、蔬菜、水果、花卉、家畜、鱼类等的分子设计育种；满足不同物种的分子育种需求，加快优质品种的开发时间，满足人民对生活物质“量”和“质”的需求。

附图说明

图1为某实例中1253个SNP标记在水稻基因组上的分布情况示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的耗材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一，水稻基因组DNA的提取

1.选取水稻组织，优选幼嫩组织，包括干种子、新鲜叶片、幼穗老叶、幼苗或幼嫩茎段；

2.试剂配制：CTAB缓冲液，包括2％CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝8.0；洗涤缓冲液，包括76％乙醇，10mM乙酸铵；TE缓冲液，包括20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0；冰无水乙醇，将无水乙醇预先存放于-20℃，存放时间大于1小时。

2.使用CTAB法提取水稻组织中的DNA：将取自水稻的组织剪碎，并在液氮环境中研磨；加入与组织的量相当的预热CTAB，并迅速置于65℃水浴，水浴30min至1h，每隔5分钟摇动一次，其中，优选水浴1小时；4℃，12000rpm/min离心10min后，移出上清并加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀；4℃，12000rpm/min离心15min后，移出上清并加入两倍体积冰无水乙醇，于-20℃放置30min以上，优选为1h；4℃，12000rpm/min离心10min后，弃上清，沉淀经洗涤缓冲液洗涤后风干；加入50μL至100μL的TE缓冲液，充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测浓度和纯度；将检测后的DNA保存于-20℃。

实施例二，设计得到特定SNP标记的扩增引物。

1.SNP标记的选择，基于已报道的水稻基因组重测序数据和已报道的已克隆水稻重要功能基因，通过包括聚类和拼接在内的方法发掘出均匀分布于水稻基因组上的大量SNP标记，其中所述均匀分布于水稻基因组上的大量SNP标记的数量为1000或1000以上；

2.扩增引物设计，经过序列比对、分析和拼接后，将基因组数据转换为数据库文件后，使用Primer3进行扩增引物的批量设计，并使用NCBI–ePCR程序对SNP标记的扩增引物逐一测试，筛选只能扩增出含有SNP标记的单一条带，并将该SNP标记定位于模板所在染色体位点，最终得到本发明中1253个SNP标记的扩增引物对，该每一引物对仅对应一个SNP标记，且引物对与引物对之间无重复，参见表1；

3.扩增引物验证，随机选择10对引物合成，其中每对引物特异性扩增一个SNP标记，为一个引物对，然后通过实时荧光定量PCR扩增验证，包括以下步骤：

1)配制PCR反应体系，该体系为20μL体系，包括：2μL上述提取的水稻基因组DNA、2.5mMdNTP混合物、1μL引物对、2μL扩增缓冲液、0.6μLTaqDNA聚合酶、15mMMgCl

2)PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃，延伸5min；溶解曲线段；室温保持；

3)根据溶解曲线段Tm值确认引物验证结果。

实施例三，个体基因型的检测和分析。

1.多重PCR扩增，本发明涉及1253个SNP标记的扩增，将1253个SNP标记进行组合，构成一个基因Panel，使用该1253对SNP标记的扩增引物，对提取的水稻组织DNA的目标区域进行扩增；将扩增产物酶切后添加接头，回收和纯化后选择片段，最终完成二代测序文库的构建；

2.质控与定量，包括采用凝胶电泳、实时荧光定量PCR和Agilent 2100对构建好的文库进行质控和定量，为上机测序做准备；

3.在illumina测序仪上完成PE150测序获得序列数据。

4.使用“GKPanel”生物信息学软件进行分析，其中“GKPanel”为自主开发的软件，包括：内置水稻全基因组标准序列；原始数据中正向数据集和反向数据集分离模块；测序结果比对拼接模块；SNP标记基因分型模块；分析准确率验证模块。

实施例四，水稻1K SNP-Panel的育种应用。

由于水稻1K SNP-Panel选取了均匀分布于基因组上的1253个SNP标记，因此标记度高，可高程度解读水稻基因组，得到各样品的基因型，从而应用于遗传研究和育种的各个方面，为育种全过程提供支持。

1.在水稻育种过程中鉴定各项指标的表型中的应用；

水稻育种的核心是选择和组合合适的表型，包括但不限于：株高、叶夹角、开花时间、每株分蘖数、每穗粒数、粒重、抗病、耐逆。基因型与表型有显著关联，因此通过确定基因型可预测水稻表型，从而进行水稻的人工选择和培育。

2.在水稻种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

种质资源是育种的基础和前提，育种首先要对种质资源有初步认识。水稻1K SNP-Panel标记数目多，单次样本检测量大，具有较高的区分度，且可以很方便地对育种资源进行群体目标性状的筛选和鉴定；

水稻1K SNP-Panel可标记待改良植株表型，通过与表型有显著关联的基因标记对相关品种进行精确改良，且可实现多个优良性状的聚合。

功能基因鉴定最有效的方法是功能标记，基因功能标记来源于功能基因内部直接引起表型性状变异的多态性基因序列。使用水稻1K SNP-Panel对野生型和改良型植株进行标记，比对分析两者差异，从而获得优良植株的育种方法，为育种提供辅助。另一方面，通过水稻1K SNP-Panel辅助育种，在苗期即可进行基因型测定，大大缩短育种年限，提高育种选择效率。

3.在水稻分子设计育种中的应用；

使用水稻1K SNP-Panel分析优异品质的水稻植株基因，联合抗倒伏、抗稻瘟等基因，可用于植株各种性状的设计，以育成更加优质的水稻新品种。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。